Name: kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Yazarlar projenin geliştirilmesi sırasında yardım ve eleştiri için LaBaer laboratuvarında herkese teşekkür etmek istiyorum. Bu proje NIH hibe U01CA117374, U01AI077883 ve Virginia G. Piper Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li><li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases.">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li><li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors.">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li><li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571,+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor.">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li><li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia:+frontline+treatment+and+long-term+outcomes.">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li><li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li><li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li><li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu.">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li><li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner.">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer.">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers.">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li><li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays.">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules.">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li><li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays.">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li><li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays.">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+(click+chemistry)-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays.">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li><li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer.">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li><li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL.">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li><li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies.">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li><li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics.">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Değişiklikler ve sorun giderme NAPPA dizileri üzerindeki kinaz aktivitesi nin optimizasyon aşamasında, gözlenen ana arka plan ve düşük dinamik aralık kaynaklarından biri baskı karışımında kullanılan BSA'dır. BSA aminosilane yüzeyi ile çapraz bağlantı için gerekli birincil aminler sağlamak ve yerinde DNA ve yakalama antikor tuzak oldu. Ancak, BSA son derece fosforilasyon, zor arka plan gürültüsü üzerinde dizi üzerinde otofosforilasyon sinyali tespiti için yapım. Bu sorunu çözmek için, baskı karışımı BSA için çeşitli alternatifler test edildi ve poli-lizin iyi bir yedek olarak tespit edildi. Poli-lizin herhangi bir fosforilasyon alanı yoksundur; bu nedenle, ifade edilmeyen dizilerin arka planı çok azdır. Ayrıca poli-lizin ile basılan mikrodiziler tekrarlanabilir ve iyi düzeyde protein gösterirler(Şekil 2).
Standart NAPPA testinde yapılan bir sonraki kritik modifikasyon fosfatse/DNase tedavi adımının eklenmesiydi. Mikrodizilerin fosfataz ile işlenmesi, protein sentezi ve yakalama sırasında IVTT karışımında meydana gelen fosforilasyonun giderilmesine olanak sağlar(Şekil 3). Bu fosforilasyonun kaynağı içsel otofosforilasyon aktivitesinden veya IVTT karışımında bulunan kinazların aktivitesinden kaynaklanabilir. İfade sonrası tüm fosforilasyonun giderilmesi, aktif olan ve otofosforilasyona uğrayabilen kinazların kolay tanımlanmasına olanak sağlamıştır(Şekil 3).
Protokol içindeki kritik adımlar NAPPA sağlam bir teknolojidir, ancak beklendiği gibi, birkaç kritik adım vardır. Bunlardan ilki, uygun konsantrasyonda yüksek kaliteli DNA elde edilmesidir. Düşük kaliteli veya düşük konsantrasyonlarda DNA'nın kullanılması, dizide analiz edilen protein sayısını azaltarak, uygun seviyelerde ifade edilmeyen ve görüntülenmeyen çeşitli özelliklere sahip düşük kaliteli mikrodiziler oluşturur. İkinci kritik adım, mikrodizideki proteinlerin ifadesidir. Fonksiyonel protein yüksek düzeyde ifade edecek bir IVTT sisteminin kullanımı dizi kiaz aktivitesi ni incelemek için hayati önem taşımaktadır.
TKI taramasındaki bir sonraki kritik adım mikrodizilerin nasıl işlendiğidir. Mikrodiziler protokolün herhangi bir adımında kurumamalıdır ve arka plan sinyalini artırabilecek çizilmeleri önlemek için nazik kullanım önerilir. Tüm deneydeki diziler birbiriyle karşılaştırılacağından, her kuluçka adımının tüm slaytlarda bile olduğundan emin olmak önemlidir. Örneğin, diziler arasında kuluçka süresi farklılıklarını önlemek için 20 dizilik bir toplu işişlendiğinde, tek bir dizide bir adımı gerçekleştirmek için gereken süre dikkate alınmalıdır.
Son olarak, deneyin tasarımı ve hem pozitif hem de negatif denetimlerin dahil edilmesi kalite kontrol ve veri analizi için çok önemlidir. İlk denetim kümesi her dizide yazdırılan lardır ve negatif kontroller [yani, boş noktalar (herhangi bir malzeme yazdırılmadan), su veya boş vektör (yalnızca etiketi ifade eder)]] ve pozitif bir kontrol (örn. saflaştırılmış IgG) ikincil antikor ve fosforilasyon düzeylerinde değişiklik için inert). Topluca, mikrodizinin arka plan düzeylerini, baskı sırasında olası taşımayı ve algılama yönteminin sinyal yoğunluğunu ölçerler.
Bir sonraki kontrol seti ilaç tarama kontrolleridir ve defosforile ve otofosforilasyonlu mikrodizileri (DMSO'nun varlığında veya yokluğunda) içerir. Daha önce de belirtildiği gibi, fosforlu mikrodizi fosfataz tedavisinden sonra fosforilasyon düzeyini ve dolayısıyla diğer tüm deneyler için temel düzeyini ölçer. Taban çizgisi düzeyi ne kadar düşükse, tahlillerin dinamik aralığı da o kadar yüksektir. Otofosforilasyonlu diziler tüm dizilerin maksimum fosforilasyon düzeylerini sunar ve sinyal güçlü ve net olmalıdır. Veri analizi için kullanılır, ama aynı zamanda tüm reaksiyonlar dizi üzerinde başarıyla gerçekleştirildi bir kontrol olarak.
Tekniğin sınırlamaları Şu andan itibaren, burada sunulan ilaç taraması nın kısıtlamalarından biri, sadece otofosforilasyon alabilen protein kinazlarını tarayabilme yeteneğidir. Bunun üstesinden gelmenin bir yolu da aynı yerde bir kigaz ve bilinen substrat yazdırmaktır. İki farklı protein için DNA'nın birlikte basımı başarıyla15,buyaklaşımın fizibilitesini düşündüren gerçekleştirildi. Ayrıca, dizide görüntülenen protein doğru bir şekilde katlanamayabilir ve bu da inaktif bir proteinle sonuçlanabilir. İnsan tabanlı ifade sisteminin kullanımı dizi üzerinde ölçülen kizaz aktivitesinde önemli bir iyileşme sağladı; ancak, bazı proteinler hala onun hareketsizlik nedeniyle dizi üzerinde analiz edilemez.
