Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Karelsuniversiteit subsidies PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 en SVV 260310. We danken Ondřej Šebesta voor hulp met microscopie en ontwikkeling van de pijplijn voorbeeld analyse. We danken het ReGenEx Lab voor s. cerevisiae stammen, en Japonet en Hironori niki's Lab voor s. japonicus stammen. De ppc1-88 stam werd geleverd door het gist genetische hulpmiddel centrum Japan. Microscopie werd uitgevoerd in het laboratorium voor confocale en fluorescentiemicroscopie, gecofinancierd door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling en de staatsbegroting van de Tsjechische Republiek (Projectnr. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 en CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. voorbereiding van oplossingen en media
<ol><li>
Bereid lipide-kleurings oplossing.
	<ol>
<li>Voor het bereiden van de lipide-kleurenoplossing Los 10 mg BODIPY 493/503 op in 10 mL watervrije DMSO (uiteindelijke concentratie 1 mg/mL). Los de volledige inhoud van een 10 mg BODIPY 493/503 injectieflacon op om verlies van materiaal tijdens het wegen te voorkomen. Let op: DMSO kan passeren de huid. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
		<li>Bereid werk lipiden kleuri...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

Het begrip van lipide metabolisme en de regulering ervan is belangrijk voor zowel de basis biologie, en klinische en biotechnologische toepassingen. LD-gehalte staat voor een handige uitlezen van de vetmetabolisme toestand van de cel, met fluorescentiemicroscopie als een van de belangrijkste methoden die worden gebruikt voor de bepaling van LD-inhoud. Het gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van individuele LDs in drie verschillende en morfologisch verschillende gist soort...

Lipiden spelen cruciale rollen in cellulaire energie en koolstof metabolisme, synthese van membraan componenten, en productie van bioactieve stoffen. Lipide metabolisme is fijnafgesteld volgens omgevingscondities, beschikbaarheid van nutriënten en fase1van de celcyclus. Bij de mens, lipide metabolisme is verbonden met ziekten, zoals obesitas, diabetes type II en kanker2. In de industrie vormen lipiden die door micro-organismen worden geproduceerd, zoals gisten, een veelbelovende bron van hernieuwbare dieselbrandstoffen3. Cellen slaan neutrale lipiden op in zogenaamde lipide druppeltjes (LDs). Deze evolutionair behouden lichamen zijn samengesteld uit triacylglycerolen, steryl esters, een buitenste fosfolipide monolaag en geassocieerde eiwitten1. LDs zijn afkomstig uit het endoplasmisch reticulum, oefenen celcyclus of groeifase dynamiek, en zijn belangrijk voor cellulaire lipide homeostase1. LD-nummer en morfologie kan worden gebruikt als een handige proxy wanneer het lipide metabolisme onder verschillende groeiomstandigheden of bij het screenen van een panel van mutanten. Gezien hun dynamische karakter zijn technieken die de eigenschappen van individuele LDs kunnen analyseren van bijzonder belang in onderzoeken naar lipide-metabolisme.
Verschillende gist soorten zijn gebruikt om lipide-gerelateerde metabole trajecten en hun regulering te beschrijven, of gebruikt in de biotechnologie om interessante verbindingen of brandstoffen te produceren1. Bovendien zijn voor model gisten, zoals de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae of de ver verwante Splijtings gist schizosaccharomyces pombe, genoom-Wide deletie stam bibliotheken beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor hoge doorvoer schermen4,5. Onlangs is LD samenstelling en dynamiek beschreven in S. pombe6,7,8,9, en mutanten gerelateerd aan lipide metabolisme zijn geïsoleerd in de opkomende model gist Schizosaccharomyces japonicus10.
