Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 og SVV 260310. Vi takker Ondřej Šebesta for hjelp med mikroskopi og utvikling av bildet analyse rørledningen. Vi takker ReGenEx laboratoriet for s. cerevisiae stammer, og JapoNet og Hironori Niki ' s Lab for s. japonicus stammer. Den ppc1-88 stamme ble levert av gjær genetisk Resource Center Japan. Mikroskopi ble utført i laboratoriet for Konfokalmikroskopi og fluorescens mikroskopi co-finansiert av det europeiske Regional Development Fund og statsbudsjettet til den tsjekkiske republikk (Project no. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 og CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. utarbeidelse av løsninger og Media
<ol><li>
Forbered lipid farging løsning.
	<ol>
<li>For å forberede lager lipid farge løsning oppløse 10 mg BODIPY 493/503 i 10 mL vannfri DMSO (endelig konsentrasjon 1 mg/mL). Løs opp hele innholdet i et 10 mg BODIPY 493/503 hetteglass for å forhindre tap av materiale under veiing. Forsiktig: DMSO kan passere gjennom huden. Bruk egnet personlig verneutstyr.</li>
		<li>Forbered arbeider lipid farge løsning ved å blande 100 μL av 1 mg/mL...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

Forståelsen av lipid metabolisme og dens regulering er viktig for både grunnleggende biologi, og kliniske og bioteknologisk applikasjoner. LD innhold representerer en praktisk avlesning av lipid metabolisme tilstand av cellen, med fluorescens mikroskopi være en av de viktigste metodene som brukes for LD innhold besluttsomhet. Den presenterte protokollen tillater automatisert oppdagelse og kvantitativ beskrivelse av individuelle LDs i tre forskjellige og morfologisk distinkte gjær arter. Til vår kunnskap, finnes det ...

Lipider spiller avgjørende roller i cellulær energi og karbon metabolisme, syntese av membran komponenter, og produksjon av bioaktive stoffer. Lipid metabolisme er finjustert i henhold til miljømessige forhold, næringsstoffer tilgjengelighet og celle-syklus fase1. Hos mennesker, lipid metabolisme har vært koblet til sykdommer, som fedme, type II diabetes og kreft2. I industrien, lipider produsert av mikroorganismer, slik som gjær, representerer en lovende kilde til fornybar diesel brensel3. Celler lagrer nøytrale lipider i såkalte lipid dråper (LDs). Disse evolutionarily bevarte organer er sammensatt av triacylglyceroler, steryl estere, en ytre fosfolipid monolag og tilhørende proteiner1. LDs opprinnelse i endoplasmatiske retikulum, utøve celle-syklus eller vekst-fase dynamikk, og er viktig for mobilnettet lipid homeostase1. LD-nummer og morfologi kan brukes som en praktisk proxy når assaying lipid metabolisme under ulike vekstforhold eller når screening et panel av mutanter. Gitt deres dynamiske natur, teknikker i stand til å analysere egenskapene til enkelte LDs er av spesiell interesse for studier av lipid metabolisme.
Ulike gjær arter har blitt brukt til å beskrive lipid-relaterte metabolske trasé og deres regulering, eller brukes i bioteknologi til å produsere interessante forbindelser eller brensel1. Videre, for modell gjær, slik som spirende gjær Saccharomyces cerevisiae eller fjernt relaterte fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe, Genova-Wide sletting belastning bibliotekene er tilgjengelige som kan brukes for høy gjennomstrømming skjermer4,5. Nylig ld sammensetning og dynamikk har blitt beskrevet i S. pombe6,7,8,9, og mutanter relatert til lipid metabolisme har blitt isolert i den nye modellen gjær Schizosaccharomyces japonicus10.
Det finnes mange teknikker for å studere LD-innhold og dynamikk. De fleste ansetter en slags farging av LDs med lipofile fargestoffer som Nile Red eller BODIPY 493/503. Sistnevnte viser mer smale eksitasjon og utslipp Spectra, og økt spesifisitet mot nøytrale lipider (LDs) i motsetning til fosfolipider (membraner)11. Fluorimetric og Flow-flowcytometri metoder har blitt brukt med hell i ulike fungal arter for å avdekke gener og vekstforhold som påvirker lagring lipid innhold12,13,14,15. Selv om disse metodene er egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømming, kan de ikke måle tallene og morfologi av individuelle LDs i celler, noe som kan variere dramatisk mellom vekstforhold og genotyper. Sammenhengende Raman spredning eller digital holografisk mikroskopi er Label-frie metoder som gir ld-nivå data, men krever spesialisert dyrt utstyr16,17,18. Fluorescens mikroskopi kan derimot gi detaljerte data om LD-innhold, samtidig som de bruker allment tilgjengelige instrumenter og verktøy for bildeanalyse. Det finnes flere analyse arbeidsflyter som har ulike grader av raffinement og automatisering i celle/ld-gjenkjenning fra bildedata, og er optimalisert for ulike celletyper, for eksempel metazoan-celler med stor LDs19,20 , 21, eller spirende gjær17,22,23. Noen av disse tilnærmingene fungerer bare i 2D (for eksempel på maks projeksjons bilder), som kan unnlate å beskrive det cellulære LD-innholdet på en pålitelig måte. Til vår kunnskap finnes det ingen verktøy for bestemmelse av LD-innhold og morfologi fra fisjon gjær mikroskopiske data. Utvikling av automatiserte og robuste LD-nivå analyser vil gi økt følsomhet og forbedret statistisk kraft, og gi rik informasjon om nøytralt lipid innhold, ideelt i flere gjær arter.
Vi har utviklet en arbeidsflyt for LD-innhold analyse fra 3D fluorescens mikroskopi bilder av gjærceller. Levende celler er farget med BODIPY 493/503 og Cascade Blue dextran å visualisere LDs og bestemme celle grenser, henholdsvis. Celler er immobilisert på glass lysbilder og utsatt for z-stack Imaging ved hjelp av et standard epifluorescence mikroskop. Bilder blir deretter behandlet av en automatisert rørledning implementert i MATLAB, en mye brukt (kommersiell) pakke for statistiske analyser. Rørledningen utfører forbehandling av bilder, segmentering (celler i forhold til bakgrunn, fjerning av døde celler) og LD-identifikasjon. Rike data på LD-nivå, for eksempel LD-størrelse og fluorescens intensitet, blir deretter gitt i tabellformat som er kompatible med viktige verktøy for regnearkprogrammer. Arbeidsflyten ble brukt med hell for å bestemme virkningen av nitrogen kilde tilgjengelighet på lipid metabolisme i S. pombe24. Vi viser nå funksjonaliteten til arbeidsflyten i s. pombe, s. japonicus og s. cerevisiae, ved hjelp av vekstforhold eller mutanter som påvirker mobilt ld-innhold.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