İkinci bir sınırlama bir pan anti-fosfo-tir antikor kullanarak fosforilasyon ölçümü. Fosforilasyon alanının motifi ile ilgili olarak özgüllüğü ne kadar açık olsa da, ölçülen tüm fosforiller tirozin artıkları üzerinde meydana geldi ve geride serinler, treoninler ve ilgili kinaslar kaldı. Bugüne kadar, 10'dan fazla pan fosfo-Ser/Thr antikorları, kuluçka ve yıkama koşullarını optimize etmek için yapılan çeşitli girişimlere rağmen başarılı olamamıştır. Antikorlardan bağımsız yeni bir tespit sistemi ilaç inhibisyonu için taranabilir protein kinazlarının sayısını artırmak için en iyi seçenek olabilir. Bu bağlamda, radyoaktivite veya tıklama çekimi gibi kimyasal yaklaşımlar da dahil olmak üzere birkaç seçenek mevcuttur. Arka plan sinyalini en aza indirmek ve tahliller için iyi bir dinamik aralık sağlamak için bir dizi optimizasyon gereklidir.
Üçüncü sınırlama, diziye basılacak cDNA klonlarının edinimidir. CDNA klonları, Creator veya Gateway23gibi siteye özgü rekombinasyon sistemleri de dahil olmak üzere herhangi bir klonlama tekniği kullanılarak oluşturulabilir. Diğer bir seçenek de klonları DNAsu kütüphanesinden satın almaktır, <https://dnasu.org/DNASU/Home.do>, tüm insan kinomu da dahil olmak üzere 17.000'den fazla cDNA klonu, NAPPA dizilerinin yapımında kullanılabilir24 .
Dördüncü sınırlama, her laboratuvar kendi NAPPA dizileri imal etmek ve ekrana uygun ekipman ile donatılmış olmasıdır. Bu protokol, yüksek işlem donanımına gerek kalmadan mikrodiziüzerine basılacak DNA'yı oluşturmak için alternatif yöntemler ve tüm hibridizasyon adımlarını el ile gerçekleştirmek için protokoller sağlar. Ancak, bir dizi ve mikrodizi tarayıcı erişim hala gereklidir. Bu sorunun üstesinden gelmek için bir seçenek nappa çekirdek hizmet ve tesis, bulunan kullanmaktır <http://nappaproteinarray.org/>, kar amacı gütmeyen bir akademik fiyata özelleştirilmiş NAPPA microarrays dağıtır. Son olarak, herhangi bir tarama metodolojisi itibariyle, diziler üzerinde elde edilen veriler eserler (pozitif veya negatif) olmaya duyarlıdır ve bu nedenle ortogonal tahliller kullanılarak doğrulanmalıdır.
Mevcut yöntemlere göre önemi Protein kinazlarının taranması için çeşitli platformlar mevcuttur. Rutin olarak kullanılan bir yaklaşım protein parçaları, kinaz etki alanı, kizaz etki alanı ve bazı düzenleyici bölgeler ile büyük protein parçaları ve hatta tam uzunlukta proteinler ile yapılabilir bağlayıcı tahliller vardır. Proteinler genellikle bakteri sistemlerinde maliyet ve ifade ve saflaştırma protokolleri basitlik nedeniyle ifade edilir. İlgi ilaç ve protein arasındaki etkileşim daha sonra floresan veya etiketlerin varlığı gibi rapor tsay çeşit ile ölçülür, örneğin. Bu yaklaşım kümesinin ana sınırlaması, proteinin ilaçla etkileşim sırasında mutlaka aktif olmamasıdır, bu da yanlış pozitif ve yanlış negatif etkileşimlerin tanımlanmasına neden olabilir. Protein parçaları özellikle konformasyondaki değişikliklere ve aktivite eksikliğine karşı savunmasızdır ve elde edilen tüm veriler aktif proteinler kullanılarak, tercihen tam uzunlukta formlarında doğrulanmalıdır. Bazı platformların bir diğer sınırlaması da, genel kullanımını sınırlayan yalnızca ATP analoglarını tarama yeteneğidir.
Enzimatik temelli yaklaşımlar kullanarak TKI'ların taranması için kullanılan ticari hizmetlerin çoğu, ilgi kinizin sadece vahşi tip versiyonlarını ve bazen de sadece seçilmiş birkaç mutantı kullanmaktadır. TKI ile tedavi edilen hastalarda ilaç direncinin çok yaygın olduğunu bilerek, en uygun inhibitörün seçimi için, farklı mutantlarda ilaç yanıtını ölçebilmek önemlidir. NAPPA doğası nedeniyle, kinaz mutantlarının taranması basit ve kolayca gerçekleştirilebilir, ve gerekli tek araç nappa cDNA koleksiyonuna kigaz mutant dahil, hangi siteye özgü mutagenez tarafından yapılabilir, örneğin.
Gelecekteki uygulamalar Kiaz inhibitörleri kullanılarak kanser tedavisinde en yaygın tedavi biçimlerinden biri, bir tedavi kursu sırasında ilaç hedefindeki mutasyonların elde edilmesidir. Bu mutantların kiaz inhibitörlerine verdikleri yanıtla ilgili olarak taranması, her hasta için kişiselleştirilmiş bir tedavi elde etmek için ikinci/üçüncü nesil TKI'ların seçimi için hayati önem taşımaktadır. Burada sunulan ilaç tarama yaklaşımı, herhangi bir tirozin kinaz inhibitörü insan genomunda mevcut tirozin kinazbirbir panel karşı test edilebilir tarafsız bir tarama platformu sağlar. NAPPA dizilerinde görüntülenen proteinler slaytta basılan cDNA'dan in vitro olarak ifade edildiğiiçin, herhangi bir mutant varyantı dizide görüntülenmek üzere cDNA koleksiyonuna kolayca dahil edilebilir. Kigaz mutantlarının üretilebildiği ve dizi üzerinde ifade edilebildiği tesis, NAPPA tekniğinin yüksek iş gücü ile birleşerek, kizaz mutantlarının incelenmesi ve ilaçlara verdikleri tepki için benzersiz bir ortam sağlayarak NAPPA'yı kişiselleştirilmiş ilaç tarama, hassas tıp hedeflerinden biri.

