Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

この研究は、チャールズ大学助成金PRIMUS/MED/26、GAUK 1308217とSVV 260310によってサポートされました。私たちは、画像解析パイプラインの顕微鏡検査と開発に関するOndéej Sebestaに感謝します。私たちは、S.セレビシエ株のためのReGenExラボ、およびS.ジャポニカス株のためのJapoNetとニキヒロノリの研究室に感謝します。ppc1-88株は、酵母遺伝資源センタージャパンによって提供された。顕微鏡検査は、欧州地域開発基金とチェコ共和国の国家予算(プロジェクトNo.)が共同出資する共焦点・蛍光顕微鏡検査所で行われました。CZ.1.05/4.1.00/16.0347およびCZ 2.16/3.1.00/21515)。

1. ソリューションとメディアの準備
<ol><li>
脂質染色液を調作する。
	<ol>
<li>ストック脂質染色液溶解液を調剤し、10mLの無水DMSO(最終濃度1mg/mL)でBODIPY 493/503の10mgを溶解させる。計量中の材料の損失を防ぐために10 mg BODIPY 493/503バイアルの全体の内容物を溶解します。 注意:DMSOは皮膚を通過することがある。適切な個人用保護具を着用してください。</li>
		<li>1mg/mL BOD...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

脂質代謝とその調節の理解は、基礎生物学と臨床およびバイオテクノロジーの応用の両方にとって重要です。LD含有量は、細胞の脂質代謝状態の読み出しを表し、蛍光顕微鏡はLD含有量決定に用いられる主要な方法の1つである。提示されたプロトコルは、3つの異なる形態的に異なる酵母種における個々のLDの自動検出および定量的記述を可能にする。私たちの知る場合、核分裂酵母に対する?...

