Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Los autores quieren agradecer a todos en el laboratorio de LaBaer por su ayuda y crítica durante el desarrollo del proyecto. Este proyecto fue apoyado por la subvención NIH U01CA117374, U01AI077883 y Virginia G. Piper Foundation.

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Los autores no declaran conflictos de intereses.

Modificaciones y solución de problemas Durante la fase de optimización del estudio de la actividad quinasa en matrices NAPPA, una de las principales fuentes de fondo y bajo rango dinámico observado fue la BSA utilizada en la mezcla de impresión. BSA estaba proporcionando las aminas primarias necesarias para el reticulación con la superficie del aminosilano y estaba atrapando el ADN y el anticuerpo de captura en el acto. Sin embargo, BSA es altamente fosforilado, lo que dificulta la detección de la señal de autofosforilación en la matriz por encima del ruido de fondo. Para resolver este problema, se probaron varias alternativas para BSA en la mezcla de impresión, y la polilisina se identificó como un buen sustituto. La polilisina carece de cualquier sitio de fosforilación; por lo tanto, el fondo de las matrices no expresadas es muy mínimo. Además, los microarrays impresos con polilisina son reproducibles y muestran buenos niveles de proteínas(Figura 2).
La siguiente modificación crítica realizada en el ensayo estándar de NAPPA fue la adición de un paso de tratamiento de fosfatasa/DNase. El tratamiento de los microarrays con fosfatasa permite la eliminación de cualquier fosforilación que se haya producido en la mezcla de IVTT durante la síntesis y captura de proteínas(Figura 3). La fuente de esta fosforilación podría ser de la actividad intrínseca de autofosforilación o de la actividad de las quinasas presentes en la mezcla de IVTT. La eliminación de toda la fosforilación posterior a la expresión permitió una fácil identificación de las quinasas que están activas y pueden someterse a autofosforilación(Figura 3).
Pasos críticos dentro del protocolo NAPPA es una tecnología robusta, pero como era de esperar, hay varios pasos críticos. La primera es la adquisición de ADN de alta calidad en la concentración adecuada. El uso de ADN de mala calidad o en bajas concentraciones generará microarrays de mala calidad con varias características que no se expresan y se muestran en los niveles adecuados, disminuyendo el número de proteínas analizadas en la matriz. El segundo paso crítico es la expresión de proteínas en el microarray. El uso de un sistema IVTT que expresará altos niveles de proteína funcional es vital para estudiar la actividad de la quinasa en la matriz.
El siguiente paso crítico en el cribado TKI es cómo se manejan los microarrays. Los microarrays no deben secarse durante ningún paso del protocolo, y se recomienda un manejo suave para evitar arañazos que puedan aumentar la señal de fondo. Dado que las matrices de todo el experimento se compararán entre sí, es importante asegurarse de que cada paso de incubación está incluso en todas las diapositivas. Por ejemplo, el tiempo necesario para realizar un paso en una sola matriz debe tenerse en cuenta cuando se procesa un lote de 20 matrices para evitar diferencias en la longitud de la incubación entre matrices.
Por último, el diseño del experimento y la inclusión de controles positivos y negativos son fundamentales para el control de calidad y el análisis de datos. El primer conjunto de controles son los impresos en cada matriz e incluye controles negativos [es decir, puntos vacíos (sin ningún material impreso), agua o vector vacío (expresar sólo la etiqueta)], así como un control positivo (es decir, IgG purificado, que es detectado por el anticuerpos secundarios y es inerte a la alteración en los niveles de fosforilación). Colectivamente, miden los niveles de fondo del microarray, el posible arrastre durante la impresión y la intensidad de la señal del método de detección.
El siguiente conjunto de controles son los controles de detección de drogas e incluyen los microarrays defosforilados y autofosforilados (en presencia o ausencia de DMSO). Como se mencionó anteriormente, el microarray defosforilado mide el nivel de fosforilación después del tratamiento con fosfatasa y, por lo tanto, el nivel basal para todos los demás experimentos. Cuanto menor sea el nivel de línea base, mayor será el rango dinámico de los ensayos. Las matrices autofosforiladas presentan los niveles máximos de fosforilación de todas las matrices y la señal debe ser fuerte y clara. Se utiliza para el análisis de datos, pero también como un control de que todas las reacciones se realizaron correctamente en la matriz.
Limitaciones de la técnica A partir de ahora, una de las limitaciones del cribado de drogas presentado aquí es su capacidad para examinar sólo las quinasas proteicas que se pueden autofosforilar. Una forma posible de superar esto es imprimir una quinasa y un sustrato conocido en el mismo lugar. La coimpresión de ADN para dos proteínas distintas se logró con éxito15,lo que sugiere la viabilidad de este enfoque. Además, es posible que la proteína mostrada en la matriz no se doble correctamente, lo que resulta en una proteína inactiva. El uso del sistema de expresión basado en humanos hizo una mejora significativa en la actividad quinasa medida en la matriz; sin embargo, algunas proteínas todavía no se pueden analizar en la matriz debido a su inactividad.