Protein kinazları hedeflerinin fosforilasyonundan sorumludur ve birçok hücresel işlevi kontrol eden karmaşık moleküler yolları (örn. hücre çoğalması, farklılaşma, hücre ölümü ve sağkalım) modüle edebilirler. Kiaz aktivitesinin deregülasyonu 400'den fazla hastalıkla ilişkilidir, kiyaz inhibitörlerini kanser, kardiyovasküler ve nörolojik hastalıkların yanı sıra inflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisi için kullanılan başlıca ilaçlardan biri haline getirir. ve otoimmün hastalıklar1,2,3.
Hassas tıbbın gelişiyle, yeni tedavilerin belirlenmesi, özellikle kinizaz inhibitörleri, ilaç ve klinik büyük itiraz var. Kiaz inhibitörlerinin de novo tasarımı ve mevcut FDA onaylı ilaçlar için yeni hedeflerin belirlenmesi de dahil olmak üzere, olası yeni kigir/kiyaz inhibitörlerinin tanımlanması için çeşitli yaklaşımlar kullanılabilir. Kliniklerde bu ilaçların uygulanması için gereken zaman ve para önceki klinik deney verilerinin kullanılabilirliği nedeniyle önemli ölçüde azaldığı için ikincisi özellikle çekicidir. Bir kiaz inhibitörü repurposing bir kanonik örnek imatinib, başlangıçta kronik miyelojen lösemi tedavisi için tasarlanmış (CmL) BCR-Abl inhibisyonu yoluyla, aynı zamanda başarıyla c-Kit aşırı ifade tedavisi için kullanılabilir gastrointestinal stromal tümörler (GIsTs)4,5,6,7.
Kiyaz inhibitörlerinin taranması bağlayıcı tahlillerde veya enzimatik tabanlı tahlillerde yapılabilir. Tahlillerin birinci sınıfı protein-ilaç etkileşimlerine odaklanır ve ligasyon bölgesi ve yakınlık gibi bilgiler sağlayabilir. Bu tahliller sırasında kizaz aktivitesi bilinmediğinden, proteindeki konformasyonel değişiklikler nedeniyle bir takım etkileşimler gözden kaçırılabilir veya yanlış saptanabilir. Öte yandan, enzim bazlı tahliller protein kinazlarının aktif olmasını gerektirir ve inhibitörün enzim aktivitesi üzerindeki etkisi hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak bu tür bir tarama genellikle daha zaman alıcı ve pahalıdır. Şu anda, tahliller her iki tür ticari çeşitli kaynaklardan kullanılabilir. Bunlar, kinaz inhibitörlerinin birkaç sınırlaması ile taranması için güvenilir bir seçenektir: I) yöntemlerin çoğu birden fazla kinazın ayrı ayrı test edilmesini içerir, bu da büyük bir protein setinin taranmasını pahalıya mal edebilir; II) test edilecek kinases kümesi önceden seçilmiş bir liste ile sınırlıdır, yabani tip kinazlar ve bazı kinazlar birkaç iyi bilinen mutasyona uğramış sürümleri, birçok yeni mutasyona uğramış isoforms test engelleyen.
Bu bağlamda, protein mikrodizileri, ticari olarak mevcut tekniklerle sunulan bazı sınırlamaların üstesinden gelebilen güçlü bir platformdur. İlgi çekici tam uzunlukta, aktif proteinler kullanılarak yüksek iş yapma taramasında enzimatik bazlı tahliller yapmak uygundur. Mikrodiziler NAPPA (nükleik asit programlanabilir protein dizisi) gibi kendi kendine biraraya getirilmiş bir yaklaşımla oluşturulabilir ve proteinler tahliller için tam zamanında ifade edilir ve dizide görüntülenenlerin gerçekten aktif olma olasılığını artırır. NAPPA'da görüntülenen proteinler, doğal katlama ve aktivite olasılığını artırmak için insan kaynaklı ribozomlar ve şaperon proteinleri kullanılarak üretilir.
Proteinler başlangıçta bir yakalama etiketi ile kaynaşmış ilgi genleri için kodlayan cDNA'lar baskı tarafından programlanır, bir yakalama maddesi ile birlikte, mikrodizi yüzeyine. Proteinler daha sonra in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) sistemi kullanılarak mikrodiziler üzerinde üretilir ve yeni ifade edilen proteinler yakalama maddesi tarafından mikrodizi yüzeyinde hareketsiz hale getirilir. İfade NAPPA dizileri, dizide görüntülenen proteinlerin tarafsız, yüksek iş lenme tarzında incelenmesi için kullanılabilir8,9.
Daha önce, NAPPA dizilerinde görüntülenen proteinlerin bilinen ortaklarla etkileşime girebilmek için düzgün bir şekilde katlandığını göstermiştir10; ayrıca enzimatik aktivitelerinin ilk kez 2018 yılında mikrodizi otofosforilasyon11'deprotein kinazlarının görüldüğü gösterilmiştir. Bugüne kadar, NAPPA metodolojisi biyomarker keşif 12 ,13,14,15,16,17dahil olmak üzere birçok farklı uygulamalar için kullanılmıştır protein-protein etkileşimleri10,18, substrat tanımlama19, ve ilaç taraması11. Esnekliği, platformun her uygulamaya adaptasyon sağlayan temel özelliklerinden biridir.
