Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تشارلز المنح PRIMUS/MED/26، GAUK 1308217 و SVV 260310. نشكر Ondřej Šebesta على المساعدة في الفحص المجهري وتطوير خط أنابيب تحليل الصور. نشكر مختبر ReGenEx لسلالات S. سيريفيسياي، ومختبر JapoNet وHironori Niki لسلالات S. japonicus. تم توفير سلالة PPC1-88 من قبل مركز الخميرة للموارد الوراثية في اليابان. وأُجري الفحص المجهري في مختبر الفحص المجهري للبؤرة والفلورة الذي يشترك في تمويله الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية وميزانية الدولة للجمهورية التشيكية (المشروع رقم. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 و CZ.2.16/3.1.00/21515).

1. إعداد الحلول ووسائل الإعلام
<ol><li>
إعداد محلول تلطيخ الدهون.
	<ol>
<li>لإعداد الأسهم الدهون تلطيخ الحل حل 10 ملغ من BODIPY 493/503 في 10 مل من DMSO اللامائية (التركيز النهائي 1 ملغ / مل). إذابة المحتوى الكامل لقارورة 10 ملغ BODIPY 493/503 لمنع فقدان المواد أثناء الوزن. تحذير: </</c2> قد تمر DMSO من خلال ا?...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

فهم التمثيل الغذائي للدهون وتنظيمها مهم لكل من البيولوجيا الأساسية، والتطبيقات السريرية والتكنولوجية الحيوية. يمثل محتوى LD قراءة مريحة لحالة استقلاب الدهون في الخلية، مع الفحص المجهري الفلوري كونها واحدة من الطرق الرئيسية المستخدمة لتحديد محتوى LD. يسمح البروتوكول المعروض بالكشف الآلي ...