Una segunda limitación es la medición de la fosforilación utilizando un anticuerpo pan anti-fosfo-tyr. A pesar de su inespecificidad con respecto al motivo del sitio de fosforilación, todas las fosforilaciones medidas ocurrieron en residuos de tirosina, dejando atrás serinas y trioninas y sus respectivas quinasas. Hasta la fecha, más de 10 anticuerpos pan fosfo-Ser/Thr han sido probados sin éxito, a pesar de varios intentos de optimizar las condiciones de incubación y lavado. Un nuevo sistema de detección que es independiente de los anticuerpos puede ser la mejor opción para ampliar el número de quinasas proteicas que se pueden analizar para la inhibición de los fármacos. En este contexto, algunas opciones están disponibles, incluyendo la radiactividad o enfoques químicos como la conjugación de clics. Se requiere una serie de optimizaciones para minimizar la señal de fondo y proporcionar un buen rango dinámico para los ensayos.
La tercera limitación es la adquisición de clones cDNA que se imprimirán en la matriz. Los clones de ADNc se pueden generar utilizando cualquier técnica de clonación, incluidos los sistemas de recombinación específicos del sitio, como Creator o Gateway23. Otra opción es comprar los clones de la biblioteca DNAsu, que se encuentran en <https://dnasu.org/DNASU/Home.do>, donde más de 17.000 clones de cDNAs, incluyendo todo el kinome humano, está fácilmente disponible para ser utilizado para la construcción de matrices NAPPA24 .
La cuarta limitación es que no todos los laboratorios están equipados con equipos adecuados para fabricar y examinar sus propios arreglos NAPPA. Este protocolo proporciona métodos alternativos para generar el ADN que se imprimirá en el microarray, sin necesidad de equipos de alto rendimiento, y protocolos para realizar manualmente todos los pasos de hibridación. Sin embargo, el acceso a un escáner de arreglos de discos y microarray sigue siendo necesario. Una opción para superar este problema es utilizar el servicio básico y la instalación de NAPPA, que se encuentra en <http://nappaproteinarray.org/>, que distribuye microarrays NAPPA personalizados a un precio académico sin fines de lucro. Por último, a partir de cualquier metodología de cribado, los datos obtenidos en los arrays son susceptibles de ser artefactos (positivos o negativos) y por lo tanto deben ser validados mediante ensayos ortogonales.
Importancia con respecto a los métodos existentes Varias plataformas están disponibles comercialmente para el cribado de quinasas proteicas. Un enfoque utilizado rutinariamente son los ensayos de unión, que se pueden realizar con fragmentos de proteínas, dominio de quinasa, fragmentos de proteínas más grandes con el dominio de la quinasa y algunas regiones reguladoras, e incluso proteínas de longitud completa. Las proteínas se expresan generalmente en sistemas bacterianos debido al costo y simplicidad en los protocolos de expresión y purificación. La interacción entre el fármaco de interés y la proteína se mide con algún tipo de ensayo de informe como fluorescencia o presencia de etiquetas, por ejemplo. La principal limitación de este conjunto de enfoques es el hecho de que la proteína no es necesariamente activa durante la interacción con el fármaco, lo que puede resultar en la identificación de interacciones falsas positivas y falsas negativas. Los fragmentos de proteínason son particularmente vulnerables a los cambios en la conformación y la falta de actividad y todos los datos obtenidos deben ser validados utilizando proteínas activas, preferiblemente en su forma de longitud completa. Otra limitación de algunas de las plataformas es la capacidad de examinar solo los análogos de ATP, limitando su uso general.
La mayoría de los servicios disponibles comercialmente para la detección de TKI utilizando enfoques basados en enzimáticos utilizan sólo versiones de tipo salvaje de la quinasa de interés, y a veces sólo unos pocos mutantes seleccionados. Sabiendo que la resistencia a los medicamentos es muy común en pacientes tratados con TKI, es importante poder medir la respuesta farmacológica en diferentes mutantes, para la selección del inhibidor más adecuado. Debido a la naturaleza de NAPPA, la detección de mutantes quinasa es simple y se puede lograr fácilmente, y la única herramienta necesaria es la incorporación del mutante quinasa en la colección NAPPA cDNA, que se puede hacer por mutagénesis específica del sitio, por ejemplo.
Aplicaciones futuras Una de las formas más comunes de tratamiento que transcurren en la terapia oncológica utilizando inhibidores de la quinasa es la adquisición de mutaciones en el objetivo del fármaco durante un curso de tratamiento. El cribado de estos mutantes con respecto a su respuesta a los inhibidores de la quinasa es de vital importancia para la selección de la segunda/tercera generación de TKI para lograr un tratamiento personalizado para cada paciente. El enfoque de detección de drogas presentado aquí, proporciona una plataforma de detección imparcial en la que cualquier inhibidor de la tirosina quinasa puede ser probado contra un panel de tirosina quinasas presente en el genoma humano. Dado que las proteínas mostradas en las matrices NAPPA se expresan in vitro desde el ADNc impreso en la diapositiva, cualquier variante mutante se puede incorporar fácilmente en la colección de ADNc para mostrarse en la matriz. La instalación en la que los mutantes de la quinasa pueden ser generados y expresados en el arreglo de discos, combinado con el alto poder de alto rendimiento de la técnica NAPPA, proporciona un entorno único para el estudio de los mutantes quinasa y su respuesta a las drogas, haciendo que NAPPA sea adecuado para examen de drogas personalizado, uno de los objetivos de la medicina de precisión.