Burada, kendi kendine monte edilen NAPPA dizilerinde tirozin kinaz inhibitörlerinin taranması için bir protokol sunulmuştur. Platform aktif insan protein kinazlarının görüntülenmesi ve düşük arka plan ve yüksek dinamik aralıkta protein kinaz aktivitesinin analizi için optimize edilebiyi optimize edabedilir. Kiyaz inhibitörlerinin taranması için NAPPA'nın kullanımı için uygulanan modifikasyonlar arasında şunlar: I) baskı kimyasındaki değişiklikler, II) kizaz inhibitörü taraması ndan önce protein mikrodizisinin fosforilasyonunun kaldırılması ve III) dizi üzerinde fosforilasyon lu proteinler. Bu protokol türünün ilk ve NAPPA mikrodizilerde kizaz çalışma hakkında benzersiz bilgiler sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>364 well plates (for arraying)</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>x7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 &#181;L 96-well collection plate</td>
			<td>Abgene</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin device</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>140500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.00066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone 99.9%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal for 96 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76004-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>80370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9804S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>37535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 35</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>BP345-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeepWell Block, case of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-intercalating dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P11495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plates</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>WHA77002804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Permeable Seals, box of 50</td>
			<td>ThermoFisher/AbGene</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass box</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human-based IVTT system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPure Mouse IgG whole molecule</td>
			<td>ThermoFisher/Pierce</td>
			<td>31202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (Potassium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4(Potassium phosphate monobasic)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Protein Phosphatase</td>
			<td>new england biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifterslips, 24 x 60 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25X60I24789001LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal 30-slide rack with no handles</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4 (Sodium orthovanadate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOAc (Sodium acetate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410.10 / 740414.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoprep Anion II</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740503.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>79617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution (0.01%)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Phosphatase (Lambda)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs, Inc</td>
			<td>44904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica packets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100489-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single well plate</td>
			<td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (3M, pH 5.5)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB media (Terrific Broth)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>IBI scientific</td>
			<td>IB70144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td>Maker/model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable chilling incubator</td>
			<td>Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker for bacterial growth</td>
			<td>ATR Multitron shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold with liquid waste trap</td>
			<td>MultiScreenVacuum Manifold 96 well</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well autopippetor/liquid handler</td>
			<td>Genmate or Biomek FX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid dispenser</td>
			<td>Wellmate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarrayer</td>
			<td>Genetix QArray2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic hybridization station</td>
			<td>Tecan HS4800 Pro Hybridization Station</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Tecan PowerScanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray data quantification</td>
			<td>Tecan Array-ProAnalyzer 6.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays

Kiyaz inhibitörlerinin taranması, bir ilacın özelliklerini daha iyi anlamak ve klinik etkileri olan potansiyel yeni hedeflerin belirlenmesi için çok önemlidir. Bu tür bir taramayı gerçekleştirmek için çeşitli metodolojiler bildirilmiştir. Ancak, her birinin kendi sınırlamaları vardır (örneğin, sadece ATP analoglarının taranması, saflaştırılmış kinaz alan adlarının kullanılmasına yönelik kısıtlama, bir seferde birkaç kindan fazla kinaz ın test edilmesiyle ilgili önemli maliyetler ve protein kinazlarının taranmasında esneklik eksikliği yeni mutasyonlar). Burada, bu sınırlamaların bazılarını aşan ve kiyaz inhibitörlerinin tarafsız taraması için kullanılabilecek yeni bir protokol sunulmuştur. Bu yöntemin bir gücü farklı kinazlar veya aynı kinaz farklı varyantları arasında, birden fazla protein arasında kinaz inhibitörlerinin aktivitesini karşılaştırmak için yeteneğidir. İnsan temelli in vitro transkripsiyon ve çeviri sistemi (IVTT) tarafından protein kinazlarının ekspresyonu ile oluşan kendi kendine birleştirilmiş protein mikrodizileri kullanılmaktadır. Mikrodizide görüntülenen proteinler aktiftir, kiaz inhibitörlerinin etkilerinin ölçülmesine olanak sağlar. Aşağıdaki yordam, mikrodizi oluşturma ve taramadan veri analizine kadar protokol adımlarını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Kendi kendine monte NAPPA mikrodizileri biyomarker keşfi, protein-protein etkileşimleri, substrat tanımlama ve ilaç taraması10,11 dahil olmak üzere birçok farklı uygulamalar için kullanılabilecek sağlam bir platform sağlar ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.
NAPPA mikrodizilerinde kinaz aktivitesi ve tirozin kinaz inhibitörlerinin taranması için benimsenen genel metodoloji Şematikolarak Şekil 1'de gösterilmiştir. İlk olarak, NAPPA mikrodizileri cDNA ve yakalama ajanının kaplamalı mikrodiziler üzerine immobilizasyonu ile oluşturulur. CDNA'lar daha sonra insan tabanlı IVTT sistemi kullanılarak proteinlerin transkripsiyonu ve çevirisi için şablon olarak kullanılır ve yeni sentezlenen proteinler yakalama ajanı9tarafından hareketsiz hale getirilmiştir. Basılı mikrodizi kalitesi DNA düzeyleri (tutarlı baskı onaylayan) veya protein dizi (protein ekspresyonu ve yakalama teyit) ölçülerek izlenebilir; Şekil 1). Arka plan sinyalini azaltmak ve deneyin dinamik aralığını artırmak için, mikrodiziler 1) lambda fosfataz ile tedavi edilir Ser/Thr/Tyr artıklarından fosforilasyon un giderilmesi, daha sonra 2) DNase ile yerinde kimyayı basitleştirmek ve azaltmak için arka plan (Şekil 1).
Bir sonraki adım, mikrodizilerin ATP yokluğunda kizaz tamponu ile kuluçkaya yatırıldığı otofosforilasyon reaksiyonudur (negatif kontrol dizisi, defosforilasyon mikrodizileri olarak adlandırılır) ve kiyaz tamponu ATP ile desteklenir (pozitif kontrol, otofosforilasyon dizileri olarak adlandırılır) veya ATP + DMSO (araç kontrolü). Bu adımda kigaz eklenmez; bu nedenle, mikrodizide görüntülenen her kinazın içsel aktivitesi, bir pan anti-fosfo-tirozin antikor kullanılarak fosforilasyon düzeylerinin ölçülmesi ile ölçülür ve ardından cy3-labbeled sekonder antikor(Şekil 1).