Er zijn tal van technieken beschikbaar om LD-inhoud en-dynamiek te bestuderen. De meesten gebruiken een soort kleuring van LDs met lipofiele kleurstoffen zoals Nile Red of BODIPY 493/503. De laatste toont meer nauwe excitatie en emissiespectra, en verhoogde specificiteit naar neutrale lipiden (LDs) in tegenstelling tot fosfolipiden (membranen)11. Fluorimetrische en flow-cytometrie methoden zijn met succes gebruikt in verschillende schimmelsoorten om genen en groeiomstandigheden te achterhalen die invloed hebben op opslag lipide-inhoud12,13,14,15. Hoewel deze methoden geschikt zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer, kunnen ze de aantallen en morfologie van afzonderlijke LDs in cellen niet meten, wat dramatisch kan verschillen tussen groeiomstandigheden en genotypes. Coherente Raman verstrooiing of digitale holografische microscopie zijn label vrije methoden die LD-niveau gegevens opleveren, maar vereisen gespecialiseerde dure apparatuur16,17,18. Fluorescentiemicroscopie, aan de andere kant, kan gedetailleerde gegevens verstrekken over LD-inhoud, terwijl gebruik wordt makend van algemeen beschikbare instrumenten en software tools voorbeeld analyse. Er bestaan verschillende analyse werkstromen met verschillende gradaties van verfijning en automatisering in cel/LD-detectie van afbeeldingsgegevens, en zijn geoptimaliseerd voor verschillende celtypen, zoals metazoan-cellen met grote LDS19,20 , 21, of ontluikende gisten17,22,23. Sommige van deze benaderingen werken alleen in 2D (bijvoorbeeld bij maximale projectie beelden), die de cellulaire LD-inhoud mogelijk niet betrouwbaar beschrijven. Voor onze kennis bestaan er geen hulpmiddelen voor de bepaling van LD-gehalte en morfologie van de analyse van microscopische gegevens van splijting. De ontwikkeling van geautomatiseerde en robuuste analyses op LD-niveau zou leiden tot meer gevoeligheid en meer statistisch vermogen, en biedt rijke informatie over neutraal lipide-inhoud, idealiter in meerdere gist soorten.
We hebben een workflow ontwikkeld voor LD content analyse van 3D fluorescentiemicroscopie beelden van gistcellen. Levende cellen zijn gekleurd met BODIPY 493/503 en Cascade blauwe dextran om LDs te visualiseren en celgrenzen te bepalen, respectievelijk. Cellen worden geïmmobiliseerd op glazen glijbanen en onderworpen aan z-stack beeldvorming met behulp van een standaard epifluorescentie Microscoop. Afbeeldingen worden vervolgens verwerkt door een geautomatiseerde pijplijn geïmplementeerd in MATLAB, een veelgebruikte (commerciële) pakket voor statistische analyses. De pijplijn voert de voor verwerking van afbeeldingen, segmentatie (cellen versus achtergrond, verwijdering van dode cellen) en LD-identificatie uit. Uitgebreide gegevens op LD-niveau, zoals LD-grootte en fluorescentie-intensiteit, worden vervolgens geleverd in tabelvorm die compatibel is met belangrijke spreadsheet softwaretools. De werkstroom werd met succes gebruikt om te bepalen van de impact van de beschikbaarheid van stikstofbron op lipide metabolisme in S. pombe24. We demonstreren nu de functionaliteit van de workflow in s. pombe, s. japonicus en s. cerevisiae, waarbij gebruik wordt gemaakt van groeicondities of mutanten die het cellulaire LD-gehalte beïnvloeden.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

Lipide metabolisme en de regulering ervan zijn van belang voor zowel elementaire als toegepaste biowetenschappen en biotechnologie. In dit verband, verschillende gist soorten worden gebruikt als modellen in lipide metabolische onderzoek of voor industriële lipide productie. Lipide druppeltjes zijn zeer dynamische opslag lichamen en hun cellulaire inhoud vertegenwoordigt een handige uitlezen van de lipide metabolische toestand. Fluorescentiemicroscopie is een methode van keuze voor kwantitatieve analyse van cellulaire lipide druppeltjes, als het steunt op algemeen beschikbare apparatuur en maakt analyse van individuele lipide druppeltjes. Bovendien, microscopische beeldanalyse kan worden geautomatiseerd, sterk verhogen van de algehele analyse doorvoer. Hier beschrijven we een experimentele en analytische workflow voor geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van individuele lipidedrup pels in drie verschillende model gist soorten: de splijting gisten schizosaccharomyces pombe en Schizosaccharomyces japonicus, en de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Lipide druppeltjes worden gevisualiseerd met BODIPY 493/503, en cel-ondoorlatend fluorescerende dextran wordt toegevoegd aan de cultuur media om celgrenzen te identificeren. Cellen worden onderworpen aan 3D epifluorescentie microscopie in groene en blauwe kanalen en de resulterende z-stack beelden worden automatisch verwerkt door een MATLAB pipeline. De procedure levert uitgebreide kwantitatieve gegevens op cellulaire lipide druppel inhoud en individuele lipide druppel kenmerken in een tabelvorm formaat geschikt voor downstream analyses in grote spreadsheet of statistische pakketten. Wij bieden voorbeeld analyses van lipide druppel inhoud onder verschillende omstandigheden die invloed hebben op cellulaire lipide metabolisme.