Las quinasas proteicas son responsables de la fosforilación de sus objetivos y pueden modular vías moleculares complejas que controlan muchas funciones celulares (es decir, proliferación celular, diferenciación, muerte celular y supervivencia). La desregulación de la actividad quinasa se asocia con más de 400 enfermedades, lo que convierte a los inhibidores de la quinasa en una de las principales clases de fármacos disponibles para el tratamiento de varias enfermedades, como el cáncer, los trastornos cardiovasculares y neurológicos, así como los trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes1,2,3.
Con la llegada de la medicina de precisión, la identificación de nuevas terapias, especialmente inhibidores de la quinasa, tienen un gran atractivo farmacéutico y clínico. Se pueden utilizar varios enfoques para la identificación de posibles nuevos pares de inhibidores de la quinasa/quinasa, incluido el diseño de novo de inhibidores de la quinasa y la identificación de nuevos objetivos para los medicamentos aprobados por la FDA existentes. Este último es especialmente atractivo, ya que el tiempo y el dinero necesarios para implementar estos medicamentos en las clínicas se reducen drásticamente debido a la disponibilidad de datos de ensayos clínicos anteriores. Un ejemplo canónico de la reasignación de un inhibidor de la quinasa es imatinib, inicialmente diseñado para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica (LMC) a través de la inhibición de BCR-Abl, que también se puede utilizar con éxito para el tratamiento de la sobreexpresión de c-Kit tumores estromales gastrointestinales (GIST)4,5,6,7.
El cribado de inhibidores de la quinasa se puede realizar en ensayos de unión o ensayos basados en enzimáticos. La primera clase de ensayos se centra en las interacciones proteína-drogas y puede proporcionar información como el sitio de ligadura y la afinidad. Dado que se desconoce la actividad de la quinasa en el momento de estos ensayos, una serie de interacciones pueden perderse o identificarse falsamente debido a cambios de conformación en la proteína. Por otro lado, los ensayos a base de enzimáticos requieren que las quinasas proteicas estén activas y proporcionen información valiosa sobre el efecto del inhibidor en la actividad enzimática, sin embargo, este tipo de cribado suele ser más lento y costoso. Actualmente, ambos tipos de ensayos están disponibles comercialmente de varias fuentes. Representan una opción confiable para el cribado de inhibidores de la quinasa con algunas limitaciones, incluyendo: I) la mayoría de los métodos implican pruebas de múltiples quinasas individualmente, lo que puede hacer que el cribado de un gran conjunto de proteínas sea costoso; II) el conjunto de quinasas que se probarán se limita a una lista de quinasas preseleccionadas de tipo salvaje y varias versiones mutadas bien conocidas de algunas quinasas, lo que dificulta la prueba de muchas nuevas isoformas mutadas.
En este contexto, los microarrays proteicos son una potente plataforma capaz de superar algunas de las limitaciones que presentan las técnicas disponibles comercialmente. Es adecuado para realizar ensayos basados en enzimáticos en cribado de alto rendimiento utilizando proteínas activas de longitud completa de cualquier secuencia de interés. Los microarrays pueden ser generados por un enfoque autoensamblado como NAPPA (matriz de proteínas programables de ácido nucleico), en el que las proteínas se expresan justo a tiempo para los ensayos, aumentando la probabilidad de que los que se muestran en la matriz estén activos. Las proteínas que se muestran en NAPPA se producen utilizando ribosomas derivados del ser humano y proteínas de chaperona con el fin de mejorar la probabilidad de plegado natural y actividad.
Las proteínas se programan inicialmente imprimiendo cDNAs codificando para genes de interés fusionados con una etiqueta de captura, junto con un agente de captura, en la superficie del microarray. Las proteínas se producen en los microarrays utilizando un sistema de transcripción y traducción in vitro (IVTT), y las proteínas recién expresadas son inmovilizadas en la superficie del microarray por el agente de captura. Los arrays NAPPA expresados se pueden utilizar para el estudio de las proteínas mostradas en la matriz de una manera imparcial y de alto rendimiento8,9.
Anteriormente, se demostró que las proteínas mostradas en las matrices NAPPA se doblaban correctamente para interactuar con socios conocidos10; Además, su actividad enzimática se explotó por primera vez en 2018, cuando se demostró que las quinasas proteicas se mostraban en el autofosforilato de microarray11. Hasta la fecha, la metodología NAPPA se ha utilizado para muchas aplicaciones distintas, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores12,13,14,15,16,17, interacciones proteína-proteína10,18, identificación de sustrato19,y detección de fármacos11. Su flexibilidad es una de las características clave de la plataforma que permite la adaptación a cada aplicación.
