Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Эта работа была поддержана Чарльзуниверситет гранты PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 и SVV 260310. Мы благодарим Ондржея Зебеста за помощь в микроскопии и разработке конвейера анализа изображений. Мы благодарим лабораторию ReGenEx за штаммы S. cerevisiae, а также лабораторию JapoNet и Хиронари Ники за штаммы S. japonicus. Ppc1-88 штамм был предоставлен Дрожжи генетический ресурсный центр Японии. Микроскопия проводилась в Лаборатории конфокальной и флуоресценцийной микроскопии, совместно финансируемой Европейским фондом регионального развития и государственным бюджетом Чешской Республики (Проект No. К.1.05/4.1.00/16.0347 и КЗ.2.16/3.1.00/21515).

1. Подготовка решений и средств массовой информации
<ol><li>
Подготовка липидного окрашивающего раствора.
	<ol>
<li>Для приготовления бульонного липидного окрашивающего растворения растворяются 10 мг BODIPY 493/503 в 10 мл ангидроусного ДМСО (окончательная концентрация 1 мг/мл). Растворите ?...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

Понимание липидного метаболизма и его регуляции имеет важное значение как для базовой биологии, так и для клинического и биотехнологического применения. Содержание ЛД представляет собой удобное считывание состояния липидного метаболизма клетки, при этом флуоресцентная микроскопия ?...

Липиды играют решающую роль в клеточной энергии и метаболизме углерода, синтезе мембранных компонентов и производстве биологически активных веществ. Липидный метаболизм дорабатывается в зависимости от условий окружающей среды, наличия питательных веществ и фазы1клеточного цикла. У людей метаболизм липидов был связан с такими заболеваниями, как ожирение, диабет II типа и рак2. В промышленности липиды, производимые микроорганизмами, такими как дрожжи, представляют собой перспективный источник возобновляемого дизельного топлива3. Клетки хранят нейтральные липиды в так называемых липидных каплях (ЛД). Эти эволюционно сохраненные тела состоят из триацилглицерола, стерилового эфира, внешнего фосфолипидного монослойного и связанных с ними белков1. ЛД возникают в эндоплазмической ретикулум, оказывают клеточного цикла или роста фазы динамики, и имеют важное значение для клеточного липидного гомеостаза1. LD номер и морфология может быть использован а также удобный прокси при анализе метаболизма липидов в различных условиях роста или при скрининге панели мутантов. Учитывая их динамичный характер, методы, способные анализировать свойства отдельных ЛД, представляют особый интерес в исследованиях липидного метаболизма.
Различные виды дрожжей были использованы для описания липидов связанных метаболических путей и их регулирования, или используется в биотехнологии для производства интересных соединений или топлива1. Кроме того, для модели дрожжей, таких как подающий надежды дрожжи Saccharomyces cerevisiae или отдаленно связанных деления дрожжей Schizosaccharomyces pombe, генома всей удаления деформации библиотеки доступны, которые могут быть использованы для высокой пропускной вещи экраны4,5. Недавно состав и динамика LD были описаны в S. pombe6,7,8,9,и мутанты, связанные с липидным метаболизмом, были изолированы в новых дрожжах модели Schizosaccharomyces japonicus10.
Многочисленные методы доступны для изучения содержания и динамики Ld. Большинство используют какой-то окрашивания LDs с липофильных красителей, таких как Нил Красный или BODIPY 493/503. Последний показывает более узкое возбуждение и спектры выбросов, а также повышенную специфичность в отношении нейтральных липидов (ЛД), в отличие от фосфолипидов (мембран)11. Фторметрические и цитометрии потока методы были успешно использованы в различных грибковых видов, чтобы раскрыть гены и условия роста, которые влияют на содержание липидовхранения 12,13,14,15. Хотя эти методы подходят для высокопроизводительных приложений, они не могут измерять числа и морфологию отдельных ЛД в клетках, которые могут значительно отличаться между условиями роста и генотипами. Когерентное раганского рассеяния или цифровой голографической микроскопии являются без этикетки методами, которые дают данные ld-уровня, но требуют специализированного дорогостоящего оборудования16,17,18. Флуоресценция микроскопии, с другой стороны, может обеспечить подробные данные о содержании ЛД, используя при этом широко доступные инструменты и программные средства анализа изображений. Существует несколько аналитических рабочих процессов, которые имеют различные степени сложности и автоматизации в обнаружении ячеек/Ld из данных изображений, и оптимизированы для различных типов клеток, таких как метазоановые клетки с большими LDs19,20 , 21, или подающий надежды дрожжи17,22,23. Некоторые из этих подходов работают только в 2D (например, на максимальных проекционных изображениях), которые могут не описать достоверно содержание клеточного ЛП. Насколько нам известно, не существует инструментов для определения содержания ЛД и морфологии от деления дрожжей микроскопических данных. Разработка автоматизированного и надежного анализа на уровне ЛД обеспечит повышенную чувствительность и повышение статистической мощи, а также даст богатую информацию о нейтральном содержании липидов, в идеале в нескольких видах дрожжей.
Мы разработали рабочий процесс для анализа содержания ЛД из 3D флуоресцентной микроскопии изображений дрожжевых клеток. Клетки жизни окрашены С BODIPY 493/503 и Каскад Синий dextran для визуализации LDs и определить границы клеток, соответственно. Клетки обездвижены на стеклянных слайдах и подвергаются z-стек изображений с помощью стандартного эпифлюоресцентного микроскопа. Изображения затем обрабатываются автоматизированным конвейером, внедряемым в MATLAB, широко используемом (коммерческом) пакете для статистического анализа. Конвейер выполняет предобработку изображения, сегментацию (клетки против фона, удаление мертвых ячеек) и идентификацию LD. Богатые данные ld-уровня, такие как размер ЛД и интенсивность флуоресценции, затем предоставляются в табликовом формате, совместимом с основными программными средствами электронной таблицы. Рабочий процесс был успешно использован для определения влияния наличия источников азота на метаболизм липидов в S. pombe24. Теперь мы демонстрируем функциональность рабочего процесса в S. pombe, S. japonicus и S. cerevisiae, используя условия роста или мутанты, которые влияют на содержание клеточного LD.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

