Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 og SVV 260310. Vi takker Ondřej Šebesta for hjælp med mikroskopi og udvikling af billedet analyse pipeline. Vi takker ReGenEx Lab for s. cerevisiae stammer, og Japonet og Hironori niki's Lab for s. japonicus stammer. Ppc1-88 stammen blev leveret af gær genetiske ressource center Japan. Mikroskopi blev udført i laboratoriet for Konfokal-og Fluorescens mikroskopi, der var medfinansieret af den europæiske fond for regional udvikling og Den Tjekkiske Republiks statsbudget (projekt nr. CZ. 1,05/4.1.00/16.0347 og CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. forberedelse af løsninger og medier
<ol><li>
Forbered lipid farvning opløsning.
	<ol>
<li>For at forberede bestanden lipid farvningsopløsning opløses 10 mg BODIPY 493/503 i 10 mL vandfri DMSO (slutkoncentration 1 mg/mL). Hele indholdet af et 10 mg BODIPY 493/503-hætteglas opløses for at forhindre tab af materiale under vejning. Forsigtig: DMSO kan passere gennem huden. Bær passende personlige værnemidler.</li>
		<li>Forbered fungerende lipid-farvningsopløsning ved at bla...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

Forståelsen af lipid metabolisme og dens regulering er vigtig for både grundlæggende biologi, og kliniske og bioteknologiske anvendelser. LD-indhold repræsenterer en bekvem aflæsning af lipid metabolisme tilstand af cellen, med Fluorescens mikroskopi er en af de vigtigste metoder, der anvendes til LD indhold bestemmelse. Den præsenterede protokol giver mulighed for automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af individuelle LDs i tre forskellige og morfologisk adskilte gærarter. Til vores viden findes der i...

Lipiderne spiller afgørende roller i cellulære energi og kulstof metabolisme, syntese af membran komponenter, og produktion af bioaktive stoffer. Lipid metabolisme er finjusteret i henhold til miljømæssige forhold, næringsstof tilgængelighed og celle-cyklus fase1. Hos mennesker, lipid metabolisme har været forbundet med sygdomme, såsom fedme, type II diabetes og kræft2. I industrien udgør lipider fremstillet af mikroorganismer, såsom gær, en lovende kilde til vedvarende dieselolie3. Cellerne lagrer neutrale lipiderne i såkaldte lipid-dråber (LDs). Disse evolutionært bevaret organer er sammensat af triacylglyceroler, steryl estere, en ydre phospholipid enkeltlags og tilhørende proteiner1. LDs har oprindelse i endoplasmatiske reticulum, udøver celle-cyklus eller vækst-fase dynamik, og er vigtige for cellulære lipid homøostase1. LD nummer og morfologi kan bruges som en bekvem proxy, når bestemmelse lipid metabolisme under forskellige vækstbetingelser eller når screening et panel af mutanter. I betragtning af deres dynamiske karakter, teknikker i stand til at analysere egenskaberne af de enkelte LDs er af særlig interesse i undersøgelser af lipid metabolisme.
Forskellige gærarter er blevet brugt til at beskrive lipid-relaterede metaboliske veje og deres regulering, eller anvendes i bioteknologi til at producere interessante forbindelser eller brændstoffer1. Endvidere, for model gær, såsom spirende gær Saccharomyces cerevisiae eller den fjernt relateret fission gær Schizosaccharomyces pombe, Genome-Wide sletning stamme biblioteker er tilgængelige, der kan bruges til high-gennemløb skærmbilleder4,5. For nylig ld sammensætning og dynamik er blevet beskrevet i S. pombe6,7,8,9, og mutanter relateret til lipid metabolisme er blevet isoleret i den spirende model gær Schizosaccharomyces japonicus10.
Der findes talrige teknikker til undersøgelse af LD-indhold og-dynamik. De fleste ansætte en form for farvning af LDs med lipofile farvestoffer såsom Nilen rød eller BODIPY 493/503. Sidstnævnte viser mere smalle excitation og emission spektre, og øget specificitet mod neutrale lipiderne (LDs) i modsætning til fosfolipider (membraner)11. Fluorimetriske og flow-cytometri metoder er blevet anvendt med succes i forskellige svampearter til at afdække gener og vækstbetingelser, der påvirker opbevaring lipid indhold12,13,14,15. Disse metoder egner sig til applikationer med høj kapacitet, men de kan ikke måle antallet og morfologien af individuelle LDs i celler, som kan variere dramatisk mellem vækstbetingelser og genotyper. Sammenhængende Raman spredning eller digital holografisk mikroskopi er label-fri metoder, der giver ld-niveau data, men kræver specialiseret dyrt udstyr16,17,18. Fluorescens mikroskopi, på den anden side, kan give detaljerede data om LD indhold, samtidig udnytte almindeligt tilgængelige instrumenter og billedanalyse software værktøjer. Flere analyse arbejdsgange findes, der har forskellige grader af raffinement og automatisering i celle/ld detektion fra billeddata, og er optimeret til forskellige celletyper, såsom metazoiske celler med store LDs19,20 , 21, eller spirende gær17,22,23. Nogle af disse tilgange virker kun i 2D (f. eks. på maksimale projektion billeder), som kan ikke pålideligt beskrive cellulært LD indhold. Til vores viden, findes der ingen værktøjer til bestemmelse af LD indhold og morfologi fra fission gær mikroskopiske data. Udvikling af automatiserede og robuste LD-niveau analyser vil give øget følsomhed og øget statistisk effekt, og give rig information om neutralt lipid indhold, ideelt i flere gærarter.
Vi har udviklet en arbejdsgang for LD-indholdsanalyse fra 3D Fluorescens mikroskopi billeder af gærceller. Levende celler er farvet med BODIPY 493/503 og Cascade Blue dextran at visualisere LDs og bestemme cellegrænser, hhv. Cellerne er immobiliseret på glas slides og udsat for z-stack Imaging ved hjælp af en standard epifluorescens mikroskop. Billeder behandles derefter af en automatiseret pipeline implementeret i MATLAB, en meget brugt (kommerciel) pakke til statistiske analyser. Pipelinen udfører billedforbehandling, segmentering (celler vs. baggrund, fjernelse af døde celler) og LD-identifikation. Fyldige data på LD-niveau, såsom LD-størrelse og fluorescens intensitet, leveres derefter i et tabelformat, der er kompatibelt med større regnearkssoftware værktøjer. Arbejdsprocessen blev brugt med succes til at bestemme virkningen af kvælstof kilde tilgængelighed på lipid metabolisme i S. pombe24. Vi demonstrerer nu funktionaliteten af arbejdsprocessen i s. pombe, s. japonicus og s. cerevisiaeved hjælp af vækstbetingelser eller mutanter, der påvirker cellulært LD-indhold.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