Aquí, se presenta un protocolo para el cribado de inhibidores de la tirosina quinasa en matrices NAPPA autoensambladas. La plataforma está optimizada para la visualización de quinasas de proteínas humanas activas y para el análisis de la actividad proteica quinasa, con bajo fondo y alto rango dinámico. Entre las modificaciones implementadas para utilizar NAPPA para el cribado de inhibidores de la quinasa se incluyen: I) cambios en la química de impresión, II) desfosforilación del microarray proteico antes del cribado del inhibidor de la quinasa, y III) optimización de la detección de la detección de la detección de proteínas fosforiladas en la matriz. Este protocolo es el primero de su tipo y proporciona información única sobre el estudio de la quinasa en microarrays NAPPA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

El cribado de inhibidores de la quinasa es crucial para una mejor comprensión de las propiedades de un medicamento y para la identificación de objetivos potencialmente nuevos con implicaciones clínicas. Se han reportado varias metodologías para llevar a cabo este tipo de pruebas. Sin embargo, cada uno tiene sus propias limitaciones (por ejemplo, el cribado de sólo análogos de ATP, restricción al uso de dominios de quinasa purificados, costos significativos asociados con las pruebas de más de unas pocas quinasas a la vez, y la falta de flexibilidad en el cribado de quinasas de proteínas con mutaciones novedosas). Aquí, se presenta un nuevo protocolo que supera algunas de estas limitaciones y se puede utilizar para el cribado imparcial de inhibidores de la quinasa. Una fuerza de este método es su capacidad para comparar la actividad de los inhibidores de la quinasa a través de múltiples proteínas, ya sea entre diferentes quinasas o diferentes variantes de la misma quinasa. Se emplean microarrays proteicos autoensamblados generados a través de la expresión de quinasas proteicas por un sistema de transcripción y traducción in vitro basado en humanos (IVTT). Las proteínas que se muestran en el microarray están activas, lo que permite medir los efectos de los inhibidores de la quinasa. El siguiente procedimiento describe los pasos del protocolo en detalle, desde la generación y el cribado de microarrays hasta el análisis de datos.

Los microarrays NAPPA autoensamblados proporcionan una plataforma sólida que se puede utilizar para muchas aplicaciones distintas, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores, interacciones proteína-proteína, identificación de sustratos y detección de fármacos10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
La metodología general adoptada para el estudio de la actividad quinasa y el cribado de inhibidores de las quinasas tirosina en microarrays NAPPA se representa esquemáticamente en la Figura 1. En primer lugar, los microarrays NAPPA son generados por la inmovilización del ADNc y el agente de captura en los microarrays recubiertos. Los CDNAs se utilizan entonces como plantilla para la transcripción y traducción de proteínas, utilizando un sistema IVTT basado en humanos, y las proteínas recién sintetizadas son inmovilizadas por el agente de captura9. La calidad del microarray impreso puede ser monitoreada midiendo los niveles de ADN (confirmando la impresión consistente) o la proteína mostrada en la matriz (confirmando la expresión y captura de proteínas; Figura 1). Para disminuir la señal de fondo y aumentar el rango dinámico del experimento, los microarrays se tratan con 1) fosfatasa lambda para eliminar la fosforilación de los residuos de Ser/Thr/Tyr, luego con 2) DNase para simplificar la química en el acto y disminuir fondo(Figura 1).
El siguiente paso es la reacción de autofosforilación, en la que los microarrays se incuban con tampón de quinasa en ausencia de ATP (matriz de control negativo, denominada microarrays desfosforilados), y el búfer de quinasa se complementa con ATP (control positivo, conocidos como matrices autofosforiladas) o ATP + DMSO (control del vehículo). Cabe destacar que durante este paso, no se añade quinasa; por lo tanto, la actividad intrínseca de cada quinasa mostrada en el microarray se cuantifica mediante la medición de sus niveles de fosforilación utilizando un anticuerpo pan antifosfo-tirosina seguido de un anticuerpo secundario con cy3 labbeled(Figura 1).
El control de calidad de las matrices NAPPA-quinasa que muestran un panel de quinasas de proteínas humanas impresa en cuadruplicado se muestra en la Figura 2. Los niveles de ADN inmovilizado se midieron por tinción de ADN y mostraron una señal uniforme a través del microarray, lo que sugiere que la cantidad de ADN impreso en la matriz era uniforme. También es posible observar varias características sin ninguna tinción de ADN. Estas características corresponden a algunos controles en los que se omitió el ADN de la mezcla de impresión [es decir, puntos vacíos (no se imprimió nada), manchas de agua, punto IgG purificado (polilisina, retidóntra e IgG purificado), mezcla de impresión solamente (mezcla de impresión completa: polilisina: polilisina además de retiquete y anticuerpo anti-bandera, sin ADN)]. Los niveles de proteína mostrados en los microarrays NAPPA-quinasa se evaluaron después de la reacción IVTT utilizando anticuerpos anti-etiqueta.
Para el cribado de quinasa, Flag se utilizó como la etiqueta de elección y el nivel de proteína que se muestra en el microarray se midió utilizando un anticuerpo anti-bandera. Como se muestra, la mayoría de las manchas que contienen ADNc mostraron con éxito niveles detectables de proteína. Algunos de los puntos de control sin ADNc también revelaron señal con el anticuerpo anti-bandera: punto IgG (utilizado para detectar la actividad del anticuerpo secundario) y puntos vectoriales vacíos (códigos de ADNc para la etiqueta solamente) (Figura 2). Los microarrays NAPPA-quinasa mostraron una buena reproducibilidad entre las diapositivas, con la correlación de los niveles de visualización de proteínas entre lotes de impresión distintos superiores a 0,88 (Figura 2). Dentro del mismo lote la correlación era aún mayor, cerca de 0.92 (datos no mostrados).