تلعب الدهون أدوارًا حاسمة في الطاقة الخلوية والتمثيل الغذائي للكربون، وتوليف مكونات الغشاء، وإنتاج المواد النشطة بيولوجياً. يتم ضبط أيض الدهون بدقة وفقا للظروف البيئية، وتوافر المواد الغذائية والمرحلة1دورة الخلية. في البشر، وقد تم ربط التمثيل الغذائي للدهون إلى أمراض، مثل السمنة، والسكري من النوع الثاني والسرطان2. في الصناعة، والدهون التي تنتجها الكائنات الحية الدقيقة، مثل الخمائر، تمثل مصدرا واعدا من وقود الديزل المتجددة3. تخزن الخلايا الدهون المحايدة في ما يسمى قطرات الدهون (LDs). وتتألف هذه الهيئات المحفوظة تطوريا من triacylglycerols، استرات الستيرل، أحادية طبقة فوسفوليبيد الخارجي والبروتينات المرتبطةبها 1. تنشأ الـ LDs في الشبكية الإندوبلازمية، وتمارس دورة الخلايا أو ديناميات مرحلةالنمو، وهي مهمة للبطانة الدهنية 1. يمكن استخدام عدد LD ومورفولوجيا كوكيل مناسب عند اختبار استقلاب الدهون في ظل ظروف النمو المختلفة أو عند فحص لوحة من المتحولين. وبالنظر إلى طبيعتها الديناميكية، فإن التقنيات القادرة على تحليل خصائص الـ LDs الفردية لها أهمية خاصة في دراسات استقلاب الدهون.
وقد استخدمت أنواع الخميرة المختلفة لوصف مسارات التمثيل الغذائي المتعلقة بالدهون وتنظيمها، أو استخدامها في التكنولوجيا الحيوية لإنتاج مركبات مثيرة للاهتمام أو الوقود1. وعلاوة على ذلك، لنماذج الخمائر، مثل الخميرة الناشئة Saccharomyces سيريفيسياي أو الخميرة الانشطارية ذات الصلة البعيدة Schizosaccharomyces pombe، تتوفر مكتبات سلالة الحذف على نطاق الجينوم التي يمكن استخدامها لالإنتاجية العالية شاشات4,5. في الآونة الأخيرة تم وصف تكوين LD والديناميات في S. pombe6,7,8,9, وقد تم عزل المسوخ المتعلقة باستقلاب الدهون في الخميرة نموذج الناشئة شيزوساكاشارومايسيس جابونيكوس10.
تتوفر العديد من التقنيات لدراسة محتوى LD ودينامياتها. معظم توظيف نوع من تلطيخ اللادلس مع الأصباغ lipophilic مثل النيل الأحمر أو BODIPY 493/503. هذا الأخير يظهر الإثارة أكثر ضيقا والأطياف الانبعاثات، وزيادة خصوصية نحو الدهون المحايدة (LDs) بدلا من فوسفوليبيدات (الأغشية)11. وقد استخدمت أساليب قياس الفلورومتري والتدفق والقياس في الخلايا بنجاح في مختلف الأنواع الفطرية للكشف عن الجينات وظروف النمو التي تؤثر على محتوى الدهون التخزين12،13،14،15. في حين أن هذه الأساليب مناسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية، فإنها لا يمكن قياس أعداد ومورفولوجيا LDs الفردية في الخلايا، والتي يمكن أن تختلف بشكل كبير بين ظروف النمو والأنماط الجينية. التشتت المتماسك رامان أو المجهرية الثلاثية الأبعاد الرقمية هي أساليب خالية من التسميات التي تنتج البيانات على مستوى LD، ولكن تتطلب معدات متخصصة مكلفة16،17،18. ومن ناحية أخرى، يمكن أن توفر التنظير المجهري الفلوري بيانات مفصلة عن محتوى الـ LD، مع استخدام الأدوات المتاحة عادة وأدوات برامج تحليل الصور. توجد العديد من مهام سير العمل التحليل التي تتميز بدرجات مختلفة من التطور والأتمتة في الكشف عن الخلايا /LD من بيانات الصورة، ويتم تحسينها لأنواع الخلايا المختلفة، مثل الخلايا الميتازوانية مع LDs كبيرة19،20 , 21، أو الخمائر الناشئة17،22،23. بعض هذه النهج تعمل فقط في 2D (على سبيل المثال، على صور الإسقاط القصوى)، والتي قد تفشل في وصف موثوق محتوى LD الخلوية. على حد علمنا، لا توجد أدوات لتحديد محتوى LD ومورفولوجيا من البيانات المجهرية الخميرة الانشطارية. ومن شأن وضع تحليلات آلية وقوية على مستوى الـ LD أن يجلب حساسية متزايدة وقوة إحصائية معززة، وأن يوفر معلومات غنية عن المحتوى المحايد للدهون، من الناحية المثالية في أنواع الخميرة المتعددة.
لقد قمنا بتطوير سير عمل لتحليل محتوى LD من الصور المجهرية الفلورية ثلاثية الأبعاد لخلايا الخميرة. الخلايا الحية ملطخة بـ BODIPY 493/503 وCascade Blue dextran لتصور LDs وتحديد حدود الخلايا، على التوالي. يتم تعطيل الخلايا على الشرائح الزجاجية وتخضع لتصوير z-stack باستخدام مجهر اللافلورية القياسية. ثم تتم معالجة الصور بواسطة خط أنابيب آلي يتم تنفيذه في MATLAB، وهي مجموعة (تجارية) تستخدم على نطاق واسع للتحليلات الإحصائية. يقوم خط الأنابيب بإجراء المعالجة المسبقة للصور، والتجزئة (الخلايا مقابل الخلفية، وإزالة الخلايا الميتة)، وتحديد LD. ثم يتم توفير البيانات الغنية على مستوى LD، مثل حجم LD وكثافة الفلورة، في شكل جدول يتوافق مع أدوات برامج جداول البيانات الرئيسية. تم استخدام سير العمل بنجاح لتحديد تأثير توافر مصدر النيتروجين على استقلاب الدهون في S. pombe24. نحن الآن تبين وظيفة سير العمل في S. pombe, S. japonicus و S. cerevisiae, باستخدام ظروف النمو أو المتحولين التي تؤثر على محتوى LD الخلوية.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