Lipid metabolisme og dens regulering er af interesse for både grundlæggende og anvendt biovidenskab og bioteknologi. I denne forbindelse anvendes forskellige gærarter som modeller i lipid metaboliske forskning eller til industriel lipid produktion. Lipid dråber er meget dynamiske opbevarings organer og deres cellulære indhold repræsenterer en bekvem aflæsning af lipid metaboliske tilstand. Fluorescens mikroskopi er en metode til valg af kvantitativ analyse af cellulære lipid dråber, da den er afhængig af bredt tilgængeligt udstyr og giver mulighed for analyse af individuelle lipid dråber. Desuden kan mikroskopisk billedanalyse automatiseres, hvilket i høj grad øger den samlede analysekapacitet. Her beskriver vi en eksperimentel og analytisk arbejdsgang for automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af individuelle lipid dråber i tre forskellige model gærarter: fissions gær Schizosaccharomyces pombe og Schizosaccharomyces japonicus, og den spirende gær Saccharomyces cerevisiae. Lipid dråber visualiseret med BODIPY 493/503, og celle-impermeable fluorescerende dextran tilsættes til kultur medierne for at hjælpe med at identificere cellegrænser. Cellerne udsættes for 3D-epifluorescens mikroskopi i grønne og blå kanaler, og de resulterende z-stack-billeder behandles automatisk af en MATLAB-rørledning. Proceduren udsender rige kvantitative data om cellulære lipid dråbe indhold og individuelle lipid dråbe egenskaber i et tabelformat, der egner sig til downstream-analyser i større regneark eller statistiske pakker. Vi giver eksempel analyser af lipid dråbe indhold under forskellige forhold, der påvirker cellulære lipid metabolisme.

Hele proceduren er opsummeret i figur 1 for fissions gær (den spirende gær workflow er analog), og nedenfor giver vi eksempler på, hvordan arbejdsprocessen kan bruges til at studere ld-indhold i tre forskellige gærarter under forskellige forhold, der er kendt at påvirke cellulært LD-indhold. Hvert eksempel repræsenterer et enkelt biologisk eksperiment.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59889/59889fig...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Her præsenterer vi en MATLAB implementering af automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af lipid dråber i Fluorescens mikroskopi billeder af fission og spirende gærceller.