Lipid metabolisme og regulering er av interesse for både grunnleggende og anvendt biovitenskap og bioteknologi. I denne forbindelse er ulike gjær arter brukes som modeller i lipid metabolsk forskning eller for industriell lipid produksjon. Lipid dråper er svært dynamisk lagring organer og deres mobilnettet innhold representerer en praktisk avlesning av lipid metabolske tilstand. Fluorescens mikroskopi er en metode for valg for kvantitativ analyse av cellulære lipid dråper, som det er avhengig av allment tilgjengelig utstyr og tillater analyse av individuelle lipid dråper. Videre kan mikroskopisk bildeanalyse være automatisert, i stor grad øke samlet analyse gjennomstrømming. Her beskriver vi en eksperimentell og analytisk arbeidsflyt for automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av individuelle lipid dråper i tre forskjellige modell gjær arter: den fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe og Schizosaccharomyces japonicus, og den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. Lipid dråper er visualisere med BODIPY 493/503, og celle-ugjennomtrengelig fluorescerende dextran er lagt til kulturen Media for å identifisere celle grenser. Celler utsettes for 3D-epifluorescence mikroskopi i grønne og blå kanaler, og de resulterende z-stack-bildene behandles automatisk av en MATLAB-pipeline. Prosedyren utganger rike kvantitative data på mobilnettet lipid dråpe innhold og individuelle lipid dråpe egenskaper i tabellformat egnet for nedstrøms analyser i store regneark eller statistiske pakker. Vi gir eksempel analyser av lipid dråpe innhold under ulike forhold som påvirker mobilnettet lipid metabolisme.

Hele prosedyren er oppsummert i figur 1 for fisjon gjær (den spirende gjær arbeidsflyten er analogt), og nedenfor gir vi eksempler på hvordan arbeidsflyten kan brukes til å studere ld innhold i tre forskjellige gjær arter under ulike forhold kjent for å påvirke mobilt LD-innhold. Hvert eksempel representerer et enkelt biologisk eksperiment.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59889/59889fig01v2.jpg"><b...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Her presenterer vi en MATLAB implementering av automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av lipid dråper i fluorescens mikroskopi bilder av fisjon og spirende gjærceller.