التمثيل الغذائي للدهون وتنظيمها هي ذات أهمية لكل من علوم الحياة الأساسية والتطبيقية والتكنولوجيا الحيوية. في هذا الصدد، وتستخدم أنواع الخميرة المختلفة كنماذج في البحوث الأيضية الدهون أو لإنتاج الدهون الصناعية. قطرات الدهون هي هيئات تخزين ديناميكية للغاية ومحتواها الخلوي يمثل قراءة مريحة للدولة الأيضية الدهون. التنظير المجهري الفلوري هو طريقة مفضلة للتحليل الكمي لقطرات الدهون الخلوية، كما أنه يعتمد على المعدات المتاحة على نطاق واسع ويسمح بتحليل قطرات الدهون الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تحليل الصور المجهرية آلية، مما يزيد إلى حد كبير من الإنتاجية العامة للتحليل. هنا، ونحن نصف سير العمل التجريبية والتحليلية للكشف الآلي والوصف الكمي لقطرات الدهون الفردية في ثلاثة أنواع مختلفة من الخميرة النموذجية: الخمائر الانشطارية Schizosaccharomyces pombe و Schizosaccharomyces japonicus، والخميرة الناشئة Saccharomyces سيريفيسياي. يتم تصور قطرات الدهون مع BODIPY 493/503، ويتم إضافة dextran الفلورسنت غير قابل للنفاذ ية الخلية إلى وسائل الإعلام الثقافية للمساعدة في تحديد حدود الخلية. تخضع الخلايا للميكروسكوب الظهارة ثلاثية الأبعاد في القنوات الخضراء والزرقاء ويتم معالجة الصور z-stack الناتجة تلقائيًا بواسطة خط أنابيب MATLAB. وناتج هذا الإجراء بيانات كمية غنية عن محتوى قطرات الدهون الخلوية وخصائص قطرات الدهون الفردية في شكل جدولي مناسب للتحليلات النهائية في جداول البيانات الرئيسية أو الحزم الإحصائية. نحن نقدم أمثلة تحليلات لمحتوى قطرات الدهون في ظل ظروف مختلفة تؤثر على استقلاب الدهون الخلوية.

ويرد موجز للإجراء كله في الشكل 1 للخمائر الانشطارية (سير عمل الخميرة الناشئة مماثلة)، وفيما يلي نقدم أمثلة على كيفية استخدام سير العمل لدراسة محتوى LD في ثلاثة أنواع مختلفة من الخميرة في ظل ظروف مختلفة معروفة للتأثير على محتوى LD الخلوية. ويمثل كل مثال تجربة بيولوجية واحدة....

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

هنا، نقدم تنفيذ MATLAB للكشف الآلي والوصف الكمي لقطرات الدهون في الصور المجهرية الفلورية من الانشطار وخلايا الخميرة الناشئة.

تحليل محتوى قطرات الدهون في الانشطار والخمائر الناشئة باستخدام المعالجة الآلية للصور

