Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por las becas de la Universidad Charles PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 y SVV 260310. Agradecemos a Ond-ej éebesta por la ayuda con la microscopía y el desarrollo de la canalización de análisis de imágenes. Agradecemos al laboratorio de ReGenEx por las cepas de S. cerevisiae, y al laboratorio de JapoNet y Hironori Niki para las cepas de S. japonicus. La cepa ppc1-88 fue proporcionada por The Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopía se realizó en el Laboratorio de Microscopía Confocal y fluorescencia cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el presupuesto estatal de la República Checa (Proyecto no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 y CZ.2.16/3.1.00/21515).

1. Preparación de soluciones y medios de comunicación
<ol><li>
Prepare la solución de tinción de lípidos.
	<ol>
<li>Para preparar la solución de tinción de lípidos en stock disolver 10 mg de BODIPY 493/503 en 10 ml de DMSO anhidro (concentración final 1 mg/ml). Disolver todo el contenido de un vial de 10 mg de BODIPY 493/503 para evitar la pérdida de material durante el pesaje. PRECAUCION: La DMSO puede pasar a través de la piel. Use el equipo de protección personal adec...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

La comprensión del metabolismo lipídico y su regulación es importante tanto para la biología básica, como para las aplicaciones clínicas y biotecnológicas. El contenido de LD representa una lectura conveniente del estado del metabolismo de los lípidos de la célula, siendo la microscopía de fluorescencia uno de los principales métodos utilizados para la determinación del contenido de LD. El protocolo presentado permite la detección automatizada y la descripción cuantitativa de los D Individuales en tres espe...

Los lípidos desempeñan un papel crucial en la energía celular y el metabolismo del carbono, la síntesis de componentes de membrana y la producción de sustancias bioactivas. El metabolismo de los lípidos se ajusta según las condiciones ambientales, la disponibilidad de nutrientes y la fase1del ciclo celular. En los seres humanos, el metabolismo de los lípidos se ha conectado a enfermedades, como la obesidad, la diabetes tipo II y el cáncer2. En la industria, los lípidos producidos por microorganismos, como las levaduras, representan una fuente prometedora de combustibles diésel renovables3. Las células almacenan lípidos neutros en las llamadas gotas lipídicas (LD). Estos cuerpos evolutivamente conservados se componen de triacilgliceroles, ésteres de esteril, una monocapa fosfolípido externa y proteínas asociadas1. Los LM se originan en el retículo endoplasmático, ejercen dinámicas de ciclo celular o fase de crecimiento, y son importantes para la homeostasis lipídica celular1. El número de LD y la morfología se pueden utilizar como un proxy conveniente al analizar el metabolismo de los lípidos bajo diversas condiciones de crecimiento o al examinar un panel de mutantes. Dada su naturaleza dinámica, las técnicas capaces de analizar las propiedades de los DNl individuales son de particular interés en los estudios del metabolismo lipídico.
Varias especies de levadura se han utilizado para describir las vías metabólicas relacionadas con los lípidos y su regulación, o se utilizan en la biotecnología para producir compuestos o combustibles interesantes1. Además, para levaduras modelo, tales como la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae o la levadura de fismo distantemente relacionada Schizosaccharomyces pombe, se encuentran disponibles bibliotecas de cepas de eliminación en todo el genoma que se pueden utilizar para un alto rendimiento pantallas4,5. Recientemente la composición y dinámica de LD se han descrito en S. pombe6,7,8,9, y mutantes relacionados con el metabolismo lipídico se han aislado en el modelo emergente de levadura Schizosaccharomyces japonicus10.
Numerosas técnicas están disponibles para estudiar el contenido y la dinámica de LD. La mayoría emplea algún tipo de tinción de Lutsisconlos con colorantes lipofílicos como Nile Red o BODIPY 493/503. Este último muestra espectros de excitación y emisión más estrechos, y una mayor especificidad hacia los lípidos neutros (LD) en comparación con los fosfolípidos (membranas)11. Los métodos fluorimétricos y de citometría de flujo se han utilizado con éxito en varias especies de hongos para descubrir genes y condiciones de crecimiento que afectan al contenido de lípidos de almacenamiento12,13,14,15. Si bien estos métodos son adecuados para aplicaciones de alto rendimiento, no pueden medir el número y la morfología de los D Individuales en las células, lo que puede diferir drásticamente entre las condiciones de crecimiento y los genotipos. La dispersión coherente de Raman o la microscopía holográfica digital son métodos sin etiquetas que producen datos a nivel de LD, pero requieren equipos especializados y costosos16,17,18. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, puede proporcionar datos detallados sobre el contenido de LD, al tiempo que utiliza instrumentos comúnmente disponibles y herramientas de software de análisis de imágenes. Existen varios flujos de trabajo de análisis que cuentan con varios grados de sofisticación y automatización en la detección de celdas/LD a partir de datos de imagen, y están optimizados para diferentes tipos de celdas, como células metazoanas con grandes LD19,20 , 21, o levaduras en ciernes17,22,23. Algunos de estos enfoques solo funcionan en 2D (por ejemplo, en imágenes de proyección máxima), lo que puede no describir de forma fiable el contenido de LD celular. Hasta nuestro conocimiento, no existen herramientas para la determinación del contenido de LD y la morfología a partir de datos microscópicos de levadura de fesión. El desarrollo de análisis automatizados y robustos a nivel de LD traería mayor sensibilidad y mayor potencia estadística, y proporcionaría información rica sobre el contenido de lípidos neutros, idealmente en múltiples especies de levaduras.
Hemos desarrollado un flujo de trabajo para el análisis de contenido LD a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de células de levadura. Las celdas vivas se tiñen con BODIPY 493/503 y Cascade Blue dextran para visualizar los DD y determinar los límites de las celdas, respectivamente. Las células se inmovilizan en diapositivas de vidrio y se someten a imágenes de pila z utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar. Las imágenes son procesadas por una canalización automatizada implementada en MATLAB, un paquete ampliamente utilizado (comercial) para análisis estadísticos. La canalización realiza el preprocesamiento de imágenes, la segmentación (células frente al fondo, la eliminación de celdas muertas) y la identificación de LD. Los datos enriquecidos a nivel de LD, como el tamaño de LD y la intensidad de la fluorescencia, se proporcionan en un formato tabular compatible con las principales herramientas de software de hoja de cálculo. El flujo de trabajo se utilizó con éxito para determinar el impacto de la disponibilidad de la fuente de nitrógeno en el metabolismo de los lípidos en S. pombe24. Ahora demostramos la funcionalidad del flujo de trabajo en S. pombe, S. japonicus y S. cerevisiae,utilizando condiciones de crecimiento o mutantes que afectan el contenido de LD celular.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