Липидный метаболизм и его регулирование представляют интерес как для фундаментальных, так и для прикладных наук о жизни и биотехнологии. В этой связи различные виды дрожжей используются в качестве моделей в липидных метаболических исследованиях или для промышленного производства липидов. Липидные капли являются высокодинамическими телами хранения, и их клеточное содержание представляет собой удобное считывание липидного метаболического состояния. Флуоресцентная микроскопия является методом выбора для количественного анализа клеточных липидных капель, так как он опирается на широко доступное оборудование и позволяет анализ отдельных липидных капель. Кроме того, микроскопический анализ изображений может быть автоматизирован, что значительно увеличивает общую пропускную мощность анализа. Здесь мы описываем экспериментальный и аналитический рабочий процесс для автоматизированного обнаружения и количественного описания отдельных липидных капель в трех различных видов дрожжей модели: расщепление дрожжей Schizosaccharomyces pombe и Schizosaccharomyces japonicus, и подающий надежды дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Липидные капли визуализированы с помощью BODIPY 493/503, а клеточный флуоресцентный декетр добавляется в культурные носители, чтобы помочь определить границы клеток. Клетки подвергаются 3D эпифлюоресценции микроскопии в зеленых и синих каналах и в результате z-стек изображения обрабатываются автоматически трубопровода MATLAB. Процедура выводит богатые количественные данные о содержании клеточных липидных капель и индивидуальных характеристиках липидных капель в табличном формате, пригодном для анализа вниз по течению в основных электронных таблицах или статистических пакетах. Мы предоставляем пример ы анализ содержания липидных капель в различных условиях, которые влияют на клеточный метаболизм липидов.

Вся процедура обобщена в рисунке 1 для дрожжей деления (подающий надежды дрожжей рабочий процесс является аналогичным), а ниже мы приведены примеры того, как рабочий процесс может быть использован для изучения содержания ЛД в трех различных видов дрожжей в различных усл...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Здесь мы представляем MATLAB реализации автоматизированного обнаружения и количественного описания липидных капель в флуоресценционной микроскопии изображения деления и подающий надежды дрожжевых клеток.