A continuación, la actividad de autofosforilación quinasa de las proteínas mostradas en la matriz se midió utilizando anticuerpos antifosfo-tirosina(Figura 3). La proteína mostrada en la matriz mostró altos niveles de fosforilación proteica después de la expresión(Figura 3, izquierda), que pueden ser causadas por la actividad quinasa intrínseca de la proteína mostrada en la matriz o por quinasas activas presentes en la mezcla de IVTT. Esta fosforilación se eliminó por completo con el tratamiento de la fosfatasa lambda y estos microarrays se utilizaron para los ensayos de quinasa. Después de la defosforilación, las reacciones de autofosforilación realizadas sin ATP no mostraron niveles significativos de fosforilación, como se esperaba, mientras que los microarrays incubados con tampón de quinasa en presencia de ATP mostraron fosforilación proteica tan rápido como 15 min ( Figura 3). Para el cribado de drogas, la actividad de la quinasa se midió después de 60 minutos de reacción de autofosforilación para maximizar el número de quinasas probadas.
La comparación entre microarrays en los que los niveles de fosforilación se midieron justo después de la expresión proteica(Figura 3, izquierda) y después de 60 min de reacción de autofosforilación(Figura 3, derecha) mostró: i) proteínas fosforiladas solamente después de la expresión, lo que sugiere que pueden ser fosforilados exógenamente por proteínas presentes en la mezcla DE IVTT, pero no pueden ser autofosforilados; ii) proteína fosforilada sólo después de la reacción de autofosforilación, lo que sugiere que estas proteínas no estaban activas después de la expresión de proteínas y los cofactores requeridos presentes en el tampón de quinasa para estar activos; o iii) proteína fosforilada en ambas matrices, lo que sugiere que estaban activas en ambos ajustes(Figura 3).
Como ejemplo de los resultados obtenidos para el cribado de inhibidores de la tirosina quinasa en matrices NAPPA-quinasa se utilizaron tres inhibidores de quinasas con selectividad distinta entre las quinasas proteicas: estaurosporina, imatinib e ibrutinib. Para todos los cribados, se incubaron microarrays NAPPA defosforilados con concentraciones crecientes de TKI (que van desde 100 nM a 10 uM) durante la reacción de autofosforilación. El primer TKI probado fue la estaurosporina, un inhibidor de la proteína quinasa global, que mostró una potente inhibición de la quinasa en el microarray en prácticamente todas las quinasas probadas11.
A continuación, se probó imatinib, un inhibidor de ABL y c-Kit utilizado para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica y tumores estromales gastrointestinales4,5,6,7. En los arrays nAPPA-quinasa imatinib mostraron una reducción significativa en la actividad de Abl1 y BCR-Abl1, mientras que otras quinasas no se vieron afectadas en sumayoría (Figura 4A). La cuantificación de datos para la actividad de la quinasa se normalizó con respecto a la matriz defosforilada y se representó como un porcentaje del microarray de control positivo (solo vehículo). Los datos de TNK2 (quinasa no relevante), Abl1 y BCR-Abl1 se muestran en la Figura 4B. Como era de esperar, imatinib mostró inhibición selectiva hacia Abl1 y BCR-ABl1. Los datos de c-Kit no eran concluyentes debido a la falta de actividad en las matrices de control positivo.
Finalmente, ibrutinib, un inhibidor covalente aprobado por la FDA de la tirosina quinasa de Bruton (BTK), fue probado. Ibrutinib se utiliza actualmente en el tratamiento de varios cánceres relacionados con la sangre con BTK hiperactivo, incluyendo la leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células del manto, y macroglobulinemia de Waldenstrom21,22. Figura 4C, es representativa de los resultados típicos obtenidos para el cribado de ibrutinib. La actividad quinasa de ABL1 (quinasa no relevante) y BTK (objetivo canónico) y ERBB4 (posible nuevo objetivo) se muestra en la Figura 4D. Los datos sugieren que ERBB4 puede ser inhibido por ibrutinib de una manera específica de dosis. Esta inhibición se confirmó in vitro y en ensayos basados en células11,demostrando el poder de esta plataforma.
