Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions de l'Université Charles PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 et SVV 260310. Nous remercions Ondôej Ebesta pour son aide dans le développement de la microscopie et le développement du pipeline d'analyse d'images. Nous remercions le laboratoire ReGenEx pour les souches De Cervisiae, et le laboratoire de JapoNet et Hironori Niki pour les souches de S. japonicus. La souche ppc1-88 a été fournie par The Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopie a été réalisée dans le Laboratoire de microscopie Confocal et Fluorescence cofinancé par le Fonds européen de développement régional et le budget de l'Etat de la République tchèque (Projet no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 et CZ.2.16/3.1.00/21515).

1. Préparation de solutions et de médias
<ol><li>
Préparer la solution de coloration lipidique.
	<ol>
<li>Pour préparer la solution de coloration lipidique de stock dissoudre 10 mg de BODIPY 493/503 dans 10 ml de DMSO anhydre (concentration finale 1 mg/mL). Dissoudre la teneur entière d'une flacon BODIPY 493/503 de 10 mg pour éviter la perte de matière pendant la pesée. MISE EN GARDE: DMSO peut passer à travers la peau. Portez l'équipement de protection individuelle approp...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

La compréhension du métabolisme des lipides et de sa régulation est importante à la fois pour la biologie de base et pour les applications cliniques et biotechnologiques. Le contenu de LD représente une lecture commode de l'état de métabolisme de lipide de la cellule, avec la microscopie de fluorescence étant l'une des méthodes principales employées pour la détermination de contenu de LD. Le protocole présenté permet la détection automatisée et la description quantitative des LD individuels chez trois esp?...

Les lipides jouent un rôle crucial dans l'énergie cellulaire et le métabolisme du carbone, la synthèse des composants membranaires et la production de substances bioactives. Le métabolisme des lipides est affiné en fonction des conditions environnementales, de la disponibilité des nutriments et de la phase1du cycle cellulaire. Chez l'homme, le métabolisme des lipides a été relié à des maladies telles que l'obésité, le diabète de type II et le cancer2. Dans l'industrie, les lipides produits par les micro-organismes, comme les levures, représentent une source prometteuse de carburants diesel renouvelables3. Les cellules stockent les lipides neutres dans ce qu'on appelle les gouttelettes lipidiques (LD). Ces corps conservés de façon évolutive sont composés de triacylglycérols, d'esters de stéroyles, d'une monocouche phospholipide externe et de protéines associées1. Les LD proviennent du réticulum endoplasmique, exercent une dynamique du cycle cellulaire ou de la phase de croissance, et sont importants pour l'homéostasie lipidique cellulaire1. Le nombre De LD et la morphologie peuvent être utilisés comme un proxy commode en assérant le métabolisme de lipide dans diverses conditions de croissance ou en examinant un panneau de mutants. Compte tenu de leur nature dynamique, les techniques capables d'analyser les propriétés des LD individuels sont d'un intérêt particulier dans les études du métabolisme des lipides.
Diverses espèces de levures ont été utilisées pour décrire les voies métaboliques liées aux lipides et leur régulation, ou utilisées en biotechnologie pour produire des composés ou des carburants intéressants1. En outre, pour les levures modèles, telles que la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae ou la levure de fission lointaine ment liée Schizosaccharomyces pombe, bibliothèques de souches de suppression à l'échelle du génome sont disponibles qui peuvent être utilisés pour le haut débit écrans4,5. Récemment la composition et la dynamique de LD ont été décrites dans S. pombe6,7,8,9, et les mutants liés au métabolisme de lipide ont été isolés dans la levure modèle émergente Schizosaccharomyces japonicus10.
De nombreuses techniques sont disponibles pour étudier le contenu et la dynamique LD. La plupart emploient une sorte de coloration de LD avec des colorants lipophiles tels que nile Red ou BODIPY 493/503. Ce dernier montre des spectres d'excitation et d'émission plus étroits, et une plus grande spécificité vers les lipides neutres (LD) par opposition aux phospholipides (membranes)11. Les méthodes fluormétriques et de flux-cytométrie ont été utilisées avec succès dans diverses espèces fongiques pour découvrir des gènes et des conditions de croissance qui affectent la teneur en lipides de stockage12,13,14,15. Bien que ces méthodes conviennent aux applications à haut débit, elles ne peuvent pas mesurer le nombre et la morphologie des LD individuels dans les cellules, qui peuvent différer considérablement entre les conditions de croissance et les génotypes. La diffusion cohérente de Raman ou la microscopie holographique numérique sont des méthodes sans étiquette qui produisent des données de niveau LD, mais exigent l'équipement coûteux spécialisé16,17,18. La microscopie fluorescence, d'autre part, peut fournir des données détaillées sur le contenu LD, tout en utilisant des instruments couramment disponibles et des outils logiciels d'analyse d'images. Plusieurs workflows d'analyse existent qui comportent divers degrés de sophistication et d'automatisation dans la détection de cellules/LD à partir des données d'image, et sont optimisés pour différents types de cellules, tels que les cellules métazoaires avec de grands LD19,20 , 21, ou levures en herbe17,22,23. Certaines de ces approches ne fonctionnent qu'en 2D (p. ex., sur des images de projection maximale), ce qui peut ne pas décrire de façon fiable le contenu LD cellulaire. À notre connaissance, aucun outil n'existe pour déterminer le contenu et la morphologie de LD à partir des données microscopiques de levure de fission. Le développement d'analyses automatisées et robustes au niveau de la LD apporterait une sensibilité accrue et une puissance statistique accrue, et fournirait des informations riches sur la teneur en lipides neutres, idéalement chez plusieurs espèces de levures.
Nous avons développé un flux de travail pour l'analyse du contenu LD à partir d'images de microscopie de fluorescence 3D de cellules de levure. Les cellules vivantes sont tachées de BODIPY 493/503 et de Dextran Cascade Blue pour visualiser les LD et déterminer les limites cellulaires, respectivement. Les cellules sont immobilisées sur des lames de verre et soumises à l'imagerie par la pile z à l'aide d'un microscope à épifluorescence standard. Les images sont ensuite traitées par un pipeline automatisé mis en œuvre dans MATLAB, un paquet (commercial) largement utilisé pour les analyses statistiques. Le pipeline effectue le prétraitement de l'image, la segmentation (cellules par rapport à l'arrière-plan, l'élimination des cellules mortes) et l'identification LD. Les données riches au niveau LD, telles que la taille du LD et l'intensité de la fluorescence, sont ensuite fournies dans un format tabulaire compatible avec les principaux outils logiciels de feuilles de calcul. Le flux de travail a été utilisé avec succès pour déterminer l'impact de la disponibilité des sources d'azote sur le métabolisme des lipides dans S. pombe24. Nous démontrons maintenant la fonctionnalité du flux de travail dans S. pombe, S. japonicus et S. cerevisiae, en utilisant des conditions de croissance ou des mutants qui affectent le contenu lD cellulaire.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