脂質は、細胞エネルギーや炭素代謝、膜成分の合成、生理活性物質の産生に重要な役割を果たします。脂質代謝は、環境条件、栄養素の利用可能性および細胞周期フェーズ1に応じて微調整される。ヒトでは、脂質代謝は、肥満、II型糖尿病および癌2などの疾患に関連している。産業では、酵母などの微生物によって生成される脂質は、再生可能なディーゼル燃料3の有望な供給源を表す。細胞は、いわゆる脂質液滴(LD)に中性脂質を格納します。これらの進化的に保存された体は、トリアシルグリセロール、ステリルエステル、外側リン脂質単層および関連タンパク質1から構成される。LDsは小プラズム網膜に由来し、細胞周期または成長相力学を発揮し、細胞脂質恒常性1にとって重要である。LD番号および形態は、様々な成長条件下で脂質代謝をアッセイするとき、または変異体のパネルをスクリーニングする際に便利なプロキシとして使用することができる。そのダイナミックな性質を考えると、個々のLDの特性を分析することができる技術は、脂質代謝の研究に特に関心がある。
様々な酵母種は、脂質関連代謝経路およびその調節を記述するために使用されてきた、または興味深い化合物または燃料1を生成するためにバイオテクノロジーで使用されている。さらに、発芽酵母サッカロマイセスセレビシエや遠く関連する分裂酵母シゾサッカロマイセスポンベなどのモデル酵母については、ゲノム全体の欠失歪みライブラリを高スループットに使用できる利用可能です。画面4,5.最近、Ld組成物とダイナミクスはS.pombe6,7,8,9に記載されており、脂質代謝に関連する変異体は、新興モデル酵母中に単離されている。シゾサッカロマイセスジャポニカス10.
LDの内容とダイナミクスを研究するために、数多くの技術が利用可能です。ほとんどはナイルレッドやBODIPY 493/503などの親油性染料でLDのいくつかの種類の染色を採用しています。後者は、より狭い励起および放出スペクトルを示し、リン脂質(膜)11とは対照的に中性脂質(LD)に対する特異性の増加を示す。フッ素測定およびフローサイトメトリー法は、貯蔵脂質含有量12、13、14、15に影響を与える遺伝子および成長条件を明らかにするために、様々な真菌種で成功して使用されてきた。これらの方法はハイスループットアプリケーションに適していますが、細胞内の個々のLDの数と形態を測定することはできません。コヒーレントラマン散乱またはデジタルホログラフィック顕微鏡は、LDレベルのデータを生成するラベルフリーの方法ですが、特殊な高価な機器16、17、18を必要とします。一方、蛍光顕微鏡は、一般的に利用可能な機器や画像解析ソフトウェアツールを利用しながら、LD含有量に関する詳細なデータを提供することができます。画像データからのセル/LD検出における様々な高度化と自動化を特徴とするいくつかの解析ワークフローが存在し、大きなLDを持つメタゾン細胞など、異なる細胞タイプに最適化されています 19,20,21, または発芽酵母17,22,23.これらのアプローチの一部は、2D(例えば、最大投影画像)でのみ動作し、セルラーLD含有量を確実に記述できない場合があります。我々の知るうる場合、核分裂酵母顕微鏡データからLD含有量と形態を決定するためのツールは存在しない。自動化された堅牢なLDレベルの分析の開発は、感度の向上と高められた統計力をもたらし、理想的には複数の酵母種で、中性脂質含有量に関する豊富な情報を提供します。
酵母細胞の3D蛍光顕微鏡画像からLD含有量解析のワークフローを開発しました。生細胞は、BODIPY 493/503とカスケードブルーデキトランで染色され、それぞれLDを可視化し、細胞境界を決定します。細胞はガラススライド上に固定化され、標準的なエピ蛍光顕微鏡を使用してZスタックイメージングを行います。画像は、統計分析のために広く使用されている(商用)パッケージであるMATLABに実装された自動化されたパイプラインによって処理されます。パイプラインは、イメージ前処理、セグメンテーション (セルと背景、死んだセルの除去)、および LD 識別を実行します。LD サイズや蛍光強度などのリッチ LD レベルのデータは、主要なスプレッドシート ソフトウェア ツールと互換性のある表形式で提供されます。このワークフローは、S.pombe24における脂質代謝に対する窒素源の利用可能性の影響を決定するために正常に使用された。次に、細胞の LD 含有量に影響を与える成長条件または変異体を使用して、S. pombe、S. japonicusおよび S. cerevisiaeのワークフローの機能を示します。

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

脂質代謝とその調節は、基礎科学と応用ライフサイエンスとバイオテクノロジーの両方に関心があります。この点で、様々な酵母種は、脂質代謝研究または工業用脂質産生のモデルとして使用される。脂質液滴は非常に動的な貯蔵体であり、その細胞含有量は脂質代謝状態の便利な読み出しを表す。蛍光顕微鏡は、広く利用可能な装置に依存し、個々の脂質液滴の分析を可能にする細胞脂質液滴の定量分析のための選択方法です。さらに、顕微鏡画像解析を自動化できるため、全体的な分析スループットが大幅に向上します。ここでは、3つの異なるモデル酵母種における個々の脂質液滴の自動検出と定量的記述のための実験的および分析的ワークフローについて説明する:核分裂酵母シゾ糖菌ポンベとシゾ糖筋ジャポニクス、および発芽酵母サッカロマイセスセレビシエ.脂質液滴はBODIPY 493/503で可視化され、細胞不透過性蛍光デキストランを培養培養培養培養剤に添加し、細胞境界の特定に役立ちます。細胞は緑と青のチャネルで3D上蛍光顕微鏡に供され、得られたZスタック画像はMATLABパイプラインによって自動的に処理されます。この手順は、主要なスプレッドシートまたは統計パッケージの下流分析に適した表形式で、細胞脂質液滴含有量および個々の脂質液滴特性に関する豊富な定量データを出力します。細胞脂質代謝に影響を与える様々な条件下で脂質液滴含有量の分析例を提供する。

