Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 och SVV 260310. Vi tackar Ondřej ŠEBESTA för hjälp med mikroskopi och utveckling av bilden analyspipeline. Vi tackar ReGenEx Lab för s. cerevisiae stammar, och Japonet och Hironori Niki ' s Lab för s. japonicus stammar. Den ppc1-88 stammen tillhandahölls av jästen genetiska resurs Center Japan. Mikroskopi utfördes i laboratoriet av Konfokal och fluorescens mikroskopi medfinansierat av Europeiska regionala utvecklingsfonden och Tjeckiens statsbudget (Projektnr. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 och CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. beredning av lösningar och media
<ol><li>
Förbered lipidfärgnings lösning.
	<ol>
<li>För att förbereda lager lipid färgning lösning lös 10 mg BODIPY 493/503 i 10 mL vattenfri DMSO (slutlig koncentration 1 mg/mL). Lös upp hela innehållet i en 10 mg BODIPY 493/503 injektionsflaska för att förhindra förlust av material under vägning. Försiktighet: DMSO kan passera genom huden. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.</li>
		<li>Förbered arbetande lipidfärgning ...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

Förståelsen av lipidmetabolismen och dess reglering är viktig för både grundläggande biologi, och kliniska och bioteknologiska tillämpningar. LD innehåll utgör en bekväm avläsning av lipidmetabolismen tillståndet i cellen, med fluorescens mikroskopi är en av de viktigaste metoderna som används för LD innehåll bestämning. Det presenterade protokollet möjliggör automatisk detektering och kvantitativ beskrivning av enskilda LDs i tre olika och morfologiskt distinkta jästarter. Till vår kännedom finns i...

Lipider spelar en avgörande roll i cellernas energi-och koldioxidmetabolism, syntes av membran komponenter och produktion av bioaktiva substanser. Lipid metabolism finjusteras enligt miljöförhållanden, näringsämnes tillgänglighet och cell-Cycle fas1. Hos människor, lipid metabolism har kopplats till sjukdomar, såsom fetma, typ II diabetes och cancer2. Inom industrin utgör lipider som produceras av mikroorganismer, såsom jästsvampar, en lovande källa till förnybara dieselbränslen3. Celler lagrar neutrala lipider i så kallade lipiddroppar (LDs). Dessa bevarade evolutionärt förkroppsligar komponeras av triacylglycerols, steryl estrar, en yttre fosfolipid enskiktslager och tillhörande proteiner1. LDs har sitt ursprung i endoplasmatiska Retikulum, utöva cell-Cycle eller tillväxt-fas dynamik, och är viktiga för cellulära lipid homeostas1. LD nummer och morfologi kan användas som en bekväm proxy när testmetoder lipid metabolism under olika tillväxtförhållanden eller när screening en panel av mutanter. Med tanke på deras dynamiska karaktär, tekniker som kan analysera egenskaperna hos enskilda LDs är av särskilt intresse i studier av lipidmetabolismen.
Olika jästarter har använts för att beskriva lipidrelaterade metaboliska vägar och deras reglering, eller används i bioteknik för att producera intressanta föreningar eller bränslen1. Dessutom, för modell jäst, såsom spirande jäst Saccharomyces cerevisiae eller avlägset relaterade fission jäst Schizosaccharomyces pombe, genomomfattande borttagning stam bibliotek finns tillgängliga som kan användas för hög genomströmning skärmar4,5. Nyligen LD sammansättning och dynamik har beskrivits i S. pombe6,7,8,9, och mutanter relaterade till lipidmetabolismen har isolerats i den framväxande modellen jäst Schizosaccharomyces japonicus10.
Det finns många tekniker för att studera LD-innehåll och dynamik. De flesta anställer någon form av färgning av LDs med lipofila färgämnen som Nile Red eller BODIPY 493/503. Den senare visar mer smala excitation och emission Spectra, och ökad specificitet mot neutrala lipider (LDs) i motsats till fosfolipider (membran)11. Fluorimetriska och flödescytometri metoder har använts framgångsrikt i olika svamparter att avslöja gener och tillväxtförhållanden som påverkar lagring lipidhalten12,13,14,15. Även om dessa metoder lämpar sig för tillämpningar med högt dataflöde kan de inte mäta antalet och morfologin hos enskilda LDs i celler, vilket kan skilja sig dramatiskt mellan tillväxtförhållanden och genotyper. Sammanhängande Raman spridning eller digital holografisk mikroskopi är etikettfria metoder som ger LD-nivå data, men kräver specialiserad dyr utrustning16,17,18. Fluorescens mikroskopi, å andra sidan, kan ge detaljerade uppgifter om LD innehåll, samtidigt som de använder allmänt tillgängliga instrument och bildanalys mjukvaruverktyg. Flera analys arbetsflöden finns som har olika grader av förfining och automatisering i cell/LD-detektering från bilddata, och är optimerade för olika celltyper, till exempel metazoan celler med stora LDs19,20 , 21, eller blivande jästsvampar17,22,23. Vissa av dessa metoder fungerar bara i 2D (t. ex. på maximala projektionsbilder), vilket kan undgå att tillförlitligt beskriva det cellulära LD-innehållet. Till vår kännedom, inga verktyg finns för bestämning av LD innehåll och morfologi från fission jäst mikroskopiska data. Utveckling av automatiserade och robusta LD-nivåanalyser skulle ge ökad känslighet och ökad statistisk kraft, och ge rik information om neutralt lipidinnehåll, helst i flera jästarter.
Vi har utvecklat ett arbetsflöde för LD innehållsanalys från 3D fluorescens mikroskopi bilder av jästceller. Levande celler färgas med BODIPY 493/503 och Cascade Blue dextran att visualisera LDs och bestämma cell gränser, respektive. Cellerna är immobiliserade på glas rutschbanor och utsätts för z-stack Imaging med hjälp av ett standard epifluorescensmikroskopi Mikroskop. Bilderna bearbetas sedan av en automatiserad pipeline som implementeras i MATLAB, ett allmänt använt (kommersiellt) paket för statistiska analyser. Pipelinen utför bildförbehandling, segmentering (celler kontra bakgrund, borttagning av döda celler) och LD-identifiering. Rich LD-nivådata, som LD-storlek och fluorescensintensitet, tillhandahålls sedan i ett tabellformat som är kompatibelt med större kalkylbladsverktyg. Arbetsflödet har använts framgångsrikt för att bestämma effekten av kvävekälla tillgänglighet på lipidmetabolismen i S. pombe24. Vi visar nu funktionaliteten i arbetsflödet i s. pombe, s. japonicus och s. cerevisiae, med hjälp av tillväxtvillkor eller mutanter som påverkar cellulära LD innehåll.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