Dört boyutlu olarak basılan insan protein kinazlarından oluşan bir panel gösteren NAPPA-kinaz dizilerinin kalite kontrolü Şekil 2'degösterilmiştir. Hareketsiz DNA seviyeleri DNA boyama ile ölçüldü ve mikrodizide eşit bir sinyal gösterdi, bu da dizide basılan DNA miktarının tek düze olduğunu gösteriyor. Dna lekelenmeden çeşitli özellikleri gözlemlemek de mümkündür. Bu özellikler, DNA'nın baskı karışımından atlandığı bazı kontrollere karşılık gelir [yani, boş noktalar (hiçbir şey basılmamış), su lekeleri, saflaştırılmış IgG noktası (poli-lizin, crosslinker ve saflaştırılmış IgG), baskı karışımı sadece (tam baskı karışımı: poli-lizin artı crosslinker ve anti-bayrak antikor, herhangi bir DNA olmadan)]. NAPPA-kiaz mikrodizilerinde görüntülenen protein düzeyleri anti-tag antikor kullanılarak IVTT reaksiyonundan sonra değerlendirildi.
Kizaz taraması için Bayrak tercih edilen etiket olarak kullanılmış ve mikrodizide görüntülenen protein düzeyi anti-bayrak antikor kullanılarak ölçüldü. Görüldüğü gibi, cDNA içeren lekelerin çoğu başarıyla protein tespit edilebilir düzeyde görüntülenir. CDNA içermeyen kontrol noktalarından bazıları da anti-bayrak antikorlu sinyal ortaya koymuştur: IgG noktası (ikincil antikor aktivitesini tespit etmek için kullanılır) ve boş vektör noktaları (sadece etiket için cDNA kodları)(Şekil 2). NAPPA-kiazmikrodizileri slaytlar arasında iyi tekrarlanabilirlik gösterdi ve protein görüntüleme düzeylerinin 0,88'den yüksek farklı baskı gruplar arasında korelasyonu gösterdi (Şekil 2). Aynı parti içinde korelasyon 0,92 'ye yakın ,daha da yüksekti (veriler gösterilmedi).
Daha sonra dizide görüntülenen proteinlerin kinaz otofosforilasyon aktivitesi antifosfo-tirozin antikor kullanılarak ölçüldü (Şekil 3). Dizide görüntülenen protein, ekspresyondan sonra yüksek düzeyde protein fosforilasyon gösterdi(Şekil 3, solda), dizide görüntülenen proteinin içsel kinaz aktivitesi nden veya IVTT karışımında bulunan aktif kinazlardan kaynaklanabilir. Bu fosforilasyon lambda fosfataz tedavisi ile tamamen kaldırılmış ve bu mikrodiziler kizaz tahlilleri için kullanılmıştır. Defosforilasyondan sonra, ATP olmadan yapılan otofosforilasyon reaksiyonları beklendiği gibi önemli bir fosforilasyon düzeyi göstermezken, ATP varlığında kizim tamponu ile inkübe edilen mikrodizimler protein fosforilasyonunun 15 dk kadar hızlı olduğunu göstermiştir ( Şekil 3). İlaç taraması için kinaz aktivitesi test edilen kinaz sayısını en üst düzeye çıkarmak için 60 dk otofosforilasyon reaksiyonundan sonra ölçüldü.
Protein ekspresyonundan hemen sonra fosforilasyon düzeylerinin ölçüldüğü mikrodiziler arasındaki karşılaştırma(Şekil 3, sol) ve 60 dk sonra otofosforilasyon reaksiyonu(Şekil 3, sağ) gösterdi: i) proteinler sadece fosforilasyon ifadeden sonra, IVTT karışımında bulunan proteinler tarafından dışsal olarak fosforile edilebilen, ancak otofosforilasyon yapılamaz; ii) protein fosforile sadece otofosforilasyon reaksiyonundan sonra, bu proteinlerin protein ekspresyonundan sonra aktif olmadığını ve kinaz tamponunda aktif olması için gerekli ko-faktörlerin bulunmadığını düşündürmektedir; veya iii) protein her iki dizide de fosforilasyon alabildive her iki ortamda da aktif olduklarını düşündürmektedir(Şekil 3).
NAPPA-kinaz dizilerinde tirozin kinaz inhibitörlerinin taranması için elde edilen sonuçlara örnek olarak protein kinazları arasında belirgin seçiciliğe sahip üç kinaz inhibitörü kullanılmıştır: staurosporine, imatinib ve ibrutinib. Tüm taramalar da otofosforilasyon reaksiyonu sırasında defosforilasyonlu NAPPA mikrodizileri artan TKI konsantrasyonları (100 nM ile 10 uM arasında değişen) ile kuluçkaya yatırıldı. İlk TKI test staurosporine oldu, küresel bir protein kinaz inhibitörü, hemen hemen tüm kinazlar arasında mikrodizi üzerinde güçlü kinaz inhibisyonu gösterdi11.
Daha sonra, imatinib test edildi, kronik miyelojen lösemi ve gastrointestinal stromal tümörlerin tedavisinde kullanılan bir ABL ve c-Kit inhibitörü4,5,6,7. NAPPA-kinaz dizilerinde imatinib Abl1 ve BCR-Abl1 aktivitesinde önemli bir azalma gösterirken, diğer kinazlar çoğunlukla etkilenmemiş olarak kalmıştır(Şekil 4A). Kizaz aktivitesi için veri niceliği defosforilasyon dizisine göre normalleştirildi ve pozitif kontrol mikrodizisinin bir yüzdesi olarak temsil edildi (sadece araç). TNK2 (ilgili olmayan kinaz), Abl1 ve BCR-Abl1 verileri Şekil 4B'degösterilmiştir. Beklendiği gibi, imatinib Abl1 ve BCR-ABl1 doğru selektif inhibisyon gösterdi. C-Kit'e ait veriler pozitif kontrol dizilerinde etkinlik olmaması nedeniyle yetersizdi.
Son olarak, Bruton'un tirozin kinazının (BTK) FDA onaylı kovalent inhibitörü ibrutinib test edildi. Ibrutinib şu anda kronik lenfositik lösemi (CLL), manto hücreli lenfoma ve Waldenström's makroglobulinemi21,22dahil olmak üzere aşırı aktif BTK ile çeşitli kan ile ilgili kanserlerin tedavisinde kullanılır. Şekil 4C,ibrutinib taraması için elde edilen tipik sonuçları temsil eder. ABL1 (ilgili olmayan kinaaz) ve BTK (kanonik hedef) ve ERBB4 (potansiyel yeni hedef) kiyaz aktivitesi Şekil 4D'degösterilmiştir. Veriler ERBB4'ün doza özgü bir şekilde ibrutinib tarafından inhibe edilebilmiş olabileceğini göstermektedir. Bu inhibisyon in vitro doğrulandı ve hücre bazlı tahliller11, Bu platformun gücünü gösteren.