De hele procedure wordt samengevat in Figuur 1 voor de fissie gisten (de ontluikende gist werkstroom is analoog), en hieronder geven we voorbeelden van hoe de workflow kan worden gebruikt om ld-gehalte te bestuderen in drie verschillende gist soorten onder verschillende omstandigheden die bekend zijn om de cellulaire LD-inhoud te beïnvloeden. Elk voorbeeld vertegenwoordigt één biologisch experiment.
<img alt="Figure 1" class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Dit protocol vergemakkelijkt kwantitatieve kleinschalige analyses van cellulaire opslag lipide inhoud in een verscheidenheid van gist soorten en doet dit op een onpartijdige en gestandaardiseerde manier. De techniek maakt een snelle verwerking van microscopischkleine beelden mogelijk en biedt gedetailleerde kwantitatieve outputs om gemakkelijk monsters te vergelijken, zoals verschillende mutanten en cellen die onder uiteenlopende omstandigheden worden geteeld. Om te beginnen, volg mee in het bijbehorende tekstprotocol om de kleuroplossingen, cultuurmedia en cellen voor te bereiden.Zorg ervoor dat de cellen gezond zijn en in de gewenste groeifase voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Bereid vervolgens een microscoopcoverslip voor elk monster dat moet worden afgebeeld. Spreid een microliter van schuifcoating oplossing op een schone coverslip met behulp van de lange kant van een horizontaal geplaatste pipet tip.Laat de coatingoplossing volledig drogen en bewaar de covers in een stofvrije omgeving. Vervolgens, meet de optische dichtheden van de celculturen, en voor culturen worden geanalyseerd in dezelfde groeifase, proberen om vergelijkbare waarden te bereiken onder alle geteste culturen om vergelijkbare experimentele omstandigheden te garanderen. Dan, pipet een milliliter van de celcultuur in een 1,5-milliliter microcentrifuge buis.Voor de S.cerevisiae cellen alleen, voeg vijf microliters van de dia coating oplossing aan de buis ook. Dan, kort vortex alle microcentrifuge buizen, en uitbroeden ze op 30 graden Celsius met schudden gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens een microliter van de lipide kleuring oplossing aan elke cultuur aliquot, en vortex ze kort.Voeg vervolgens 10 microliter van de celgrensvisualisatieoplossing toe en draai ze kort een tweede keer. Verzamel de cellen door ze te centrifugeren bij 1.000 keer zwaartekracht gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent met spinnen, verwijder 950 microliter uit de supernatant en resuspend de cellen in de resterende supernatant met behulp van een pipet.Vervolgens pipette twee microliters van de dichte cel suspensie op een lectine gecoate coverslip. Plaats vervolgens de coverslip op een schone microscoopdia om een celmonolaag te vormen en ga zo snel mogelijk naar microscopie om artefacten in beeldvorming te minimaliseren. Het opzetten van de microscoop vereist lange blootstelling aan sterke lichtbronnen die schade aan het monster kunnen veroorzaken en de resultaten kunnen scheeftrekken.Stel daarom de beeldvormingsvoorwaarden in met behulp van een speciale voorbeelddia die niet verder zal worden gebruikt voor kwantificering van lipidedruppels. Plaats het toegewezen monster op het stadium van een fasecontrast of differentiële interferentiecontrastmicroscoopopstelling en focus op de cellen. Stel in de software van de microscoop de Z-stack-instellingen zo in dat ze het hele celvolume overspannen.De totale verticale afstand is afhankelijk van de celgrootte en het aantal optische segmenten is afhankelijk van het numerieke diafragma van de doelstelling. Stel vervolgens de focus in om ten opzichte van het centrale brandpuntsvlak te verplaatsen. Om lipide druppels in beeld te brengen, stel je experimenteel de lichtintensiteit en belichtingstijd in het groene kanaal in.Wees voorzichtig bij beeldvorming, want BODIPY is een zeer helder fluorchroom dat snel kan worden gefotobleached. Bovendien, minimaliseer de blootstellingstijd om oververzadiging te vermijden. Leg eerst de volledige groene kanaalZ-stack vast voordat je overschakelt naar het blauwe kanaal om te voorkomen dat de mobiele lipidedruppels vervagen.Als u celgrenzen wilt weergeven, stelt u de lichtintensiteit en belichtingstijd experimenteel in in het blauwe kanaal. Indien mogelijk, het opzetten en gebruiken van een geautomatiseerde experimentele workflow in de microscoop controle software om beeldvorming van meerdere monsters onder gestandaardiseerde omstandigheden te vergemakkelijken. Belangrijk is dat alle afbeeldingen moeten worden