En conjunto, los datos sugieren que la plataforma de microarray NAPPA-quinasa podría utilizarse para el cribado imparcial de inhibidores de los CCT. Además, el cribado es rápido y se puede personalizar fácilmente para incluir cualquier variación de las quinasas proteicas de interés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del control de calidad y cribado de inhibidores de la tirosina quinasa en matrices NAPPA. Las matrices NAPPA se imprimen con codificación cDNA para la proteína de interés fusionada con una etiqueta y un anticuerpo de captura. Durante la transcripción in vitro y la reacción de traducción (IVTT) las proteínas sintetizadas se capturan en la superficie del microarray a través de la etiqueta por el anticuerpo de captura. El control de calidad (QC) de las matrices se realiza mediante la medición de los niveles de ADN impresos en la diapositiva, utilizando un tinte fluorescente intercalante de ADN, y los niveles de proteína que se muestran en la matriz utilizando anticuerpos específicos de la etiqueta. Para el cribado de quinasa, los microarrays se tratan con DNase y fosfatasa, después de la reacción IVTT, para eliminar el ADN impreso y toda la fosforilación que puede haber ocurrido durante la síntesis de proteínas. Las matrices defosforiladas ya están listas para ser utilizadas para la pantalla de drogas. Para cada ensayo, se utilizan rutinariamente tres conjuntos de controles: (I) matrices desfosforiladas, en las que la reacción de autofosforilación se realiza sin ATP; (II) microarrays autofosforilados, en los que la reacción de autofosforilación se realiza en presencia de ATP; y (III) Matriz tratada CON DMSO (vehículo), en la que la reacción de autofosforilación se realiza con ATP y DMSO. Las diapositivas tratadas con diferente concentración de inhibidores de la quinasa siguen exactamente el mismo protocolo utilizado para las matrices tratadas con DMSO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> Figura 2: Resultados representativos del control de calidad para matrices NAPPA-quinasa autoensambladas. Se muestra el contenido de ADN medido por un tinte fluorescente intercalante de ADN (izquierda) y los niveles de proteína que se muestran en el microarray medido por anticuerpos anti-Flag (medio). En el lado derecho hay una gráfica de correlación de los niveles de proteína que se muestran en dos matrices NAPPA-quinasa impresas en lotes separados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> Figura 3: Resultados representativos de la actividad quinasa en matrices NAPPA-quinasa. Los microarrays que muestran quinasas de proteínas en cuadruplicado se utilizaron para estudiar la actividad de la proteína quinasa en la matriz a través de la medición de la fosforilación proteica utilizando anticuerpos anti-pTyr, seguido de anticuerpoantido con etiqueta cy3. Se utilizaron matrices de control sin tratamiento con fosfatasa/DNase y sin ATP durante la reacción de autofosforilación para medir la fosforilación de fondo después de la expresión de proteína (post-expresión). Los microarrays restantes fueron tratados con fosfatasa/ADN, y la reacción de autofosforilación se realizó sin ATP (microarray defosforilado, control negativo) o con ATP (microarrays autofosforilados). Para los microarrays autofosforilados, la reacción de autofosforilación se realizó durante 15 min, 30 min, 45 min o 60 min, como se muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> Figura 4: Datos representativos de la pantalla de tirosina quinasa en matrices NAPPA-quinasa. (A) Las matrices de NAPPA-quinasa tratadas con fosfatasa/DNasa se incubaron en concentraciones crecientes de imatinib durante la reacción de autofosforilación y la actividad de la quinasa se medió con anticuerpos antifosfofostiros. (B) Cuantificación de la actividad quinasa observada en matrices NAPPA-quinasa expuestas a imatinib. Los datos se normalizaron contra la señal de las matrices de control negativas (desfosforiladas) y se muestran como un porcentaje de las matrices de control positivas (reacción de autofosporilación realizada en presencia de DMSO). Se muestran datos similares para el cribado de ibrutinib (C,D). Esta cifra ha sido modificada de Rauf et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo Suplementario 1. Protocolo alternativo para el cribado de inhibidores de la tirosina quinasa en matrices NAPPA utilizando una estación de hibridación automatizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Se presenta un protocolo detallado para la generación de microarrays de proteínas humanas autoensamblados para el cribado de inhibidores de la quinasa.

Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA es una potente plataforma de microarray proteico que se puede utilizar para el estudio de la actividad de las proteínas y la función de una manera imparcial de alto rendimiento. Las proteínas mostradas en NAPPA se producen en un sistema de expresión basado en humanos utilizando ribosomas y chaperones derivados humanos con el fin de mejorar la probabilidad de plegado natural y actividad. El uso de matrices NAPPA para el cribado de inhibidores de la quinasa proporciona una nueva plataforma para la prueba de nuevos fármacos y mutaciones de quinasa clínicamente relevantes.Los microarrays proteicos generados por la metodología NAPPA se pueden utilizar para muchas aplicaciones distintas, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores, las interacciones proteína-proteína, la identificación de sustratos y la detección de fármacos. Realice pasos de control de calidad en el camino. Pruebe la calidad de su preparación de ADN, el microarray de ADN y el microarray proteico.Si en cualquier paso la calidad no es buena, simplemente empezar de nuevo. Demostrando el procedimiento estará Lisa Miller, una técnico