Le métabolisme des lipides et sa régulation sont d'intérêt pour les sciences de la vie de base et appliquées et la biotechnologie. À cet égard, diverses espèces de levures sont utilisées comme modèles dans la recherche métabolique lipidique ou pour la production industrielle de lipides. Les gouttelettes lipidiques sont des corps de stockage très dynamiques et leur contenu cellulaire représente une lecture pratique de l'état métabolique des lipides. La microscopie fluorescence est une méthode de choix pour l'analyse quantitative des gouttelettes lipidiques cellulaires, car elle repose sur un équipement largement disponible et permet l'analyse des gouttelettes lipidiques individuelles. En outre, l'analyse microscopique de l'image peut être automatisée, ce qui augmente considérablement le débit global de l'analyse. Ici, nous décrivons un flux de travail expérimental et analytique pour la détection automatisée et la description quantitative des gouttelettes lipidiques individuelles dans trois espèces différentes de levure modèle : les levures de fission Schizosaccharomyces pombe et Schizosaccharomyces japonicus, et la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae. Les gouttelettes lipidiques sont visualisées avec BODIPY 493/503, et le dextran fluorescent à l'imperméabilité cellulaire est ajouté au support culturel pour aider à identifier les limites cellulaires. Les cellules sont soumises à une microscopie d'épifluorescence 3D dans des canaux verts et bleus et les images z-stack qui en résultent sont traitées automatiquement par un pipeline MATLAB. La procédure produit de riches données quantitatives sur la teneur en gouttelettes lipidiques cellulaires et les caractéristiques individuelles des gouttelettes lipidiques dans un format tabulaire adapté aux analyses en aval dans les principaux paquets de tabletur ou statistiques. Nous fournissons des analyses d'exemple de la teneur en gouttelettes lipidiques dans diverses conditions qui affectent le métabolisme des lipides cellulaires.

L'ensemble de la procédure est résumé e à la figure 1 pour les levures de fission (le flux de travail de levure en herbe est analogue), et ci-dessous nous fournissons des exemples de la façon dont le flux de travail peut être utilisé pour étudier la teneur en LD dans trois espèces de levures différentes dans diverses conditions connues d'affecter le contenu LD cellulaire. Chaque exemple représente une seule expérience biologique.
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Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Ici, nous présentons une implémentation de MATLAB de la détection automatisée et de la description quantitative des gouttelettes de lipide dans les images de microscopie de fluorescence des cellules de fission et de levure en herbe.

Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à l'aide du traitement automatisé de l'image

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Ce protocole facilite les analyses quantitatives à petite et à grande échelle de la teneur en lipides de stockage cellulaire chez une variété d’espèces de levure et le fait d’une manière impartiale et normalisée. La technique permet le traitement rapide des images microscopiques et fournit des extrants quantitatifs détaillés pour comparer facilement des échantillons tels que divers mutants et cellules cultivés dans diverses conditions. Pour commencer, suivez le protocole texte qui l’accompagne pour préparer les solutions de coloration, les médias culturels et les cellules.Assurez-vous que les cellules sont en bonne santé et dans la phase de croissance souhaitée avant d’exécuter l’expérience. Ensuite, préparez un coverslip microscope pour chaque échantillon à l’image. Étendre un microlitre de solution de revêtement de glissière sur un couvercle propre à l’aide du côté long d’une pointe de pipette positionnée horizontalement.Laissez sécher complètement la solution de revêtement, puis rangez les couvercles dans un environnement exempt de poussière. Ensuite, mesurez les densités optiques des cultures cellulaires et, pour que les cultures soient analysées dans la même phase de croissance, essayez d’atteindre des valeurs similaires parmi toutes les cultures testées afin d’assurer des conditions expérimentales comparables. Ensuite, pipette un millilitre de la culture cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Pour les cellules S.cerevisiae seulement, ajoutez cinq microlitres de la solution de revêtement de glissière au tube aussi bien. Puis, brièvement vortex tous les tubes de microcentrifugeuse, et les incuber à 30 degrés Celsius avec des secousses pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez un microlitre de la solution de coloration lipidique à chaque culture aliquot, et vortex brièvement.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution de visualisation des limites cellulaires et vortexez-les brièvement une deuxième fois. Recueillir les cellules en les centrifugant à 1000 fois la gravité pendant trois minutes à température ambiante. Une fois la filature terminée, retirer 950 microlitres du surnatant et resuspendre les cellules dans le supernatant restant à l’aide d’une pipette.Ensuite, pipette deux microlitres de la suspension cellulaire dense sur un coverslip enduit de lectine. Ensuite, placez le coverslip sur une lame de microscope propre pour former un monocouche cellulaire, et passez à la microscopie aussi rapidement que possible pour minimiser les artefacts dans l’imagerie. La mise en place du microscope nécessite de longues expositions à de fortes sources de lumière qui pourraient endommager l’échantillon et fausser les résultats.Par conséquent, configurer les conditions d’imagerie à l’aide d’une diapositive d’échantillon dédiée qui ne sera pas utilisée davantage pour la quantification des gouttelettes lipidiques. Placez l’échantillon dédié sur la scène d’un contraste de phase ou d’une configuration différentielle de microscope à contraste d’interférence, et concentrez-vous sur les cellules. Dans le logiciel du microscope, définissez les paramètres de la pile Z de sorte qu’ils couvrent l’ensemble du volume cellulaire.La distance verticale totale dépend de la taille de la cellule, et le nombre de tranches optiques dépend de l’ouverture numérique de l’objectif. Ensuite, mettez l’accent sur le déplacement par rapport au plan focal central. Pour imager les gouttelettes lipidiques, réglez expérimentalement l’intensité lumineuse et le temps d’exposition dans le canal vert.Soyez prudent lors de l’imagerie, car BODIPY est un fluorochrome très lumineux qui peut être rapidement photobleached. En outre, réduisez au minimum le temps d’exposition pour éviter la sursaturation. Capturez d’abord le canal vert complet Z-stack avant de passer au canal bleu pour éviter de brouiller les gouttelettes mobiles de lipides.Pour les limites des cellules d’image, réglez expérimentalement l’intensité lumineuse et le temps d’exposition dans le canal bleu. Si possible, configurez et utilisez un workflow expérimental automatisé dans le logiciel de contrôle au microscope pour faciliter l’imagerie de plusieurs échantillons dans des conditions normalisées. Fait important, toutes les images doivent être acquises en utilisant les mêmes paramètres pour permettre une comparaison appropriée entre les échantillons.Une fois que les conditions d’imagerie ont été optimisées, concentrez-vous sur les cellules et imagez-les dans les canaux verts et bleus. Imagez plusieurs champs de vision par échantillon pour obtenir des données robustes et représentatives. Enregistrez les images Z-stack du canal bleu et vert sous forme de fichiers TIFF multicouches 16 bits.Assurez-vous d’inclure les mots vert ou bleu dans les noms de fichiers correspondants. Ouvrez des images microscopiques dans ImageJ et supprimez toutes les piles d’images contenant un nombre considérable de cellules qui se sont déplacées lors de l’acquisition. Ceux-ci apparaissent à différentes positions dans