verkregen met dezelfde instellingen om een passende vergelijking tussen de monsters mogelijk te maken.Zodra de beeldvorming voorwaarden zijn geoptimaliseerd, richten op de cellen en beeld ze in zowel de groene en blauwe kanalen. Afbeelding van meerdere weergavevelden per voorbeeld om robuuste, representatieve gegevens te verkrijgen. Sla de blauwe en groene Z-stack-afbeeldingen op als 16-bits, meerlaagse TIFF-bestanden.Zorg ervoor dat u de woorden groen of blauw opneemt in de bijbehorende bestandsnamen. Open microscopische afbeeldingen in ImageJ en verwijder alle afbeeldingsstapels met een aanzienlijk aantal cellen die tijdens de acquisitie zijn verplaatst. Deze worden op verschillende posities in afzonderlijke Z-secties weergegeven.Verwijder vervolgens alle afbeeldingsstapels die zeer fluorescerende niet-celdeeltjes in het blauwe kanaal bevatten. Dit wordt vaak veroorzaakt door vuil op het beeldoppervlak of onzuiverheden in het teeltmedium en kan interfereren met de detectie van cellen in hun omgeving. Verwijder ook afbeeldingenstapels met een groot deel van de dode cellen.Deze beelden tonen cellen met verhoogde blauwe fluorescentie in vergelijking met de levende cellen. Hoewel de aanwezigheid van een paar dode cellen in het monster meestal geen probleem is en deze cellen automatisch worden verwijderd tijdens de analyse, kunnen sommige dode of stervende cellen af en toe worden herkend als levende cellen door het segmentatiealgoritme en dus de gerapporteerde resultaten scheeftrekken. Maak eerst een hoofdmap en kopieer alle MATLAB-scripts naar deze locatie om met de analyse in MATLAB te beginnen.Maak vervolgens submappen met de namen van de verschillende gistsoorten en kopieer de respectievelijke TIFF-afbeeldingen naar deze locaties. Nu, start MATLAB, open het script MAIN. m, en voer het script.Selecteer in het menu de te analyseren gistsoorten en start de beeldverwerking. Inspecteer en verwerk de uitvoerbestanden naar behoefte met behulp van een spreadsheeteditor of statistisch pakket. De werkstroom produceert puntkomma-gescheiden CSV-bestanden en gesegmenteerde TIFF-bestanden met gedetecteerde celobjecten en lipidedruppels.Hier worden wild-type S.pombe cellen getoond die werden gekweekt in het complexe JA-medium of het gedefinieerde EMM-medium. In vergelijking met cellen die in het YES-medium worden gekweekt, werden in het EMM-medium minder lipidedruppels en een hogere kleurintensiteit per celvolume-eenheid gedetecteerd. Bovendien waren individuele lipidedruppels gevormd in het EMM-medium groter en vertoonden ze een verhoogde totale kleurintensiteit.Dit is in overeenstemming met eerdere bevindingen van verhoogde opgeslagen lipide inhoud in cellen geteeld in EMM. Vervolgens tonen deze beelden S.japonicus cellen uit exponentiële en vroeg-stationaire culturen gekweekt in YES medium. Cellen die stationaire fase toonden een aanzienlijk verminderd aantal lipide druppeltjes per eenheid van celvolume, terwijl volume-genormaliseerde lipide druppelfluorescentie intensiteit licht gedaald tussen de twee voorwaarden.De vroege stationaire fase lipide druppels waren meestal matig groter in omvang en had matig hogere totale fluorescentie intensiteit in vergelijking met druppels van exponentieel groeiende cellen. In S.cerevisiae cellen gegroeid tot exponentieel versus stationaire fase, stationaire cellen bevatte iets minder lipide druppels per eenheid van het volume in vergelijking met exponentieel groeiende cellen. Echter, hun volume-genormaliseerde druppelfluorescentie intensiteit bijna verdubbeld.Deze sterke toename van het totale lipide druppelgehalte was te wijten aan de veel hogere fluorescentieintensiteit en het volume van individuele lipidedruppels in de stationaire fase. Na deze procedure kunnen uitvoergegevens worden samengevoegd in een statistisch pakket zoals R om plots van samengevatte resultaten te maken en statistische tests uit te voeren op eventuele waargenomen verschillen in lipidedruppelgehalte. In principe kan de pijplijn voor beeldverwerking worden gebruikt voor analyse van lipidedruppelgehalte in andere micro-organismen of voor het analyseren van andere puntachtige subcellulaire structuren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Faciliteren Drug Discovery: een geautomatiseerde high-content Ontsteking Assay in de zebravis

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Een semi-automatische Aanpak Voorbereiding Antibody Cocktails voor Immunophenotypic Analyse van de humane perifere bloed

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...