全体の手順は、核分裂酵母の図1に要約され(発芽酵母ワークフローは類似している)、以下に、ワークフローが知られている様々な条件下で3つの異なる酵母種のLD含有量を研究するために使用することができる方法の例を提供します。セルラー LD 含有量に影響を与えます。各例は、単一の生物学的実験を表す。
<img alt="Figure 1"...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

ここでは、核分裂細胞および発芽酵母細胞の蛍光顕微鏡画像における脂質液滴の自動検出および定量的記述のMATLAB実装を提示する。

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

このプロトコルは、さまざまな酵母種における細胞貯蔵脂質含有量の定量的小規模から大規模な分析を容易にし、公平かつ標準化された方法で行います。この技術は、顕微鏡画像の迅速な処理を可能にし、多様な条件下で成長した様々な変異体および細胞などのサンプルを容易に比較するための詳細な定量的出力を提供する。まず、付属のテキストプロトコルに従って、染色液、培養培地、および細胞を準備します。実験を実行する前に、細胞が正常で、目的の成長段階にあることを確認します。次に、画像化するサンプルごとに顕微鏡カバースリップを用意します。水平に配置されたピペットチップの長い側を使用して、スライドコーティング溶液の1マイクロリットルをきれいなカバースリップに広げます。コーティング溶液を完全に乾燥させ、カバーリップをほこりのない環境に保管します。次に、細胞培養物の光学密度を測定し、同じ増殖段階で分析される培養物について、比較可能な実験条件を確保するために、すべての試験培養物の間で同様の値に達するように試みる。次いで、1ミリリットルの細胞培養液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにピペット化する。S.cerevisiae細胞の場合のみ、スライドコーティング溶液の5マイクロリットルをチューブにも加えます。その後、マイクロ遠心チューブのすべてを短時間渦巻き、5分間振って摂氏30度でインキュベートします。次に、各培養アリコートに1マイクロリットルの脂質染色液を加え、それらを短時間で渦液化する。次に、細胞境界可視化液の10マイクロリットルを加え、それらを2回目に短く渦を出す。室温で3分間重力1,000倍の遠心で細胞を集めます。紡糸が終了したら、上清から950マイクロリットルを取り出し、ピペットを使用して残りの上清の細胞を再懸濁します。次に、緻密な細胞懸濁液の2マイクロリットルをレクチンコーティングカバースリップにピペットする。次に、カバースリップをクリーンな顕微鏡スライドに置いて細胞単層を形成し、できるだけ早く顕微鏡観察に進み、イメージングにおけるアーチファクトを最小限に抑えます。顕微鏡を設置するには、サンプルや歪み結果に損傷を与える可能性のある強い光源への長時間の露出が必要です。そのため、脂質滴定量に更に使用しない専用のサンプルスライドを用いて撮像条件を設定する。専用サンプルを位相コントラストまたは差動干渉のコントラスト顕微鏡の設定のステージに置き、細胞に焦点を当てます。顕微鏡のソフトウェアでは、Zスタックの設定を設定して、セル全体の体積にまたがるようにします。縦の総距離はセルサイズによって異なり、光学スライスの数は目的の開口数によって異なります。次に、中心焦点面に対して相対的に移動するようにフォーカスを設定します。脂質滴を画像化するには、緑色チャネル内の光強度および露光時間を実験的に設定する。撮像時には、BODIPYは急速に光漂白され得る非常に明るい蛍光色素である。また、露出時間を最小限に抑えて、過飽和を避けます。ブルーチャンネルに切り替える前に、最初にフルグリーンチャンネルZスタックをキャプチャして、移動式の脂質滴をぼかすのを防ぎます。セル境界を画像化するには、青色チャネルで光強度と露光時間を実験的に設定する。可能であれば、顕微鏡制御ソフトウェアで自動実験ワークフローを設定して使用し、標準化された条件下で複数のサンプルのイメージングを容易にします。