Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

이 작품은 찰스 대학 보조금 PRIMUS / MED / 26, GAUK 1308217 및 SVV 260310에 의해 지원되었다. 우리는 현미경 검사법 및 이미지 분석 파이프 라인의 개발에 도움을 Ondřej Šebesta 감사합니다. 우리는 S. 세레비시아 균주에 대한 ReGenEx 실험실, 그리고 S. japonicus 균주에 대한 JapoNet과 히로노리 니키의 실험실에 감사드립니다. ppc1-88 균주는 효모 유전 자원 센터 일본에 의해 제공되었다. 현미경 검사법은 유럽 지역 개발 기금과 체코 공화국의 국가 예산에 의해 공동 으로 자금을 조달 공초점 및 형광 현미경 검사법의 실험실에서 수행되었다 (프로젝트 번호. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 및 CZ.2.16/3.1.00/21515).

1. 솔루션 및 미디어 준비
<ol><li>
지질 염색 용액을 준비하십시오.
	<ol>
<li>스톡 지질 염색 용액을 준비하려면 무수 DMSO 10 mL에 BODIPY 493/503 10 mg을 용해하십시오 (최종 농도 1 mg / mL). 계량 중 재료 손실을 방지하기 위해 10 mg BODIPY 493/503 바이알의 전체 함량을 용해하십시오. 주의 사항: DMSO는 피부를 통과할 수 있다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.</li>
		<li>1 mg/mL BODIP...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

지질 대사와 그 조절에 대한 이해는 기본적인 생물학, 임상 및 생명 공학 응용 분야 모두에 중요합니다. LD 함량은 세포의 지질 대사 상태의 편리한 판독을 나타내며, 형광 현미경 검사법은 LD 함량 측정에 사용되는 주요 방법 중 하나이다. 제시된 프로토콜은 세 가지 상이하고 형태학적으로 구별되는 효모 종에서 개별 LDs의 자동 검출 및 정량적 설명을 허용합니다. 우리가 알고 있는 것은 핵분열 효...