El metabolismo de los lípidos y su regulación son de interés tanto para las ciencias básicas y aplicadas de la vida como para la biotecnología. En este sentido, varias especies de levadura se utilizan como modelos en la investigación metabólica de lípidos o para la producción de lípidos industriales. Las gotas lipídicas son cuerpos de almacenamiento altamente dinámicos y su contenido celular representa una lectura conveniente del estado metabólico lipídico. La microscopía de fluorescencia es un método de elección para el análisis cuantitativo de gotas de lípidos celulares, ya que se basa en equipos ampliamente disponibles y permite el análisis de gotas de lípidos individuales. Además, el análisis microscópico de imágenes se puede automatizar, lo que aumenta considerablemente el rendimiento general del análisis. Aquí, describimos un flujo de trabajo experimental y analítico para la detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos individuales en tres especies de levaduras de modelo diferentes: las levaduras de fission Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces japonicus, y la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. Las gotas de lípidos se visualizan con BODIPY 493/503, y el dextran fluorescente impermeable a la celda se agrega a los medios de cultivo para ayudar a identificar los límites celulares. Las células se someten a microscopía de epifluorescencia 3D en canales verdes y azules y las imágenes de la pila z resultantes se procesan automáticamente mediante una canalización matlab de MATLAB. El procedimiento genera datos cuantitativos enriquecidos sobre el contenido de gotas de lípidos celulares y las características individuales de las gotas de lípidos en un formato tabular adecuado para análisis posteriores en hojas de cálculo principales o paquetes estadísticos. Proporcionamos análisis de ejemplo del contenido de gotas de lípidos bajo diversas condiciones que afectan el metabolismo celular de los lípidos.