Analyse af lipid dråbe indhold i fission og spirende gær ved hjælp af automatiseret billedbehandling

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Denne protokol letter kvantitative små til store analyser af cellulære opbevaring lipid indhold i en række gær arter og gør det på en upartisk og standardiseret måde. Teknikken giver mulighed for hurtig behandling af mikroskopiske billeder og giver detaljerede kvantitative output til nemt at sammenligne prøver såsom forskellige mutanter og celler dyrket under forskellige forhold. Til at begynde med skal du følge med i den medfølgende tekstprotokol for at forberede farvningsløsninger, kulturmedier og celler.Sørg for, at cellerne er sunde og i den ønskede vækstfase, før eksperimentet køres. Derefter skal du forberede et mikroskop coverslip for hver prøve, der skal afbildes. Spred en mikroliter af glidebelægningsopløsning på en ren dækslæb ved hjælp af den lange side af en vandret placeret pipettespids.Lad belægningsopløsningen tørre helt, og opbevar derefter dæksprækkerne i et støvfrit miljø. Dernæst måle de optiske tætheder i cellekulturerne, og for kulturer, der skal analyseres i samme vækstfase, så prøv at nå lignende værdier blandt alle testede kulturer for at sikre sammenlignelige eksperimentelle betingelser. Derefter pipette en milliliter af cellekulturen i et 1,5-milliliter mikrocentrifugerør.For S.cerevisiae celler kun, tilføje fem mikroliter af dias belægning løsning til røret så godt. Derefter kort vortex alle de mikrocentrifuge rør, og inkubere dem ved 30 grader Celsius med omrystning i fem minutter. Dernæst tilsættes en mikroliter af lipid farvning løsning til hver kultur aliquot, og vortex dem kort.Derefter tilsættes 10 mikroliter af cellegrænsevisualiseringsløsningen, og vortex dem kort en anden gang. Indsamle cellerne ved centrifugering dem på 1,000 gange tyngdekraften i tre minutter ved stuetemperatur. Når du er færdig med at spinde, skal du fjerne 950 mikroliter fra supernatanten og opsbruge cellerne i den resterende supernatant ved hjælp af en pipette.Dernæst pipette to mikroliter af den tætte celle suspension på en lectin-belagt coverslip. Derefter placeres dækslæbet på et rent mikroskop dias for at danne en cellemonstolog, og fortsæt til mikroskopi så hurtigt som muligt for at minimere artefakter i billeddannelse. Opsætning af mikroskopet kræver lange eksponeringer for stærke lyskilder, der kan forårsage skade på prøven og skæve resultater.Derfor skal du konfigurere billeddannelsesbetingelserne ved hjælp af et dedikeret eksempeldias, der ikke yderligere vil blive brugt til lipiddråbekvantificering. Placer den dedikerede prøve på scenen af en fase kontrast eller differential interferens kontrast mikroskop setup, og fokusere på cellerne. I mikroskopets software skal du indstille Z-stack-indstillingerne, så de strækker sig over hele cellevolumenet.Den samlede lodrette afstand afhænger af cellestørrelsen, og antallet af optiske udsnit afhænger af den numeriske blændeåbning af målsætningen. Dernæst skal du indstille fokus til at flytte i forhold til det centrale brændpunkt. For at afbilde lipiddråber skal lysintensiteten og eksponeringstiden i den grønne kanal indstilles eksperimentelt.Vær forsigtig, når billeddannelse, som BODIPY er en meget lys fluorrom, der kan hurtigt fotobleached. Minimer desuden eksponeringstiden for at undgå overmætning. Fang den fulde grønne kanal Z-stack først, før du skifter til den blå kanal for at forhindre sløring af de mobile lipiddråber.Til billedcellegrænser skal du eksperimentelt indstille lysintensiteten og eksponeringstiden i den blå kanal. Hvis det er muligt, skal du konfigurere og bruge en automatiseret eksperimentel arbejdsgang i mikroskopkontrolsoftwaren for at lette billeddannelse af flere prøver under standardiserede forhold. Det er vigtigt, at alle billeder skal anskaffes ved hjælp af de samme indstillinger for at muliggøre en passende sammenligning mellem prøverne.Når billeddannelsesforholdene er optimeret, skal du fokusere på cellerne og afbilde dem i både de grønne og blå kanaler. Billede flere synsfelter pr. eksempel for at få robuste, repræsentative data. Gem de blå og grønne billeder fra Z-stack som 16-bit TIFF-filer med flerelag.Sørg for at medtage ordene grøn eller blå i de tilsvarende filnavne. Åbn mikroskopiske billeder i ImageJ, og fjern alle billedstakke, der indeholder et betydeligt antal celler, der flyttede under erhvervelsen. Disse vises på forskellige positioner i de enkelte Z sektioner.Fjern