Analyse av lipid dråpe innhold i fisjon og spirende gjær bruker automatisert image processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Denne protokollen forenkler kvantitative små-til-store analyser av cellulært lagring lipidinnhold i en rekke gjærarter og gjør det på en objektiv og standardisert måte. Teknikken gjør det mulig for rask behandling av mikroskopiske bilder og gir detaljerte kvantitative utganger for enkelt å sammenligne prøver som ulike mutanter og celler dyrket under ulike forhold. Til å begynne med følger du med i den medfølgende tekstprotokollen for å forberede fargeløsningene, kulturmediene og cellene.Sørg for at cellene er sunne og i ønsket vekstfase før du kjører eksperimentet. Deretter forbereder du en mikroskopdekslip for hver prøve som skal avbildes. Spred en mikroliter med glidebeleggoppløsning på en ren dekkglass ved hjelp av langsiden av en horisontalt plassert pipettespiss.La beleggoppløsningen tørke helt, og oppbevar deretter dekkglassene i et støvfritt miljø. Deretter måler du cellekulturenes optiske tettheter, og for at kulturer skal analyseres i samme vekstfase, prøv å nå lignende verdier blant alle testede kulturer for å sikre sammenlignbare eksperimentelle forhold. Deretter pipette en milliliter av cellekulturen i en 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør.Bare for S.cerevisiae-cellene legger du til fem mikroliter av lysbildebelegget til røret også. Deretter, kort virvel alle mikrocentrifuge rør, og inkubere dem på 30 grader Celsius med risting i fem minutter. Deretter legger du til en mikroliter av lipidfargingsløsningen til hver kultur aliquot, og virvler dem kort.Deretter legger du til 10 mikroliter av cellegrensevisualiseringsløsningen, og virvler dem kort en gang til. Samle cellene ved å sentrifugere dem på 1000 ganger tyngdekraften i tre minutter ved romtemperatur. Når du er ferdig med å spinne, fjern 950 mikroliter fra det overnaturante og gjenbruk cellene i de gjenværende supernatante ved hjelp av en pipette.Deretter pipette to mikroliter av tett celle suspensjon på en lectin-belagt coverslip. Deretter plasserer du dekkslippen på et rent mikroskoplysbilde for å danne en cellemonolag, og fortsett til mikroskopi så raskt som mulig for å minimere artefakter i bildebehandling. Oppsett av mikroskopet krever lange eksponeringer for sterke lyskilder som kan forårsake skade på prøven og skjevt resultater.Derfor kan du konfigurere bildeforholdene ved hjelp av et dedikert prøvelysbilde som ikke vil bli ytterligere brukt til lipiddråpekvantifisering. Plasser den dedikerte prøven på scenen i en fasekontrast eller differensial interferenskontrastmikroskopoppsett, og fokuser på cellene. I mikroskopets programvare angir du Z-stakkinnstillingene slik at de strekker seg over hele cellevolumet.Den totale vertikale avstanden avhenger av cellestørrelsen, og antall optiske skiver avhenger av målsettingens numeriske blenderåpning. Deretter setter du fokus for å bevege seg i forhold til det sentrale fokalplanet. For å bilde lipiddråper, still inn lysintensiteten og eksponeringstiden eksperimentelt i den grønne kanalen.Vær forsiktig når avbildning, da BODIPY er en veldig lys fluorokrom som raskt kan fotobleached. I tillegg minimere eksponeringstiden for å unngå overmetning. Fang opp den grønne kanalen Z-stakken først før du bytter til den blå kanalen for å unngå uskarphet av de mobile lipiddråpene.Til bildecellegrenser angir du eksperimentelt lysintensiteten og eksponeringstiden i den blå kanalen. Hvis det er mulig, kan du konfigurere og bruke en automatisert eksperimentell arbeidsflyt i mikroskopkontrollprogramvaren for å lette avbildning av flere prøver under standardiserte forhold. Viktigere, alle bilder må anskaffes ved hjelp av de samme innstillingene for å tillate riktig sammenligning mellom eksempler.Når bildeforholdene er optimalisert, fokuserer du på cellene og bilde dem i både de grønne og blå kanalene. Bilde flere synsfelt per eksempel for å få robuste, representative data. Lagre den blå og grønne kanalen Z-stabel bilder som 16-bit, flerlags TIFF-filer.Pass på å inkludere ordene grønne eller blå i de tilsvarende filnavnene. Åpne mikroskopiske bilder i ImageJ, og fjern eventuelle bildestabler som inneholder et betydelig antall celler som beveget seg under oppkjøpet. Disse vises i forskjellige posisjoner i individuelle