지질세포 에너지와 탄소 대사, 막 성분 합성, 생리활성 물질 생산에 중요한 역할을 합니다. 지질 대사는 환경 조건, 영양소 가용성 및 세포 주기 단계1에 따라 미세 조정됩니다. 인간에서는, 지질 물질 대사는 비만, 타입 II 당뇨병 및암 2와 같은 질병에 연결되었습니다. 산업에서 효모와 같은 미생물에 의해 생성 된 지질은 재생 가능한 디젤 연료의 유망한 원천을 나타냅니다3. 세포는 소위 지질 방울에 중립 지질을 저장 (LDs). 이러한 진화적으로 보존된 바디는 트리아실글리세롤, 스테릴 에스테르, 외부 인지질 단층 및관련 단백질 1로 구성된다. LDs는 자 구 체 망상에서 유래, 세포 주기 또는 성장 단계 역학을 발휘, 세포 지질 항상성에 대 한 중요한1. LD 수 및 형태는 다양한 성장 조건 하에서 지질 대사를 또는 돌연변이의 패널을 스크리닝할 때 편리한 프록시로 사용될 수 있다. 그들의 동적 특성을 감안할 때, 개별 LDs의 특성을 분석 할 수있는 기술은 지질 대사의 연구에 특히 관심이 있습니다.
다양한 효모 종은 지질 관련 대사 경로 및 이들의 조절을 기술하기 위해 사용되어 왔으며, 또는 흥미로운 화합물 또는 연료를 생산하기 위해 생명 공학에 사용되어왔다1. 또한, 신진 효모 사카로마이세스 세레비시아 또는 원거리 관련 핵분열 효모 인 Schizosaccharomyces pombe,게놈 전체 결실 균주 라이브러리와 같은 모델 효모의 경우 높은 처리량에 사용할 수 있습니다. 화면4,5. 최근 LD 조성 및 역학은 S. pombe6,7,8,9,지질 대사와 관련된 돌연변이체가 신흥 모델 효모에서 분리되어 설명되어 왔다. Schizosaccharomyces japonicus10.
LD 함량과 역학을 연구하기 위해 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 대부분은 나일 레드 또는 BODIPY 493/503과 같은 친유성 염료를 가진 LDs의 얼룩의 어떤 종류를 채택합니다. 후자는 인지질(membranes)11과반대로 보다 좁은 여기 및 방출 스펙트럼, 및 중성 지질(LDs)을 향한 특이성을 증가시키는 것을 나타낸다. 형광및 유동세포측정법은 저장지질함량12,13,14,15에영향을 미치는 유전자 및 성장조건을 밝히기 위해 다양한 곰팡이종에 성공적으로 사용되어 왔다. 이 방법은 높은 처리량 응용프로그램에 적합하더라도, 성장 조건과 유전형 사이에서 극적으로 다를 수 있는 세포에 있는 개별 적인 LDs의 수 그리고 형태를 측정할 수 없습니다. 코히런트 라만 산란 또는 디지털 홀로그램 현미경 은 LD 수준의 데이터를 산출하는 라벨없는 방법이지만, 전문 고가의 장비16,17,18이필요합니다. 형광 현미경 검사법은, 다른 한편으로는, 일반적으로 이용 가능한 계기 및 심상 분석 소프트웨어 공구를 이용하는 동안, LD 내용에 상세한 데이터를 제공할 수 있습니다. 여러 분석 워크플로우가 존재하며 이미지 데이터에서 셀/LD 검출에서 다양한 수준의 정교함과 자동화를 특징으로 하며, 큰 LDs19,20을 가진 메타조안 셀과 같은 다양한 세포 유형에 최적화되어 있습니다. , 21, 또는 신진 효모17,22,23. 이러한 방법 중 일부는 2D(예: 최대 프로젝션 이미지)에서만 작동하며, 이는 셀룰러 LD 콘텐츠를 안정적으로 설명하지 못할 수 있습니다. 우리의 지식에, 분열 효모 현미경 데이터에서 LD 내용 그리고 형태학의 측정을 위한 아무 공구도 존재하지 않습니다. 자동화되고 강력한 LD-레벨 분석의 개발은 증가된 감도와 향상된 통계적 힘을 가져다 줄 것이며, 여러 효모 종에서 이상적으로 중성 지질 함량에 대한 풍부한 정보를 제공합니다.
우리는 효모 세포의 3D 형광 현미경 심상에서 LD 내용 분석을 위한 워크플로우를 개발했습니다. 살아있는 세포는 각각 LD를 시각화하고 세포 경계를 결정하기 위해 BODIPY 493/503 및 캐스케이드 블루 덱스터넨으로 염색됩니다. 세포는 유리 슬라이드에 고정되고 표준 epifluorescence 현미경을 사용하여 z 스택 화상 진찰을 행합니다. 그런 다음 통계 분석을 위해 널리 사용되는 (상업적) 패키지인 MATLAB에서 구현된 자동화된 파이프라인에 의해 이미지가 처리됩니다. 파이프라인은 이미지 전처리, 세분화(셀 대 배경, 죽은 셀 제거) 및 LD 식별을 수행합니다. 그런 다음 LD 크기 및 형광 강도와 같은 풍부한 LD 수준 데이터가 주요 스프레드시트 소프트웨어 도구와 호환되는 테이블 형식으로 제공됩니다. 이 워크플로우는 S. pombe24에서지질 대사에 대한 질소 공급원 가용성의 영향을 결정하는 데 성공적으로 사용되었다. 우리는 지금 세포 LD 내용에 영향을 미치는 성장 조건 또는 돌연변이를 사용하여 S. pombe, S. japonicus 및 S. cerevisiae에있는 워크플로우의 기능을 보여줍니다.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

지질 대사와 그 조절은 기본 및 응용 생명 과학 및 생명 공학 모두에 관심이 있습니다. 이와 관련하여, 다양한 효모 종은 지질 대사 연구 또는 산업 지질 생산의 모델로 사용된다. 지질 방울은 매우 동적인 저장 체이며, 그들의 세포 함량은 지질 대사 상태의 편리한 판독을 나타낸다. 형광 현미경 검사법은 널리 이용 가능한 장비에 의존하고 개별 지질 방울의 분석을 허용하기 때문에, 세포 지질 방울의 정량분석을 위한 선택의 방법입니다. 또한 현미경 이미지 분석을 자동화하여 전체 분석 처리량을 크게 높일 수 있습니다. 여기에서, 우리는 3개의 다른 모형 효모 종에 있는 개별 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명을 위한 실험및 분석 워크플로우를 기술합니다: 분열 효모 Schizosaccharomyces pombe 및 Schizosaccharomyces japonicus,그리고 신진 효모 사카로마이세스 세레비시아. 지질 방울은 BODIPY 493/503으로 시각화되고, 세포 불투과성 형광 덱젠은 세포 경계를 식별하는 데 도움이 되는 배양 배지에 첨가된다. 세포는 녹색과 청색 채널에 있는 3D epifluorescence 현미경 검사법을 복종하고 생성된 z 스택 심자는 MATLAB 파이프라인에 의해 자동적으로 처리됩니다. 이 절차는 주요 스프레드시트 또는 통계 패키지의 다운스트림 분석에 적합한 표 형식으로 셀룰러 지질 액적 함량 및 개별 지질 액적 특성에 대한 풍부한 정량적 데이터를 출력합니다. 우리는 세포 지질 대사에 영향을 미치는 다양한 조건 하에서 지질 방울 함량의 예 분석을 제공합니다.