de mi laboratorio. Para preparar el crecimiento bacteriano para la mini-preparación de alto rendimiento en la casa, primero inocular las bacterias en la placa de barrena en un formato de 96 pozos, y dejar que crezca durante 16 horas.Al día siguiente, llenar cada pozo de la placa de pozo profundo con 1,5 mililitros de excelente medio de caldo, complementado con ampicilina de anticuerpos. El anticuerpo depende del marcador de selección del plásmido. A continuación, esteriliza un dispositivo de 96 pines con 80% de etanol y llama.Utilice el dispositivo estéril de 96 pines para recoger colonias de la placa de agar incubada durante la noche y sumergirse en los pozos de la placa de pozos profundos para inocular el cultivo. Cubra el bloque con un sello permeable al gas e incubar una coctelera durante 22 a 24 horas a 37 grados centígrados y 300 a 800 rpm. Después de eso, los cultivos de pellets y resuspend las culturas según el manuscrito.Lyse bacterias mediante la adición de 200 microlitros de solución dos en cada pozo, sellar la placa con un sello de aluminio, e invertir cinco veces. Incubar las células durante exactamente cinco minutos. Para neutralizar la solución, agregue 200 microlitros de solución tres, selle la placa con un sello de aluminio e invierta cinco veces.Luego, gire la placa a 3800 G, cuatro grados Celsius, durante 30 minutos para limpiar el sobrenadante de izado. Para preparar las placas de resina de intercambio de anión, primero, mezcle la suspensión de intercambio de aniones y vierta la lodo en una cubeta de vidrio. Apilar placas de filtro en la parte superior de una placa de pozo profundo para actuar como un recipiente de recogida de residuos.A continuación, utilizando puntas P1000 de placa ancha, mezcle la suspensión y transfiera 450 microlitros de la suspensión a cada pozo de las placas de filtro. Centrifugar y desechar el flujo a través. Ahora, transfiera los sobrenadantes de izado a la pila de placa de resina y bloque de pozo profundo.Gire las placas apiladas durante cinco minutos a 30 veces G con la velocidad de aumento más lenta y deseche el flujo a través. Para lavar la columna, agregue 400 microlitros de solución N3 tampón de lavado a cada pozo. Transfiera la placa de resina al colector de vacío para quitar el tampón de lavado.Repita el paso de lavado tres veces y luego retire cualquier tampón de arandela restante con un breve giro de cinco minutos a 30 veces G.To eluir el ADN, coloque la placa de resina en una placa de recolección limpia de 800 microlitrotros. Añadir 300 microlitros de solución N5 a cada pozo y dejar reposar a temperatura ambiente durante diez minutos. Luego, gire las placas apiladas durante cinco minutos a 20 veces G con una velocidad de aumento lenta a 233 veces G durante un minuto.Almacene las placas a 20 grados centígrados negativos antes de su uso. En primer lugar, coloque los portaobjetos en un bastidor y sumerja los portaobjetos en un depósito de vidrio que contenga la solución de recubrimiento de 2%reactivo de aminosilano en acetona. Mece los toboganes durante 15 minutos.A continuación, enjuague los portaobjetos en acetona seguido de un enjuague final en agua. A continuación, seque los portaobjetos con aire a presión. Soplando sobre ellos desde todos los ángulos durante unos tres minutos hasta que se hayan eliminado todas las gotas de agua.Guarde los portaobjetos recubiertos a temperatura ambiente en un estante metálico dentro de una caja herméticamente sellada. Ahora, proceda a precipitar el ADN como se describe en el manuscrito. Luego, resuspender el pellet de ADN en 20 microlitros de agua ultrapura y agitar a 1000 rpm durante dos horas.Para preparar la muestra de matriz, agregue 10 microlitros de mezcla de impresión recién preparada que contenga el anticuerpo, el reticulante y la poli lisina a cada muestra de ADN. Selle las placas con papel de aluminio y agite a temperatura ambiente durante 90 minutos a 1000 rpm. Guarde las placas durante la noche a cuatro grados centígrados.El día de la impresión, vórtice brevemente y gire las placas. Transfiera 28 microlitros de cada muestra a una placa de 384 pozos. Coloque los portaobjetos recubiertos de aminosilano y la placa de pozo 384, en la cubierta del arrayer, e inicie el programa de impresión de microarray.Una vez realizada la impresión, etiquete las microarrays. Las microarrays se pueden almacenar durante meses hasta su uso posterior. Para medir los niveles de ADN, coloque las diapositivas en una caja de pipetas y bloquee con 50 mililitros de tampón de bloqueo.Incubar los portaobjetos en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, deseche la solución y añada 20 mililitros de tampón de bloqueo y 33 microlitros de colorante fluorescente de ADN intercalado. Incubar durante 15 minutos con agitación.Una vez finalizada la incubación, enjuague rápidamente los portaobjetos con agua ultra pura y séquelos con aire a presión. Los microarrays están listos para ser escaneados. Para expresar los microarrays, bloquee los portaobjetos como se muestra anteriormente y luego enjuáguelos con agua ultra pura, y séquelos con aire comprimido filtrado.Fije una junta de sellado a cada diapositiva. Añadir 130 mililitros de transcripción in vitro y mezcla de traducción en los portaobjetos, y masajear suavemente las juntas de sellado para que la transcripción in vitro y la mezcla de traducción se extiendan y cubra toda el área de la matriz sin ninguna burbuja. Aplique los sellos de puerto redondo pequeños a ambos puertos.Incubar durante 90 minutos a 30 grados Celsius para la expresión de proteínas, seguido de 30 minutos a 15 grados Celsius para la inmovilización de la proteína de consulta. A continuación, retire la junta, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno en 15 mililitros TBST con leche