les sections Z individuelles.Ensuite, retirez toutes les piles d’images contenant des particules non cellulaires hautement fluorescentes dans le canal bleu. Ceci est souvent causé par la saleté sur la surface d’imagerie ou les impuretés dans le milieu de culture et peut interférer avec la détection des cellules dans leur voisinage. En outre, retirez toutes les piles d’images contenant une grande proportion de cellules mortes.Ces images afficheront des cellules avec une fluorescence bleue accrue par rapport aux cellules vivantes. Bien que la présence de quelques cellules mortes dans l’échantillon ne soit généralement pas un problème et que ces cellules soient automatiquement jetées au cours de l’analyse, certaines cellules mortes ou mourantes peuvent parfois être reconnues comme cellules vivantes par l’algorithme de segmentation et ainsi fausser les résultats rapportés. Pour commencer l’analyse dans MATLAB, créez d’abord un dossier principal et copiez tous les scripts MATLAB à cet endroit.Ensuite, créez des sous-rôles avec les noms des différentes espèces de levure, et copiez les images respectives du TIFF à ces endroits. Maintenant, commencez MATLAB, ouvrez le script PRINCIPAL. m, et exécuter le script.Dans le menu, sélectionnez les espèces de levure à analyser et commencez le traitement d’image. Inspectez et traiter les fichiers de sortie au besoin à l’aide d’un éditeur de feuille de calcul ou d’un paquet statistique. Le flux de travail produit des fichiers CSV séparés par des points-virgules et des fichiers TIFF segmentés avec des objets cellulaires détectés et des gouttelettes lipidiques.On y voit des cellules S.pombe de type sauvage qui ont été cultivées dans le milieu complexe YES ou dans le milieu défini de l’EMM. Par rapport aux cellules cultivées dans le milieu YES, moins de gouttelettes lipidiques et une intensité de coloration plus élevée par unité de volume cellulaire ont été détectées dans le milieu emm. En outre, les gouttelettes individuelles de lipide formées dans le milieu d’EMM étaient plus grandes et ont montré une intensité totale accrue de coloration.Ceci est en accord avec les résultats précédents de l’augmentation de la teneur en lipides stockés dans les cellules cultivées en EMM. Ensuite, ces images montrent des cellules S.japonicus provenant de cultures exponentielles et stationnaires précoces cultivées dans le milieu YES. Les cellules entrant dans la phase stationnaire ont montré un nombre nettement diminué de gouttelettes de lipide par unité de volume cellulaire tandis que l’intensité de fluorescence de gouttelette de lipide volume-normalisée a diminué légèrement entre les deux conditions.Les gouttelettes de lipides de phase stationnaire précoce étaient généralement de taille modérément plus grande et avaient une intensité totale de fluorescence modérément plus élevée que les gouttelettes provenant de cellules à croissance exponentielle. Dans les cellules S.cerevisiae cultivées en phase exponentielle par rapport à la phase stationnaire, les cellules stationnaires contenaient un peu moins de gouttelettes lipidiques par unité de volume par rapport aux cellules en croissance exponentielle. Cependant, leur intensité de fluorescence de gouttelettes normalisée en volume a presque doublé.Cette forte augmentation de la teneur globale en gouttelettes lipidiques est due à l’intensité et au volume beaucoup plus élevés de fluorescence et de volume de gouttelettes de lipides individuelles en phase stationnaire. Après cette procédure, les données de sortie peuvent être agrégées dans un ensemble statistique tel que R pour créer des parcelles de résultats résumés et exécuter des tests statistiques sur toutes les différences observées dans la teneur en gouttelettes lipidiques. En principe, le pipeline de traitement d’image peut être utilisé pour l’analyse de la teneur en gouttelettes lipidiques dans d’autres micro-organismes ou pour analyser d’autres structures subcellulaires similaires à des points.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Recherche

Immunologie et infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d&#39;enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre

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Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

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We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

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Une approche semi-automatique pour la préparation des anticorps Cocktails pour immunophénotypique Analyse de sang périphérique humain

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

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Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

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Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

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Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

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Analyse comportementale des grands c. elegans des Populations à l’aide d’un champ de vision large suivi plate-forme automatisée

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