전체 절차는 핵분열 효모에 대해 그림 1에 요약되어 있으며(신진 효모 워크플로우는 유사함), 아래는 알려진 다양한 조건하에서 3가지 다른 효모 종에서 LD 함량을 연구하는 데 워크플로우가 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 예를 제공합니다. 세포 LD 콘텐츠에 영향을 미칩니다. 각 예는 단일 생물학적 실험을 나타낸다.
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Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

여기에서, 우리는 핵분열과 신진 효모 세포의 형광 현미경 심상에 있는 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명의 MATLAB 구현을 제시합니다.

자동 이미지 처리를 사용하여 핵분열 및 신진 효모의 지질 방울 함량 분석

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

이 프로토콜은 다양한 효모 종에서 세포 저장 지질 함량의 정량적 소규모 및 대규모 분석을 용이하게하고 편견과 표준화 된 방식으로 그렇게합니다. 이 기술은 현미경 이미지의 신속한 처리를 허용하고 다양한 조건에서 재배된 다양한 돌연변이및 세포와 같은 샘플을 쉽게 비교할 수 있는 상세한 정량적 출력을 제공합니다. 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 염색 솔루션, 배양 미디어 및 셀을 준비합니다.실험을 실행하기 전에 세포가 건강하고 원하는 성장 단계에서 있는지 확인하십시오. 다음으로, 각 시료를 이미지화할 현미경 커버슬립을 준비한다. 슬라이드 코팅 용액 1마이크로리터를 수평 으로 배치된 파이펫 팁의 긴 면을 사용하여 깨끗한 커버슬립에 펴놓습니다.코팅 용액이 완전히 건조한 다음 커버립을 먼지가 없는 환경에 보관할 수 있습니다. 다음으로, 세포 배양의 광학 밀도를 측정하고, 배양이 동일한 성장 단계에서 분석될 수 있도록, 비교 가능한 실험 조건을 보장하기 위해 시험된 모든 배양들 사이에서 유사한 값에 도달하려고 노력한다. 그런 다음, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 세포 배양의 파이펫 1 밀리리터.S.cerevisiae 세포의 경우 슬라이드 코팅 용액 5 마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 그런 다음 모든 미세 원심 분리기 튜브를 잠시 소용돌이쳐 5 분 동안 흔들어섭 30도에서 배양하십시오. 다음으로, 각 배양 알리쿼트에 지질 염색 용액의 마이크로리터 1개를 추가하고 잠시 소용돌이를 가합니다.그런 다음 셀 경계 시각화 용액의 10 마이크로리터를 추가하고 두 번째로 잠시 소용돌이를 가합니다. 실온에서 3분 동안 1, 000배 의 중력으로 원심분리하여 세포를 수집합니다. 회전이 완료되면, 상체에서 950 마이크로 리터를 제거하고 파이펫을 사용하여 나머지 상체에 있는 세포를 다시 중단합니다.다음으로, 조밀한 셀 서스펜션의 피펫 2마이크로리터가 렉틴 코팅 커버슬립에 들어있습니다. 그런 다음, 커버슬립을 깨끗한 현미경 슬라이드에 놓고 세포 단층층을 형성하고 가능한 한 빨리 현미경 검사로 진행하여 이미징의 아티팩트를 최소화합니다. 현미경을 설정하려면 시료에 손상을 입히고 결과를 왜곡할 수 있는 강력한 광원에 긴 노출이 필요합니다.따라서, 지질 적물 정량화에 더 이상 사용되지 않는 전용 샘플 슬라이드를 사용하여 이미징 조건을 설정합니다. 전용 샘플을 위상 대조 또는 차동 간섭 대비 현미경 설정의 단계에 배치하고 세포에 집중합니다. 현미경의 소프트웨어에서 Z 스택 설정을 설정하여 전체 셀 볼륨에 걸쳐 있습니다.총 수직 거리는 셀 크기에 따라 달라지며 광학 슬라이스 수는 목표의 숫자 조리개에 따라 다릅니다. 다음으로 중앙 초점 평면을 기준으로 이동하는 초점을 설정합니다. 지질 방울을 이미지화하기 위해 녹색 채널에서 빛의 강도와 노출 시간을 실험적으로 설정합니다.BODIPY는 빠르게 표백 될 수있는 매우 밝은 불소크롬이기 때문에 이미징 시주의하십시오. 또한 노출 시간을 최소화하여 과포화를 방지합니다. 모바일 지질 방울을 흐리게 하지 않도록 파란색 채널로 전환하기 전에 전체 녹색 채널 Z 스택을 먼저 캡처합니다.