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

يسهل هذا البروتوكول التحليلات الكمية الصغيرة إلى الكبيرة لمحتوى الدهون في التخزين الخلوي في مجموعة متنوعة من أنواع الخميرة ويقوم بذلك بطريقة غير متحيزة وموحدة. وتسمح هذه التقنية بالتجهيـز السريع للصور المجهرية وتوفر مخرجات كمية مفصلة لمقارنة العينات بسهولة مثل مختلف المسوخ والخلايا التي تزرع في ظل ظروف متنوعة. لتبدأ، اتبع على طول في بروتوكول النص المصاحب لإعداد حلول تلطيخ، وسائل الإعلام والثقافة، والخلايا.تأكد من أن الخلايا صحية وفي مرحلة النمو المطلوبة قبل تشغيل التجربة. بعد ذلك، قم بإعداد غطاء مجهري لكل عينة ليتم تصويرها. انتشار ميكرولتر واحد من حل طلاء الشريحة على غطاء نظيف باستخدام الجانب الطويل من طرف ماصة وضع أفقيا.السماح للطلاء حل لتجف تماما، ومن ثم تخزين الأغطية في بيئة خالية من الغبار. بعد ذلك، قم بقياس الكثافة البصرية لثقافات الخلايا، ولكي يتم تحليل الثقافات في نفس مرحلة النمو، حاول الوصول إلى قيم مماثلة بين جميع الثقافات المختبرة لضمان ظروف تجريبية قابلة للمقارنة. ثم، ماصة ملليلتر واحد من ثقافة الخلية في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.بالنسبة لخلايا S.cerevisiae فقط، أضف خمسة ميكروليتر من حل طلاء الشريحة إلى الأنبوب أيضًا. ثم، دوامة لفترة وجيزة كل من أنابيب microcentrifuge، واحتضان لهم في 30 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من حل تلطيخ الدهون لكل aliquot الثقافة، ودوامة لهم لفترة وجيزة.ثم، إضافة 10 ميكرولترات من حل التصور حدود الخلية، ودوامة لهم لفترة وجيزة مرة ثانية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لهم في 1،000 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء من الغزل، وإزالة 950 ميكرولترات من السوبر و resuspend الخلايا في السوبر المتبقية باستخدام ماصة.بعد ذلك ، ماصة اثنين من microliters من تعليق الخلية الكثيفة على غطاء المغلفة الليكتين. ثم، ضع الغطاء على شريحة مجهرية نظيفة لتشكيل أحادي الخلية، ثم انتقل إلى المجهر في أسرع وقت ممكن لتقليل القطع الأثرية في التصوير. يتطلب إعداد المجهر التعرض الطويل لمصادر الضوء القوية التي يمكن أن تسبب تلفًا للعينة والنتائج المنحرفة.لذلك، قم بإعداد ظروف التصوير باستخدام شريحة عينة مخصصة لن يتم استخدامها بشكل أكبر في القياس الكمي لقطر الدهون. ضع العينة المخصصة على مرحلة إعداد مجهر التباين على النقيض من المرحلة أو التداخل التفاضلي ، وركز على الخلايا. في برنامج المجهر، قم بتعيين إعدادات Z-المكدس بحيث تمتد على حجم الخلية بالكامل.تعتمد المسافة العمودية الإجمالية على حجم الخلية، ويعتمد عدد الشرائح البصرية على الفتحة العددية للهدف. بعد ذلك، حدد التركيز للانتقال بالنسبة إلى مستوى التركيز المركزي. لصورة قطرات الدهون، تعيين تجريبيا شدة الضوء ووقت التعرض في القناة الخضراء.كن حذرا عند التصوير، كما BODIPY هو fluorochrome مشرق جدا التي قد تكون سريعة photobleached. بالإضافة إلى ذلك، تقليل وقت التعرض لتجنب التشبع المفرط. التقاط كامل قناة خضراء Z-المكدس أولا قبل التحول إلى القناة الزرقاء لمنع طمس قطرات الدهون المحمولة.إلى حدود الخلية الصورة، تعيين تجريبيا شدة الضوء ووقت التعرض في القناة الزرقاء. إن أمكن، قم بإعداد واستخدام سير عمل تجريبي آلي في برنامج التحكم بالمجهر لتسهيل تصوير عينات متعددة في ظل ظروف موحدة. الأهم من ذلك، يجب الحصول على جميع الصور باستخدام نفس الإعدادات للسماح للمقارنة المناسبة بين العينات.بمجرد تحسين ظروف التصوير، ركز على الخلايا وصورها في كل من القناتين الخضراء والزرقاء. صورة حقول عرض متعددة لكل عينة للحصول على بيانات قوية وتمثيلية. حفظ الصور الزرقاء والأخضر قناة Z المكدس كملفات TIFF متعددة الطبقات 16 بت.تأكد من تضمين الكلمات الأخضر أو الأزرق في أسماء الملفات المقابلة. افتح الصور المجهرية في ImageJ، وأزل أي رصات صور تحتوي على عدد كبير من الخلايا التي انتقلت أثناء الاستحواذ. هذه تظهر في مواضع مختلفة في أقسام Z الفردية.