Todo el procedimiento se resume en la Figura 1 para las levaduras de fisión (el flujo de trabajo de levadura en ciernes es análogo), y a continuación proporcionamos ejemplos de cómo el flujo de trabajo se puede utilizar para estudiar el contenido de LD en tres especies de levadura diferentes en diversas condiciones conocidas para afectar el contenido de LD celular. Cada ejemplo representa un único experimento biológico.
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Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Aquí, presentamos una implementación de MATLAB de detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos en imágenes de microscopía de fluorescencia de fission y células de levadura en ciernes.

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Este protocolo facilita los análisis cuantitativos a pequeña y gran escala del contenido de lípidos de almacenamiento celular en una variedad de especies de levaduras y lo hace de manera imparcial y estandarizada. La técnica permite el procesamiento rápido de imágenes microscópicas y proporciona salidas cuantitativas detalladas para comparar fácilmente muestras como varios mutantes y células cultivadas bajo diversas condiciones. Para comenzar, siga el protocolo de texto que lo acompaña para preparar las soluciones de tinción, los medios de cultivo y las células.Asegúrese de que las células estén sanas y en la fase de crecimiento deseada antes de ejecutar el experimento. A continuación, prepare un cubreobjetos de microscopio para cada muestra a tomar imágenes. Extienda un microlitro de solución de recubrimiento deslizante en un cubreobjetos limpio utilizando el lado largo de una punta de pipeta colocada horizontalmente.Deje que la solución de recubrimiento se seque por completo y, a continuación, almacene los cubreobjetos en un ambiente libre de polvo. A continuación, medir las densidades ópticas de los cultivos celulares, y para que los cultivos se analicen en la misma fase de crecimiento, tratar de alcanzar valores similares entre todos los cultivos probados para asegurar condiciones experimentales comparables. Luego, pipetear un mililitro del cultivo celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Sólo para las células S.cerevisiae, agregue cinco microlitros de la solución de recubrimiento deslizante al tubo también. Luego, voró brevemente todos los tubos de microcentrífuga, e incubarlos a 30 grados Celsius con temblor durante cinco minutos. A continuación, agregue un microlitro de la solución de tinción de lípidos a cada alícuota de cultivo, y vórtice brevemente.A continuación, agregue 10 microlitros de la solución de visualización de límites de celda y vórqueles brevemente una segunda vez. Recoger las células centrifugando a 1.000 veces la gravedad durante tres minutos a temperatura ambiente. Cuando termine de girar, retire 950 microlitros del sobrenadante y resusppend las celdas en el sobrenadante restante usando una pipeta.A continuación, pipetear dos microlitros de la suspensión de células densas en un cubreobjeto recubierto de lectina. A continuación, coloque el cubreobjetos en una diapositiva de microscopio limpia para formar una monocapa celular y proceda a la microscopía lo más rápido posible para minimizar los artefactos en la toma de imágenes. La configuración del microscopio requiere exposiciones prolongadas a fuentes de luz fuertes que podrían causar daños en la muestra y sesgar los resultados.Por lo tanto, configure las condiciones de imagen utilizando una diapositiva de muestra dedicada que no se utilizará más para la cuantificación de gotas de lípidos. Coloque la muestra dedicada en la etapa de una configuración del microscopio de contraste de fase o de interferencia diferencial y concéntrese en las células. En el software del microscopio, establezca los ajustes de la pila Z para que abarquen todo el volumen de la célula.La distancia vertical total depende del tamaño de la celda y el número de sectores ópticos depende de la apertura numérica del objetivo. A continuación, establezca el foco para que se mueva en relación con el plano focal central. Para crear una imagen de gotas de lípidos, establezca experimentalmente la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal verde.Tenga cuidado al tomar imágenes, ya que BODIPY es un fluorocromo muy brillante que puede ser rápidamente fotoblancada. Además, minimice el tiempo de exposición para evitar la sobresaturación. Capture primero el canal verde completo Z-stack antes de cambiar al canal azul para evitar desenfocar las gotas de lípidos móviles.Para crear una imagen de los límites de las celdas, establezca experimentalmente la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal azul. Si es posible, configure y utilice un flujo de trabajo experimental automatizado en el software de control del microscopio para facilitar la toma de imágenes de varias muestras en condiciones estandarizadas. Es importante destacar que todas las