Анализ содержания капель Lipid в делении и подающих надежды дрожжах с использованием автоматизированной обработки изображений

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Этот протокол облегчает количественный мелко-масштабный анализ содержания липидов клеточного хранения в различных видах дрожжей и делает это непредвзято и стандартизировано. Техника позволяет быстро обрабатывать микроскопические изображения и обеспечивает подробные количественные результаты, чтобы легко сравнить образцы, такие как различные мутанты и клетки, выращенные в различных условиях. Для начала следуйте в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы подготовить решения для окрашивания, культурные средства массовой информации и клетки.Убедитесь, что клетки здоровы и находятся в желаемой фазе роста до запуска эксперимента. Затем подготовьте обложку микроскопа для каждого образца, который будет изображен. Распространение одного микролитров слайд-покрытия раствора на чистый coverslip с помощью длинной стороны горизонтально расположены пипетки отзыв.Разрешить покрытие раствор полностью высохнуть, а затем хранить крышки в без пыли окружающей среды. Далее, измерить оптическую плотность клеточных культур, и для культур, которые будут проанализированы в той же фазе роста, попытаться достичь аналогичных значений среди всех проверенных культур для обеспечения сопоставимых экспериментальных условий. Затем пипетка один миллилитр клеточной культуры в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.Только для клеток S.cerevisiae добавьте в трубку пять микролитров раствора слайд-покрытия. Затем, кратко вихрем все микроцентрифуг трубки, и инкубировать их при 30 градусов по Цельсию с встряхивания в течение пяти минут. Далее добавьте один микролитер раствора липидного окрашивания в каждую культуру aliquot, и вихрь их кратко.Затем добавьте 10 микролитров раствора визуализации границы ячейки и кратко вихрем во второй раз. Соберите клетки путем центрифугирования их при 1000 раз тяжести в течение трех минут при комнатной температуре. Когда закончите вращаться, удалить 950 микролитров из супернатанта и повторно использовать клетки в оставшихся supernatant с помощью пипетки.Далее, пипетки два микролитров плотной клеточной подвески на лектин покрытием крышки. Затем поместите крышку на чистый слайд микроскопа, чтобы сформировать монослой клетки, и перейти к микроскопии как можно быстрее, чтобы свести к минимуму артефакты в изображении. Настройка микроскопа требует длительного воздействия сильных источников света, которые могут привести к повреждению образца и искажению результатов.Таким образом, настроить условия изображения с помощью выделенного слайда образца, который не будет использоваться для количественной оценки липидных капель. Поместите выделенный образец на стадию установки контрастного или дифференциального интерференционного микроскопа и сосредоточьтесь на клетках. В программном обеспечении микроскопа установите настройки стека, чтобы они охватывают весь объем ячейки.Общее вертикальное расстояние зависит от размера ячейки, а количество оптических срезов зависит от численного отверстия цели. Затем установите фокус для перемещения по отношению к центральной фокусной плоскости. Для изображения липидных капель, экспериментально установить интенсивность света и время экспозиции в зеленом канале.Будьте осторожны при визуализации, так как BODIPY является очень ярким флюорохромом, который может быть быстро фотоотвеч. Кроме того, свести к минимуму время экспозиции, чтобы избежать перенасыщения. Захват полного зеленого канала - стек, прежде чем перейти на синий канал, чтобы предотвратить размытие мобильных липидных капель.Для границ клеток изображения экспериментально установите интенсивность света и время экспозиции в синем канале. По возможности на настройку и использование автоматизированного экспериментального рабочего процесса в программном обеспечении для управления микроскопом для облегчения визуализации нескольких образцов в стандартизированных условиях. Важно отметить, что все изображения должны быть получены с использованием тех же параметров, чтобы обеспечить надлежащее сравнение между образцами.После оптимизации условий визуализации сосредоточьтесь на клетках и изумите их как в зеленых, так и в синих каналах. Изображение нескольких полей зрения на выборку для получения надежных репрезентативных данных. Сохранить синий и зеленый канал - стек изображения, как 16-битный, многослойный TIFF файлов.Обязательно включите слова зеленый или синий в соответствующие имена файлов. Откройте микроскопические изображения в ImageJ и удалите все стеки изображений, содержащие значительное количество ячеек, которые перемещались во время приобретения. Они отображаются на разных позициях в отдельных разделах.