Birlikte ele alındığında, veriler NAPPA-kiyaz mikrodizi platformu TK inhibitörlerinin tarafsız tarama için kullanılabilir öneririz. Ayrıca, tarama hızlı ve kolayca ilgi protein kinazherhangi bir varyasyon içerecek şekilde özelleştirilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg"> Şekil 1: NAPPA dizilerinde tirozin kinaz inhibitörlerinin kalite kontrolü ve taranması şeması. NAPPA dizileri, bir etiket ve yakalama antikorile kaynaşmış ilgi proteini için cDNA kodlaması ile yazdırılır. In vitro transkripsiyon ve çeviri reaksiyonu (IVTT) sırasında sentezlenen proteinler yakalama antikoru tarafından etiket üzerinden mikrodizi yüzeyinde yakalanır. Dizilerin kalite kontrolü (QC), slaytta basılan DNA düzeylerinin, floresan DNA'nın ara verdiği boya ve etikete özgü antikorlar kullanılarak dizide görüntülenen protein düzeyleri kullanılarak gerçekleştirilir. Kinaz taraması için mikrodiziler, IVTT reaksiyonundan sonra, protein sentezi sırasında oluşmuş olabilecek tüm fosforilasyon ve baskılı DNA'yı çıkarmak için DNase ve fosfataz ile tedavi edilir. Fosforlu diziler artık ilaç taraması için kullanılmaya hazır. Her bir titreşme için, rutin olarak üç kontrol kümesi kullanılır: (I) otofosforilasyon reaksiyonunun ATP olmadan yapıldığı fosforilasyonlu diziler; (II) atp varlığında otofosforilasyon reaksiyonu yapılan otofosforilasyon mikrodizileri; ve (III) DMSO tedavi edilen dizi (araç), atp ve DMSO ile otofosforilasyon reaksiyonu yapılır. Farklı kiaz inhibitörleri konsantrasyonu ile tedavi edilen slaytlar, DMSO ile tedavi edilen diziler için kullanılan protokolün aynısını izler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg"> Şekil 2: Kendi kendine monte edilmiş NAPPA-kinaaz dizileri için kalite kontrolünün temsili sonuçları. Floresan DNA-intercalating boya (solda) ile ölçülen DNA içeriği ve anti-Flag antikor (orta) ile ölçülen mikrodizi üzerinde görüntülenen protein düzeyleri gösterilir. Sağ tarafta, ayrı gruplar halinde basılan iki NAPPA-kinaaz dizisinde görüntülenen protein düzeylerinin korelasyon grafiği yer alır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg"> Şekil 3: NAPPA-kinaaz dizilerinde kizaz aktivitesinin temsili sonuçları. Dörtlü protein kinazlarını gösteren mikrodiziler, anti-pTyr antikor kullanılarak protein fosforilasyonölçümü yoluyla dizideki protein kinaz aktivitesini incelemek için kullanıldı ve ardından cy3 etiketli anti-fare antikorları kullanıldı. Protein ekspresyonu (post-ekspresyon) sonrası arka plan fosforilasyonundan sonra fosfataz/DNase tedavisi olmayan ve otofosforilasyon reaksiyonu sırasında ATP olmayan kontrol dizileri kullanıldı. Geri kalan mikrodiziler fosfataz/DNA ile, otofosforilasyon reaksiyonu ATP (defosforilted mikrodizi, negatif kontrol) veya ATP (otofosforilted mikrodiziler) olmadan uygulandı. Otofosforilasyonlu mikrodiziler için gösterildiği gibi 15 dk, 30 dk, 45 dk veya 60 dk için otofosforilasyon reaksiyonu yapılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg"> Şekil 4: NAPPA-kinaz dizilerinde tirozin kinaz ekranından gelen temsili veriler. (A) Fosfataz/DNase tedavi edilen NAPPA-kinaz dizileri otofosforilasyon reaksiyonu sırasında artan imatinib konsantrasyonlarında kuluçkaya yatırıldı ve kinaz aktivitesi anti-fosfo-tir antikor ile ölçüldü. (B) İmatinib'e maruz kalan NAPPA-kinaaz dizilerinde gözlenen kinaz aktivitesinin ölçülmesi. Veriler negatif kontrol dizilerinin (fosforilasyondan arındırılmış) sinyaline karşı normalleştirildi ve pozitif kontrol dizilerinin (DMSO varlığında yapılan otoforilasyon reaksiyonu) yüzdesi olarak gösterilmiştir. Benzer veriler ibrutinib(C,D)taraması için gösterilmiştir. Bu rakam Rauf ve ark.11'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1. Otomatik hibridizasyon istasyonu kullanarak NAPPA dizilerinde tirozin kinaz inhibitörlerinin taranması için alternatif protokol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays at JoVE.com

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

NAPPA, protein aktivitesi ve fonksiyonunun tarafsız bir şekilde incelenmesinde kullanılabilen güçlü bir protein mikrodizi platformudur. NAPPA'da görüntülenen proteinler, doğal katlama ve aktivite olasılığını artırmak için insan kaynaklı ribozomlar ve şaperonlar kullanılarak insan temelli bir ifade sisteminde üretilir. Kiaz inhibitörlerinin taranması için NAPPA dizilerinin kullanılması, yeni ilaçların ve klinik olarak ilgili kiazla mutasyonlarının test intesti için yeni bir platform sağlamaktadır.NAPPA metodolojisi tarafından üretilen protein mikrodizileri biyomarker keşfi, protein-protein etkileşimleri, substrat tanımlama ve ilaç taraması gibi birçok farklı uygulama için kullanılabilir. Yol boyunca kalite kontrol adımlarını gerçekleştirin. DNA hazırlığınızın kalitesini, DNA mikrodizisini ve protein mikrodizisini test edin.Herhangi bir adımda kalite iyi