Z-seksjoner.Deretter fjerner du eventuelle bildestabler som inneholder svært fluorescerende ikke-cellepartikler i den blå kanalen. Dette skyldes ofte smuss på bildeoverflaten eller urenheter i dyrkingsmediet og kan forstyrre påvisning av celler i deres nærhet. Fjern også eventuelle bildestabler som inneholder en stor andel døde celler.Disse bildene vil vise celler med økt blå fluorescens sammenlignet med de levende cellene. Mens tilstedeværelsen av noen døde celler i prøven er vanligvis ikke et problem, og disse cellene blir automatisk kassert under analyse, noen døde eller døende celler kan noen ganger bli anerkjent som levende celler av segmentering algoritmen og dermed skjev de rapporterte resultatene. For å starte analysen i MATLAB, må du først opprette en hovedmappe og kopiere alle MATLAB-skript til denne plasseringen.Deretter oppretter du undermapper med navnene på de ulike gjærartene, og kopierer de respektive TIFF-bildene til disse stedene. Start MATLAB, åpne manuset MAIN. m, og kjøre skriptet.I menyen velger du gjærartene som skal analyseres, og start bildebehandling. Inspiser og behandle utdatafilene etter behov ved hjelp av et regnearkredigeringsprogram eller en statistisk pakke. Arbeidsflyten produserer semikolondelte CSV-filer og segmenterte TIFF-filer med oppdagede celleobjekter og lipiddråper.Vist her er wild-type S.pombe celler som ble dyrket i enten det komplekse YES-mediet eller det definerte EMM-mediet. Sammenlignet med celler dyrket i YES-mediet, ble færre lipiddråper og høyere fargingsintensitet per enhet av cellevolum oppdaget i EMM-mediet. Videre var individuelle lipiddråper dannet i EMM-medium større og viste økt total fargeintensitet.Dette er i samsvar med tidligere funn av økt lagret lipidinnhold i celler dyrket i EMM. Deretter viser disse bildene S.japonicus celler fra eksponentielle og tidlig stasjonære kulturer dyrket i YES medium. Celler som kom inn i stasjonær fase viste et markert redusert antall lipiddråper per enhet av cellevolum, mens volum-normalisert lipid dråpe fluorescens intensiteten redusert litt mellom de to forholdene.De tidlige stasjonære lipiddråpene var vanligvis moderat større i størrelse og hadde moderat høyere total fluorescensintensitet sammenlignet med dråper fra eksponentielt voksende celler. I S.cerevisiae celler vokst til eksponentiell versus stasjonær fase, stasjonære celler inneholdt noe færre lipid dråper per volumenhet sammenlignet med eksponentielt voksende celler. Imidlertid ble deres volum-normaliserte dråpefluorescensintensitet nesten doblet.Denne kraftige økningen i det totale lipiddråpeinnholdet skyldtes den mye høyere fluorescensintensiteten og volumet av individuelle lipiddråper i stillestående fase. Etter denne fremgangsmåten kan utdata aggregeres i en statistisk pakke, for eksempel R, for å opprette plott med oppsummerte resultater og kjøre statistiske tester på eventuelle observerte forskjeller i lipiddråpeinnhold. I prinsippet kan bildebehandlingsrørledningen brukes til analyse av lipiddråpeinnhold i andre mikroorganismer eller for å analysere andre punktlignende subcellulære strukturer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Fastsettelse av Molecular Structures av HIV Konvolutt glykoproteiner bruker Cryo-Electron Tomography og Automated Sub-tomogram gjennomsnitt

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging av HIV-1-konvolutt-indusert virologisk Synapse og signaliserer på Syntetiske Lipid bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Tilrettelegging Drug Discovery: En automatisert høyt innhold Betennelse Assay i sebrafisk

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolering, bearbeiding og analyse av Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En semi-automatisert tilnærming til Klar Antistoff Cocktails for Immunophenotypic analyse av perifert blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatisert image-basert kvantifisering av nøytrofile ekstracellulære feller bruke NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatisert atferdsdata analyse av store C. elegans bestander bruke et bredt felt-of-view sporing Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Bildebehandling protokollen for analyse av spredningen og størrelse membran reseptorer av fluorescens mikroskopi

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...