derefter alle billedstakke, der indeholder meget fluorescerende ikke-cellepartikler i den blå kanal. Dette er ofte forårsaget af snavs på billeddannelse overflade eller urenheder i dyrkningsmediet og kan forstyrre påvisning af celler i deres nærhed. Fjern også alle billedstakke, der indeholder en stor del af døde celler.Disse billeder vil vise celler med øget blå fluorescens i forhold til de levende celler. Mens tilstedeværelsen af et par døde celler i prøven er typisk ikke et problem, og disse celler automatisk kasseres under analyse, nogle døde eller døende celler kan lejlighedsvis blive anerkendt som levende celler af segmentering algoritme og dermed skæve de rapporterede resultater. Hvis du vil begynde at analysere i MATLAB, skal du først oprette en hovedmappe og kopiere alle MATLAB-scripts til denne placering.Derefter skal du oprette undermapper med navnene på de forskellige gærarter og kopiere de respektive TIFF-billeder til disse placeringer. Start MATLAB, åbn scriptet MAIN. m, og kør scriptet.Vælg den gærart, der skal analyseres, i menuen, og start billedbehandling. Undersøg og bearbejde outputfilerne efter behov ved hjælp af en regnearkseditor eller statistisk pakke. Arbejdsprocessen producerer semikolonseparerede CSV-filer og segmenterede TIFF-filer med registrerede celleobjekter og lipiddråber.Vist her er wild-type S.pombe celler, der blev dyrket i enten den komplekse YES medium eller den definerede EMM medium. Sammenlignet med celler dyrket i YES-mediet blev der påvist færre lipiddråber og højere farvningsintensitet pr. cellevolumenenhed i EMM-mediet. Desuden var individuelle lipiddråber dannet i EMM medium større og viste en øget total farvning intensitet.Dette er i overensstemmelse med tidligere resultater af øget lagret lipidindhold i celler dyrket i EMM. Dernæst viser disse billeder S.japonicus celler fra eksponentielle og tidlige stationære kulturer dyrket i JA medium. Celler, der gik ind i den stationære fase, viste et markant nedsat antal lipiddråber pr. cellevolumenenhed, mens volumenalvanaliseret lipidddroppelfluorescensintensiteten faldt en smule mellem de to betingelser.De tidlige lipiddråber i den stationære fase var typisk moderat større i størrelse og havde moderat højere total fluorescensintensitet sammenlignet med dråber fra eksponentielt voksende celler. I S.cerevisiae celler dyrket til eksponentiel versus stationær fase, stationære celler indeholdt noget færre lipid dråber pr enhed af volumen i forhold til eksponentielt voksende celler. Men deres volumen-normaliseret dråbefluorescens intensitet næsten fordoblet.Denne kraftige stigning i det samlede fedtdråbeindhold skyldtes den meget højere fluorescensintensitet og volumen af individuelle lipiddråber i stationær fase. Efter denne procedure kan outputdata aggregeres i en statistisk pakke som R for at oprette områder med opsummerede resultater og køre statistiske test af eventuelle observerede forskelle i lipiddråbeindhold. I princippet kan billedbehandlingspipelinen bruges til analyse af lipiddråbeindhold i andre mikroorganismer eller til at analysere andre dot-lignende subcellulære strukturer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bestemmelse af molekylære strukturer af HIV Konvolut glycoproteiner med Cryo-Electron Tomography og Automatiseret Sub-tomogram Gennemsnitsberegnings

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Scanning af HIV-1 Envelope-induceret Virologisk Synapse og signaler på syntetiske lipiddobbeltlagenes

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Lettere Drug Discovery: En automatiseret High-indhold Betændelse Assay i zebrafisk

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolation, behandling og analyse af murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En Semi-automatiske tilgang til Forberedelse Antibody Cocktails for immunfænotypisk Analyse af Human Perifer Blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering af Biofilmdannelse i Candida albicans ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatiseret billedbaseret kvantificering af neutrofile ekstracellulære fælder med NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiseret adfærdsmæssige analyse af store C. elegans befolkninger ved hjælp af et bredt synsfelt sporer Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Billedbehandling protokol for analysen af Diffusion og Cluster størrelse af membranreceptorer af Fluorescens mikroskopi

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...