değilse, sadece baştan başlayın. Prosedürü gösteren Lisa Miller, laboratuvarımda teknisyen olacak. Evde yüksek iş sahibi mini-hazırlık için bakteri büyüme hazırlamak için, ilk 96 iyi formatında burgu plaka bakteri aşılamak, ve 16 saat boyunca büyümesini sağlar.Ertesi gün, antikor ampisilin ile desteklenen müthiş suyu orta 1.5 mililitre ile derin kuyu plaka her kuyu doldurun. Antikor plazmid üzerinde seçim işareti bağlıdır. Daha sonra, %80 etanol ve alev içeren 96 iğneli bir cihazı sterilize edin.Steril 96 iğneli cihazı kullanarak bir gecede kuluçkaya yatan agar plakasından kolonileri seçin ve kültürü aşılamak için derin kuyu plakasının kuyularına daldırın. Bir gaz geçirilebilir mühür ile blok kapak ve 37 santigrat derece 22 ila 24 saat ve 300-800 rpm bir shaker inkübat. Bundan sonra, pelet kültürleri ve el yazmasına göre kültürleri yeniden askıya.Lyse bakterilerher kuyuya 200 mikrolitre çözelti iki ekleyerek, plakayı alüminyum bir mühürle kapatın ve beş kez ters çevirin. Hücreleri tam beş dakika kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi nötralize etmek için, 200 mikrolitre çözelti üç ekleyin, plakayı alüminyum bir contayla kapatın ve beş kez ters çevirin.Sonra, 3800 G, dört santigrat derece, 30 dakika lysate supernatant temizlemek için plaka spin. Aniyon değişimi reisin plakaları hazırlamak için, ilk olarak, aniyon değişimi bulamaç karıştırın ve bir cam yalak içine bulamaç dökün. Bir atık toplama kabı olarak hareket etmek için derin bir kuyu plaka üstüne yığın filtre plakaları.Daha sonra, geniş kart P1000 ipuçları nı kullanarak bulamacı karıştırın ve 450 mikrolitre bulamaç filtre plakalarının her kuyusuna aktarın. Santrifüj ve akış atmak. Şimdi, lysate supernatants reçine plaka ve derin kuyu blok yığınına aktarın.Yığılmış plakaları 30 kez G'de beş dakika boyunca döndürün ve akış hızını artırın. Sütunu yıkamak için, her kuyuya 400 mikrolitre n3 yıkama tamponu ekleyin. Yıkama tamponu kaldırmak için vakum manifoldu için reçine plaka aktarın.Yıkama adımını üç kez tekrarlayın ve dna'yı eşerek 30 kez kısa bir beş dakikalık dönüşle kalan yıkama tamponunu çıkarın G.To, reçin plakayı temiz bir 800 mikrolitrelik toplama plakasının üzerine yerleştirin. Her kuyuya 300 mikrolitre n5 çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika oturmasına izin verin. Daha sonra, yığılmış plakaları 20 kez G'de beş dakika döndürün ve bir dakika boyunca 233 kat A.C.'ye kadar yavaş bir hız alayın.Plakaları kullanmadan önce negatif 20 derecede saklayın. İlk olarak, slaytları bir rafa yerleştirin ve asetonda %2 aminosilane reaktifinin kaplama çözeltisini içeren cam haznesine kaydırakları batırın. Slaytları 15 dakika sallayın.Daha sonra, aseton slaytlar durulayın suda son bir durulama takip. Daha sonra, basınçlı hava kullanarak slaytlar kuru. Tüm su damlacıkları kaldırılana kadar yaklaşık üç dakika boyunca tüm açılardan üzerlerine üfleme.Kaplanmış slaytları oda sıcaklığında sıkıca kapatılmış bir kutunun içinde metal bir rafta saklayın. Şimdi, el yazmasında açıklandığı gibi DNA'yı çökeltmeye devam edin. Daha sonra, ultrasaf su 20 mikrolitre DNA pelet yeniden askıya ve iki saat boyunca 1000 rpm sallayın.Dizi örneğini hazırlamak için, her DNA örneğine antikor, çapraz bağlantı ve polilizin içeren 10 mikrolitre taze hazırlanmış baskı karışımı ekleyin. Alüminyum folyo ile mühür plakaları ve 1000 rpm 90 dakika oda sıcaklığında sallayın. Plakaları bir gecede dört santigrat derecede saklayın.Baskı gününde, kısa bir süre girdap ve plakaları spin. Her numunenin 28 mikrolitresini 384 kuyu plakasına aktarın. Aminosilane kaplı slaytları ve 384 kuyu plakasını arrayer güverteye yerleştirin ve mikrodizi baskı programını başlatın.Baskı bittiğinde, mikrodizileri etiketle. Mikrodiziler daha fazla kullanıma kadar aylarca saklanabilir. DNA düzeylerini ölçmek için, slaytları bir pipet kutusuna yerleştirin ve 50 mililitre engelleme tamponuyla engelleyin.Bir saat boyunca oda sıcaklığında sallanan bir shaker üzerinde slaytlar kuluçka. Daha sonra, çözeltiyi atın ve 20 mililitre engelleme tamponu ve 33 mikrolitre floresan DNA intercalating boya ekleyin. Ajitasyonla 15 dakika kuluçkaya yat.Kuluçka bittikten sonra, hızlı bir şekilde ultra saf su ile slaytlar durulayın ve basınçlı hava ile kuru. Mikrodiziler taranmaya hazır. Mikro dizileri ifade etmek için, slaytları daha önce gösterildiği gibi engelleyin ve ultra saf suyla durulayın ve filtrelenmiş basınçlı havaile kurulayın.Her slayta bir sızdırmazlık contası takın. Slaytlar üzerine in vitro transkripsiyon ve çeviri karışımı 130 mililitre ekleyin ve yavaşça in vitro transkripsiyon ve çeviri karışımı yayılır ve herhangi bir kabarcıklar olmadan dizi tüm alanı kapsar böylece sızdırmazlık contaları masaj. Küçük yuvarlak bağlantı noktası contalarını her iki bağlantı noktasına da uygulayın.Protein ekspresyonu için 30 derecede 90 