y bloquee la misma solución durante una hora. Para la detección de las proteínas en la matriz, retire el TBST con leche, coloque los portaobjetos en una placa de rejilla y aplique 600 microlitros de anticuerpo primario, anti-bandera del ratón, diluido de uno a doscientos, y 1x TBST complementado con 5% de leche.Incubar durante una hora a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos con 50 mililitros de 1x TBST y 5% de leche en la coctelera mecedora tres veces durante cinco minutos cada una. Repita el procedimiento para el anticuerpo secundario.Después de que termine la incubación de una hora, lave los portaobjetos con 1x TBST en la coctelera mecedora tres veces durante cinco minutos cada una. A continuación, enjuague rápidamente los portaobjetos con agua ultra pura y séquelos con aire a presión. Las diapositivas están listas para ser escaneadas.Para realizar el tratamiento de fosfatasa y DNase, lave y bloquee las diapositivas expresadas con TBST complementadas con 3%BSA como se describe en el manuscrito. A continuación, coloque las diapositivas en una placa de rejilla y aplique 200 microlitros de solución de DNase fosfatasa. Coloque un resbalón de la cubierta de microarray en la parte superior para evitar la evaporación.Incubar a 30 grados centígrados durante una hora y 30 minutos en el horno. A continuación, lave los portaobjetos con 1x TBST y 0,2 molares de cloruro sódico en el agitador de balanceo tres veces durante cinco minutos cada uno. Para realizar el tratamiento farmacológico y la reacción quinasa, coloque los portaobjetos en la placa de la red y aplique 200 microlitros de solución de quinasa de fármaco.Coloque un resbalón de cubierta en la parte superior para evitar la evaporación. Incubar durante una hora a 30 grados centígrados en el horno. La clave de los datos reproducibles es el tiempo de incubación coherente en todas las diapositivas.Esto es especialmente importante durante la reacción quinasa. Se debe tener en cuenta el tiempo necesario para procesar cada diapositiva. Después de eso, lave los portaobjetos con 1x TBST y 0,2 molar de cloruro sódico en el agitador de balanceo tres veces durante cinco minutos cada uno.Repetir la detección de proteínas utilizando como anticuerpo primario anticuerpo fosfotirosina anticuerpo diluido de uno a 100 en TBST, complementado con 3%búptarica sérica bovina. Utilice 1x TBST y 3%búbrica de suero bovino para lavar después de la incubación con anticuerpos primarios, y TBST para lavados después de incubaciones con anticuerpos secundarios. Lavar y secar como antes.Para la adquisición de imágenes, cargue las microarrays en el cargador del portaobjetos. Cargue el cargador en el escáner de microarray. Escanee todas las microarrays con la configuración optimizada y recuerde desactivar la ganancia automática al comparar imágenes entre experimentos.Transfiera las imágenes a un software de cuantificación, alinee la cuadrícula con los puntos y cuantifique la intensidad de la señal de cada entidad en el microarray. Continúe con el análisis estadístico. En este estudio, el microarray mostró que la mayoría de las manchas que contenían ADN complementario mostraban con éxito niveles detectables de proteína.Los microarrays de quinasa NAPPA mostraron una buena reproducibilidad entre los portaobjetos, con la correlación de los niveles de visualización de proteínas entre lotes de impresión distintos superiores a 0,88. Los resultados representativos de la actividad quinasa en matrices de quinasa de NAPPA mostraron altos niveles de fosforilación proteica después de la expresión. La comparación entre microarrays en los que se midieron los niveles de fosforilación justo después del tratamiento con fosfatasa, y después de 60 minutos de reacción de autofosforilación, sugiere la presencia de quinasas proteicas activas en la matriz.En los arreglos de mezclas de quinasas NAPPA, imatinib mostró una reducción significativa en la actividad de ABL1 y BCR-ABL1, mientras que otras quinasas no se veron afectadas en su mayoría. La actividad quinasa se normalizó contra la matriz desfosforilada y representó como un porcentaje de la microarray de control positivo mostró inhibición selectiva de imatinib hacia ABL1 y BCR-ABL1. Los resultados típicos obtenidos para el cribado de ibrutinib mostraron que la actividad quinasa de ABL1 no es relevante no se ve afectada.BtK objetivo canónico, y ERBB4 potencial nuevo objetivo, Mostró una menor actividad en presencia de ibrutinib. Los datos sugieren que ERBB4 puede ser inhibido por ibrutinib de una manera específica de la dosis. El éxito de los cribados de microarrays proteicos depende en gran medida de la calidad de la microarray en sí.Se deben utilizar varias características de control positivas y negativas para permitir el análisis de datos adecuado. El ensayo de quinasa NAPPA es una plataforma de cribado y, como tal, los datos obtenidos deben validarse en ensayos de seguimiento, que pueden incluir ensayos de quinasa in vitro, o ensayos basados en células. Dado que nuestro protocolo comienza con el ADNC, cualquier mutación o variación de la quinasa se puede incorporar fácilmente en el microarray y estudiarse en un alto rendimiento.Durante la preparación de la mezcla de resina de intercambio de aniones y placas, se recomienda el uso de máscaras para evitar la posible inhalación de las partículas de resina.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Investigación

Bioquímica

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Detección de inhibidores de la pirofosfatasa ligadas a la membrana Thermotoga maritima

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatización de cristales proteicos con I3C mediante el cribado de matriz de microsemalla aleatoria

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...