بعد ذلك، قم بإزالة أي رصات صور تحتوي على جزيئات غير خلية عالية الفلورسنت في القناة الزرقاء. وغالبا ما يحدث ذلك بسبب الأوساخ على سطح التصوير أو الشوائب في وسط الزراعة وقد تتداخل مع الكشف عن الخلايا في المناطق المجاورة لها. أيضا، إزالة أي مكدسات الصورة التي تحتوي على نسبة كبيرة من الخلايا الميتة.هذه الصور سوف تعرض الخلايا مع زيادة الفلورس الأزرق مقارنة مع الخلايا الحية. في حين أن وجود عدد قليل من الخلايا الميتة في العينة عادة ليست مشكلة ويتم تجاهل هذه الخلايا تلقائيا أثناء التحليل، قد يتم التعرف أحيانا بعض الخلايا الميتة أو المحتضرة كخلايا حية من قبل خوارزمية التجزئة وبالتالي انحراف النتائج المبلغ عنها. لبدء التحليل في MATLAB ، أولا إنشاء مجلد رئيسي ونسخ جميع البرامج النصية MATLAB لهذا الموقع.بعد ذلك، إنشاء المجلدات الفرعية مع أسماء أنواع الخميرة المختلفة، ونسخ الصور TIFF المعنية إلى هذه المواقع. الآن، بدء MATLAB، فتح البرنامج النصي MAIN. m، وتشغيل البرنامج النصي.في القائمة، حدد أنواع الخميرة ليتم تحليلها وبدء معالجة الصور. فحص ومعالجة ملفات الإخراج كما هو مطلوب باستخدام محرر جدول بيانات أو حزمة إحصائية. ينتج سير العمل ملفات CSV مفصولة بفواصل منقوطة وملفات TIFF مجزأة مع كائنات الخلايا التي تم اكتشافها وقطرات الدهون.تظهر هنا هي البرية من نوع S.pombe الخلايا التي نمت في إما متوسطة YES معقدة أو متوسطة EMM محددة. بالمقارنة مع الخلايا التي تزرع في وسط YES، تم الكشف عن عدد أقل من قطرات الدهون وكثافة تلوين أعلى لكل وحدة من حجم الخلية في وسط EMM. وعلاوة على ذلك، كانت قطرات الدهون الفردية التي تشكلت في المتوسط EMM أكبر وعرض زيادة كثافة تلطيخ الكلي.هذا يتفق مع النتائج السابقة لزيادة محتوى الدهون المخزنة في الخلايا التي تزرع في EMM. بعد ذلك ، تظهر هذه الصور خلايا S.japonicus من الثقافات الأسية والمحطة المبكرة التي نمت في وسيط YES. وأظهرت الخلايا التي تدخل مرحلة ثابتة انخفاضا ملحوظا في عدد قطرات الدهون لكل وحدة من حجم الخلية في حين أن حجم تطبيع كثافة الفلور الفلوري قطرات الدهون انخفض قليلا بين الشرطين.وكانت قطرات الدهون في المراحل الأولى من المراحل الثابتة عادة أكبر حجماً بشكل معتدل وكانت كثافة الفلورس الكلية أعلى بشكل معتدل مقارنة بالقطرات من الخلايا المتنامية بشكل كبير. في خلايا S.cerevisiae نمت إلى الطور الأسي مقابل الحطة، تحتوي الخلايا الثابتة على عدد أقل إلى حد ما من قطرات الدهون لكل وحدة من الحجم مقارنة بالخلايا المتنامية بشكل كبير. ومع ذلك ، تضاعفت كثافة الفلورية القطرة التي تم تطبيعها بالحجم تقريبًا.هذه الزيادة الحادة في المحتوى الكلي من قطرات الدهون يرجع إلى كثافة الفلورانس أعلى بكثير وحجم قطرات الدهون الفردية في المرحلة الثابتة. بعد هذا الإجراء، يمكن تجميع بيانات المخرجات في حزمة إحصائية مثل R لإنشاء مخططات للنتائج الموجزة وإجراء اختبارات إحصائية على أي اختلافات ملحوظة في محتوى قطرات الدهون. من حيث المبدأ، يمكن استخدام خط أنابيب معالجة الصور لتحليل محتوى قطرات الدهون في الكائنات الحية الدقيقة الأخرى أو لتحليل هياكل أخرى شبه نقطة الخلايا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

تحديد الهياكل الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية جليكوبروتينات مغلف باستخدام البرد الكترون والتصوير المقطعي الآلي متوسط ​​الفرعية صورة مقطعية

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

التصوير من HIV-1 مغلف من صنع المشبك الفيروسية، واشارة على طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

تسهيل اكتشاف المخدرات: مؤتمتة فحص التهاب عالية المحتوى في الزرد

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

نهج مؤتمتة شبه لإعداد الجسم المضاد الكوكتيلات لتحليل Immunophenotypic في الدم المحيطي الإنسان

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

التلقائي القائم علي الصورة الكمية من الفخاخ العدلات خارج الخلية باستخدام NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

الآلي التحليل السلوكي لكبير C. ايليجانس السكان استخدام واسعة مجال-من-عرض "تتبع النظام الأساسي"

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...