Затем удалите все стеки изображений, содержащие высокофлуоресцентные неклеточные частицы в синем канале. Это часто вызвано грязью на поверхности изображения или примесями в среде культивирования и может помешать обнаружению клеток в их окрестностях. Кроме того, удалите все стеки изображений, содержащие большую часть мертвых ячеек.На этих изображениях будут отображаться клетки с повышенной синей флуоресценцией по сравнению с живыми клетками. Хотя наличие нескольких мертвых клеток в образце, как правило, не является проблемой, и эти клетки автоматически отбрасываются во время анализа, некоторые мертвые или умирающие клетки иногда могут быть признаны живыми клетками алгоритмом сегментации и, таким образом, исказить результаты. Чтобы начать анализ в MATLAB, сначала создайте основную папку и скопировать все скрипты MATLAB в это место.Затем создайте субфолдеры с названиями различных видов дрожжей и скопируйте соответствующие изображения TIFF в этих местах. Теперь начните MATLAB, откройте скрипт MAIN. м, и запустить сценарий.В меню выберите вид дрожжей для анализа и начните обработку изображений. Проверка и обработка выходных файлов по мере необходимости с помощью редактора электронной таблицы или статистического пакета. Рабочий процесс производит полуколонированные файлы CSV и сегментированные файлы TIFF с обнаруженными клеточными объектами и липидными каплями.Здесь показаны клетки дикого типа S.pombe, выращенные либо в сложной среде YES, либо в определенной среде EMM. По сравнению с клетками, выращенными в среде YES, в среде EMM было обнаружено меньше липидных капель и более высокая интенсивность окрашивания на единицу объема клеток. Кроме того, отдельные липидные капли, образуюющиеся в среде ЭММ, были крупнее и демонстрировали повышенную общую интенсивность окрашивания.Это в согласии с предыдущими выводами увеличения содержания липидов в клетках, выращенных в ЭММ. Далее на этих снимках показаны клетки S.japonicus из экспоненциальных и ранних стационарных культур, выращенных в среде YES. Клетки, поступающие в стационарную фазу, показали заметное снижение количества липидных капель на единицу объема клеток, в то время как нормализоваемая интенсивность липидной капли флуоресценции несколько снизилась между двумя условиями.Ранние стационарные фазы липидных капель, как правило, умеренно больше по размеру и умеренно выше общая интенсивность флуоресценции по сравнению с каплями из экспоненциально растущих клеток. В S.cerevisiae клетки выросли до экспоненциальной по сравнению со стационарной фазы, стационарные клетки содержали несколько меньше липидных капель на единицу объема по сравнению с экспоненциально растущих клеток. Тем не менее, их объем нормализованных капель флуоресценции интенсивность почти в два раза.Это резкое увеличение общего содержания липидных капель было связано с гораздо более высокой интенсивностью флуоресценции и объемом отдельных липидных капель в стационарной фазе. Следуя этой процедуре, выходные данные могут быть агрегированы в статистическом пакете, таком как R, для создания участков обобщенных результатов и проведения статистических тестов на любые наблюдаемые различия в содержании липидных капель. В принципе, конвейер обработки изображений может быть использован для анализа содержания липидных капель в других микроорганизмах или для анализа других точечных субклеточных структур.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Определение молекулярной структуры гликопротеинов ВИЧ Конверт использованием крио-электронной томографии и автоматизированных Sub-томограмма усреднения

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Изображений ВИЧ-1 Envelope-индуцированной Вирусологические Synapse и сигнализации на синтетической Бислои липидов

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Содействие Drug Discovery: Автоматизированные высокого содержания воспаление Анализ в данио рерио

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Изоляция, обработки и анализа мышиного десен Клетки

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Полуавтоматический подход к подготовке антител коктейли Иммунофенотипирование периферической крови человека

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Визуализация биопленки в Candida albicans с помощью автоматизированных Microfluidic устройства

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Автоматизированная количественная оценка нейтрофилов с использованием NET-UANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Автоматизированная поведенческого анализа больших C. elegans населения с помощью широкого поля зрения отслеживания платформа

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Изображений, обработки протокол для анализа распространения и размер кластера мембранных рецепторов по микроскопии флуоресцирования

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...