dakika kuluçka, sorgu proteininin immobilizasyonu için 15 santigrat derecede 30 dakika. Daha sonra, conta çıkarın, beş dakika her 15 mililitre TBST süt ile slaytlar üç kez yıkayın ve bir saat boyunca aynı çözelti de blok. Dizideki proteinlerin tespiti için, TBST'yi sütle birlikte çıkarın, slaytları ızgara plakasına yerleştirin ve 600 mikrolitre birincil antikor, fare anti-Flag, seyreltilmiş 1-200 mikrolitre ve %5 sütle desteklenen 1x TBST uygulayın.Oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yat. Slaytları 50 mililitre 1x TBST ve sallanan shaker üzerinde %5 süt ile beşer dakika boyunca üç kez yıkayın. İkincil antikor için prosedürü tekrarlayın.Bir saat kuluçka bittikten sonra, beş dakika her biri için sallanan shaker üç kez 1x TBST ile slaytlar yıkayın. Daha sonra, hızlı bir şekilde ultra saf su ile slaytlar durulayın ve basınçlı hava kullanarak kuru. Slaytlar taranmaya hazır.Fosfataz ve DNase tedavisini gerçekleştirmek için, ifade edilen slaytları TBST ile yıkayın ve bloke edin ve el yazmasında açıklandığı gibi %3 BSA ile tamamlanır. Daha sonra, bir ızgara plaka üzerine slaytlar yerleştirin ve fosfataz DNase çözeltisi 200 mikrolitre uygulayın. Buharlaşmayı önlemek için üzerine bir mikrodizi kapak fişi yerleştirin.Fırında bir saat 30 dakika boyunca 30 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, 1x TBST ve 0.2 molar sodyum klorür ile kayan shaker üzerinde beş dakika her üç kez slaytlar yıkayın. İlaç tedavisi ve kinaaz reaksiyonu gerçekleştirmek için, ızgara plaka üzerinde slaytlar yerleştirin ve ilaç kiaz çözeltisi 200 mikrolitre uygulayın.Buharlaşmayı önlemek için üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Fırında 30 derecede bir saat kuluçkaya yat. Tekrarlanabilir verilerin anahtarı, slaytlar arasında tutarlı kuluçka süresidir.Bu özellikle kizaz reaksiyonu sırasında önemlidir. Her slayt işlemek için gereken süre hesaba katılmalıdır. Bundan sonra, 1x TBST ve 0.2 molar sodyum klorür ile kayan shaker üzerinde beş dakika her üç kez slaytlar yıkayın.Primer antikor fosfotirozin antikor olarak kullanarak tekrar protein tespiti TBST'de 1 ila 100 seyreltilmiş, %3 büyükbaş serum albuminile desteklenmiştir. Primer antikor ile kuluçka sonrası yıkama kıvrak için 1x TBST ve %3 büyükbaş serum albumin, sekonder antikorlu kuluçka sonrası yıkıntılar için TBST kullanın. Daha önce olduğu gibi yıkayın ve kurulayın.Görüntü edinimi için, mikrodizileri slayt tutucu dergisine yükleyin. Dergiyi mikrodizi tarayıcısına yükleyin. Optimize edilmiş ayarlarla tüm mikro dizileri tarayıp, denemeler arasında görüntüleri karşılaştırırken otomatik kazancı kapatmayı unutmayın.Görüntüleri bir niceliklendirme yazılımına aktarın, ızgarayı noktalarla hizalayın ve mikrodizideki her bir özelliğin sinyal yoğunluğunu ölçün. İstatistiksel analize devam edin. Bu çalışmada, mikrodizi tamamlayıcı DNA içeren lekelerin çoğunluğu başarıyla protein tespit edilebilir düzeyde gösterdi gösterdi.NAPPA kiazaz mikrodizileri slaytlar arasında iyi tekrarlanabilirlik gösterdi, 0.88'den yüksek farklı baskı gruplar arasında protein görüntüleme düzeylerikorelasyon ile. NAPPA kilaz dizilerindeki kizaz aktivitesinin temsili sonuçları ekspresyon sonrası yüksek düzeyde protein fosforilasyon gösterdi. Fosforilasyon düzeylerinin fosfataz tedavisinden hemen sonra ve 60 dakikalık otofosforilasyon reaksiyonundan sonra ölçüldüğü mikrodiziler arasındaki karşılaştırma, dizide aktif protein kinazlarının varlığını göstermektedir.NAPPA kinaz dizilerinde, imatinib ABL1 ve BCR-ABL1 aktivitesinde önemli bir azalma gösterirken, diğer kinazlar çoğunlukla etkilenmedi. Kiyaz aktivitesi defosforiled dizi karşı normalleştirilmiş ve pozitif kontrol mikrodizi bir yüzdesi olarak temsil ABL1 ve BCR-ABL1 doğru imatinib selektif inhibisyonu gösterdi. Ibrutinib taraması için elde edilen tipik sonuçlar, ABL1 ile ilgili olmayan kiyazın kiyaz aktivitesinin etkilenmediğini gösterdi.BTK kanonik hedef ve ERBB4 potansiyel yeni hedef, ibrutinib varlığında azaltılmış aktivite gösterdi. Veriler ERBB4'ün doza özgü bir şekilde ibrutinib tarafından inhibe edilebilmiş olabileceğini göstermektedir. Protein mikrodizi taramalarının başarısı, mikrodizinin kalitesine son derece bağlıdır.Uygun veri analizine izin vermek için birkaç pozitif ve negatif kontrol özelliği kullanılmalıdır. NAPPA kinaaz tahlil bir tarama platformudur ve bu nedenle elde edilen veriler in vitro kinap tahlilleri veya hücre bazlı tahliller içerebilir takip tahlilleri, doğrulanmalıdır. Protokolümüz cDNA ile başladığı için, herhangi bir kinaz mutasyonu veya varyasyonu mikrodiziye kolayca dahil edilebilir ve yüksek iş elde etme de incelenebilir.Aniyon değişimi rezorbül ve plakaların hazırlanması sırasında, rezorn partiküllerinin olası teneffüs önlemek için maskekullanılması tavsiye edilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...