imágenes deben adquirirse utilizando la misma configuración para permitir una comparación adecuada entre muestras.Una vez optimizadas las condiciones de imagen, concéntrese en las celdas e irégenes en los canales verde y azul. Imagine varios campos de vista por muestra para obtener datos sólidos y representativos. Guarde las imágenes de la pila Z del canal azul y verde como archivos TIFF multicapa de 16 bits.Asegúrese de incluir las palabras verde o azul en los nombres de archivo correspondientes. Abra imágenes microscópicas en ImageJ y elimine las pilas de imágenes que contengan un número considerable de celdas que se movieron durante la adquisición. Estos aparecen en diferentes posiciones en secciones Z individuales.A continuación, elimine las pilas de imágenes que contengan partículas no celulares altamente fluorescentes en el canal azul. Esto a menudo es causado por la suciedad en la superficie de la imagen o las impurezas en el medio de cultivo y puede interferir con la detección de células en sus proximidades. Además, elimine las pilas de imágenes que contengan una gran proporción de celdas muertas.Estas imágenes mostrarán celdas con mayor fluorescencia azul en comparación con las células vivas. Si bien la presencia de algunas células muertas en la muestra no suele ser un problema y estas células se descartan automáticamente durante el análisis, algunas células muertas o moribundas ocasionalmente pueden ser reconocidas como células vivas por el algoritmo de segmentación y, por lo tanto, sesgar los resultados notificados. Para comenzar el análisis en MATLAB, primero cree una carpeta principal y copie todos los scripts de MATLAB en esta ubicación.A continuación, cree subcarpetas con los nombres de las distintas especies de levaduras y copie las imágenes TIFF respectivas en estas ubicaciones. Ahora, inicie MATLAB, abra el script MAIN. m, y ejecute el script.En el menú, seleccione las especies de levadura que desea analizar e inicie el procesamiento de imágenes. Inspeccione y procese los archivos de salida según sea necesario mediante un editor de hojas de cálculo o un paquete estadístico. El flujo de trabajo produce archivos CSV separados por punto y coma y archivos TIFF segmentados con objetos de celda detectados y gotas de lípidos.Aquí se muestran células S.pombe de tipo salvaje que se cultivaron en el medio complejo YES o en el medio EMM definido. En comparación con las células cultivadas en el medio YES, se detectaron menos gotas de lípidos y una mayor intensidad de tinción por unidad de volumen celular en el medio EMM. Además, las gotas lipídicas individuales formadas en el medio EMM eran más grandes y mostraban una mayor intensidad total de tinción.Esto está de acuerdo con los hallazgos anteriores de un aumento del contenido de lípidos almacenados en células cultivadas en EMM. A continuación, estas imágenes muestran células S.japonicus de cultivos exponenciales y estacionarios tempranos cultivados en el medio YES. Las células que entraban en fase estacionaria mostraron una disminución notable del número de gotas lipídicas por unidad de volumen celular, mientras que la intensidad de fluorescencia de gotas lipídicas normalizada en volumen disminuyó ligeramente entre las dos condiciones.Las primeras gotas de lípidos en fase estacionaria eran típicamente moderadamente más grandes en tamaño y tenían una intensidad de fluorescencia total moderadamente mayor en comparación con las gotas de las células que crecen exponencialmente. En las células S.cerevisiae cultivadas en fase exponencial versus estacionaria, las células estacionarias contenían algo menos de gotas lipídicas por unidad de volumen en comparación con las células de crecimiento exponencial. Sin embargo, su intensidad de fluorescencia de gotas normalizada por volumen casi se duplicó.Este fuerte aumento en el contenido general de gotas lipídicas se debió a la intensidad de fluorescencia mucho mayor y al volumen de gotas lipídicas individuales en fase estacionaria. Después de este procedimiento, los datos de salida se pueden agregar en un paquete estadístico como R para crear gráficas de resultados resumidos y ejecutar pruebas estadísticas sobre cualquier diferencia observada en el contenido de gotas de lípidos. En principio, la canalización de procesamiento de imágenes se puede utilizar para el análisis del contenido de gotas de lípidos en otros microorganismos o para analizar otras estructuras subcelulares similares a puntos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Investigación

Inmunología e Infección

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Un enfoque semi-automatizado de preparación de cócteles de anticuerpos para el Análisis Inmunofenotípicos de la sangre periférica humana

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Análisis conductual de gran C. elegans las poblaciones utilizando un amplio campo de visión de seguimiento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...