셀 경계를 이미지화하려면 파란색 채널에서 광 강도 및 노출 시간을 실험적으로 설정합니다. 가능하면 현미경 제어 소프트웨어에 자동화된 실험 워크플로우를 설정하고 사용하여 표준화된 조건에서 여러 샘플의 이미징을 용이하게 합니다. 중요한 것은 모든 이미지를 동일한 설정을 사용하여 수집해야 샘플을 적절히 비교할 수 있어야 합니다.이미징 조건이 최적화되면 세포에 초점을 맞추고 녹색 채널과 파란색 채널 모두에서 이미지합니다. 샘플당 여러 뷰 필드를 이미지하여 강력하고 대표적인 데이터를 얻습니다. 파란색 및 녹색 채널 Z 스택 이미지를 16비트 다층 TIFF 파일로 저장합니다.해당 파일 이름에 녹색 또는 파란색 단어를 포함해야 합니다. ImageJ에서 현미경 이미지를 열고 획득 하는 동안 이동 하는 셀의 상당수를 포함 하는 이미지 스택을 제거 합니다. 이러한 위치는 개별 Z 섹션의 다른 위치에 나타납니다.다음으로, 파란색 채널에서 형광이 높은 비세포 입자를 포함하는 이미지 스택을 제거합니다. 이것은 수시로 재배 매체에 있는 화상 진찰 표면에 먼지 또는 불순물로 기인하고 그들의 부근에 있는 세포의 검출을 방해할 수 있습니다. 또한 죽은 세포의 큰 비율을 포함하는 이미지 스택을 제거합니다.이러한 이미지는 살아있는 세포에 비해 증가 된 청색 형광을 가진 세포를 표시합니다. 샘플에 있는 몇몇 죽은 세포의 존재는 전형적으로 문제가 되지 않으며 이러한 세포는 분석 도중 자동으로 버려지는 동안, 몇몇 죽은 또는 죽어가는 세포는 때때로 분할 알고리즘에 의해 살아있는 세포로 인식될 수 있고 그러므로 보고된 결과를 왜곡할 수 있습니다. MATLAB에서 분석을 시작하려면 먼저 메인 폴더를 만들고 모든 MATLAB 스크립트를 이 위치에 복사합니다.다음으로 다양한 효모 종의 이름이 있는 하위 폴더를 만들고 각 TIFF 이미지를 이러한 위치에 복사합니다. 이제 MATLAB을 시작하고 스크립트 메인을 엽니다. m, 스크립트를 실행합니다.메뉴에서 분석할 효모 종을 선택하고 이미지 처리를 시작합니다. 스프레드시트 편집기 또는 통계 패키지를 사용하여 필요에 따라 출력 파일을 검사하고 처리합니다. 워크플로는 세미콜론 분리 CSV 파일과 감지된 셀 개체및 지질 물방울이 있는 세그먼트TIFF 파일을 생성합니다.여기에 도시된 야생형 S.pombe 세포는 복잡한 YES 배지 또는 정의된 EMM 배지에서 재배되었다. YES 배지에서 자란 세포에 비해, EMM 배지에서 세포 부피의 단위당 지질 방울과 더 높은 염색 강도가 검출되었다. 더욱이, EMM 배지에서 형성된 개별 지질 방울은 더 크고 총 염색 강도가 증가하였다.이것은 EMM에서 자란 세포에 있는 증가한 저장된 지질 함량의 이전 사실 인정과 일치합니다. 다음으로, 이러한 이미지는 YES 배지에서 자란 기하급수적이고 초기 고정 된 배양에서 S.japonicus 세포를 보여줍니다. 정지 된 단계를 입력 하는 세포 는 볼륨 정규화 된 지질 방울 형광 강도 두 조건 사이 약간 감소 하는 동안 세포 볼륨의 단위 당 지질 물방울의 현저 하 게 감소 수를 보였다.초기 고정 형 지질 물방울은 일반적으로 적당히 크기가 적당히 더 크고 기하급수적으로 성장하는 세포에서 물방울에 비해 적당히 더 높은 총 형광 강도를 가졌다. S.cerevisiae 세포에서 기하급수적으로 성장 하는 세포대 고정 된 단계 대 기하 급하 성장 세포에 비해 부피의 단위 당 다소 적은 지질 방울을 포함. 그러나, 그들의 볼륨 정규화된 물방울 형광 강도는 거의 두 배로 증가했습니다.전반적인 지질 방울 함량의 이러한 급격한 증가는 고정 된 단계에서 개별 지질 방울의 훨씬 더 높은 형광 강도와 부피 때문이었습니다. 이 절차에 따라 출력 데이터를 R과 같은 통계 패키지에 집계하여 요약된 결과 플롯을 만들고 지질 방울 함량의 관찰된 차이점에 대한 통계 테스트를 실행할 수 있습니다. 원칙적으로, 이미지 처리 파이프라인은 다른 미생물의 지질 방울 함량을 분석하거나 다른 점과 같은 세포극 구조를 분석하는 데 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

연구

면역학 및 감염병학

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

쥐과 잇몸 세포의 분리, 처리 및 분석

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...