重要なのは、サンプル間で適切な比較を行えるように、すべての画像を同じ設定で取得する必要があります。イメージング条件が最適化されたら、セルに焦点を当て、緑色と青の両方のチャネルで画像を撮ります。サンプルごとに複数の視野を画像化して、堅牢で代表的なデータを取得します。青と緑のチャンネル Z スタック画像を 16 ビットマルチレイヤー TIFF ファイルとして保存します。必ず、対応するファイル名に緑または青の単語を含めます。ImageJで顕微鏡画像を開き、取得時に移動した細胞のかなりの数を含む画像スタックを削除します。これらは、個々のZセクションの異なる位置に表示されます。次に、青色チャネル内の蛍光性の高い非細胞粒子を含む画像スタックを除去する。これは、多くの場合、イメージング表面の汚れや栽培媒体の不純物によって引き起こされ、その近くの細胞の検出を妨げる可能性があります。また、死んだ細胞の大部分を含む画像スタックを削除します。これらの画像は、生細胞と比較して増加した青色蛍光を有する細胞を表示する。サンプル内のいくつかの死んだ細胞の存在は一般的に問題ではなく、これらの細胞は分析中に自動的に廃棄されますが、死んだ細胞や死んでいる細胞の中には、セグメンテーションアルゴリズムによって生細胞として認識され、報告された結果をゆがめることがあります。MATLAB で分析を開始するには、まずメイン フォルダを作成し、すべての MATLAB スクリプトをこの場所にコピーします。次に、さまざまな酵母種の名前を持つサブフォルダを作成し、それぞれのTIFF画像をこれらの場所にコピーします。MATLAB を起動し、MAIN スクリプトを開きます。m をクリックし、スクリプトを実行します。メニューで、分析する酵母種を選択し、画像処理を開始します。スプレッドシート エディタまたは統計パッケージを使用して、必要に応じて出力ファイルを検査および処理します。このワークフローでは、セミコロンで区切られた CSV ファイルと、検出されたセル オブジェクトと脂質の液滴を含むセグメント化された TIFF ファイルが生成されます。ここに示されているのは、複合YES培地または定義されたEMM培地のいずれかで増殖した野生型のS.pombe細胞である。YES培地で増殖した細胞と比較して、EMM培地では細胞体積当たりの脂質滴が少なく、染色強度が高かった。また、EMM培地で形成された個々の脂質滴は大きく、全染色強度の増加を示した。これは、EMMで増殖した細胞における保存脂質含量の増加の以前の知見と一致している。次に、これらの画像は、YES培地で増殖した指数および早期定常培養物からのS.japonicus細胞を示す。静止期に入る細胞は、細胞体積の単位当たりの脂質滴の数が著しく減少し、体積正規化された脂質液滴蛍光強度は2つの条件間でわずかに減少した。初期の静止相脂質滴は、典型的には中程度の大きさであり、指数関数的に増殖する細胞からの液滴と比較して、適度に高い総蛍光強度を有していた。S.cerevisiae細胞は指数対定常相に成長し、静止細胞は指数成長細胞と比較して体積単位当たりの脂質滴がやや少なかった。しかし、その体積正規化された液滴蛍光強度はほぼ倍増した。この全体的な脂質滴含有量の急激な増加は、静止期における個々の脂質滴の蛍光強度および体積がはるかに高いためであった。この手順に従うと、出力データをRなどの統計パッケージに集約して、要約結果のプロットを作成し、脂質滴含有量の観察された差異に関する統計検定を実行することができます。原則として、画像処理パイプラインは、他の微生物の脂質滴含量の分析や、他のドット状の細胞内構造の解析に使用できます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

マウス歯肉細胞の単離、処理と解析

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

ヒト末梢血の免疫表現型分析のための抗体のカクテルを準備する半自動のアプローチ

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...