Lipidmetabolismen och dess reglering är av intresse för både grund-och tillämpad biovetenskap och bioteknik. I detta avseende, olika jästarter används som modeller i lipid metabolisk forskning eller för industriell lipidproduktion. Lipiddroppar är mycket dynamisk lagring organ och deras cellulära innehåll representerar en bekväm avläsning av lipidmetaboliska tillstånd. Fluorescensmikroskopi är en metod att välja för kvantitativ analys av cellulära lipiddroppar, eftersom den förlitar sig på allmänt tillgänglig utrustning och möjliggör analys av enskilda lipiddroppar. Dessutom kan mikroskopisk bildanalys automatiseras, kraftigt öka övergripande analys genomströmning. Här beskriver vi ett experimentellt och analytiskt arbetsflöde för automatiserad detektering och kvantitativ beskrivning av enskilda lipiddroppar i tre olika modell jästarter: fission jäst Schizosaccharomyces pombe och Schizosaccharomyces japonicus, och den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. Lipiddroppar visualiseras med BODIPY 493/503, och cell-impermeable fluorescerande dextran läggs till kulturen medierna att hjälpa till att identifiera cell gränser. Celler utsätts för 3D-epifluorescens-mikroskopi i gröna och blåa kanaler och de resulterande z-stackbilderna bearbetas automatiskt av en MATLAB-pipeline. Proceduren visar rika kvantitativa data om cellulär lipidinnehåll och enskilda lipiddroplet-egenskaper i tabellformat som lämpar sig för efterföljande analyser i större kalkylblads-eller statistiska paket. Vi tillhandahåller exempel analyser av lipidinnehåll under olika förhållanden som påverkar cellernas lipidmetabolism.

Hela förfarandet sammanfattas i figur 1 för fission jäst (den spirande jästen arbetsflödet är analog), och nedan ger vi exempel på hur arbetsflödet kan användas för att studera LD innehåll i tre olika jästarter under olika förhållanden kända för att påverka cellulär LD-innehåll. Varje exempel representerar ett enda biologiskt experiment.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59889/59889fig01v...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Här presenterar vi en MATLAB implementering av automatiserad upptäckt och kvantitativ beskrivning av lipiddroppar i fluorescens mikroskopi bilder av fission och spirande jästceller.

Analys av lipidhalten i fission och spirande jästsvampar med automatiserad bildbehandling

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Detta protokoll underlättar kvantitativa små-till storskaliga analyser av cellulära lagring lipid innehåll i en mängd olika jäst arter och gör det på ett opartiskt och standardiserat sätt. Tekniken möjliggör snabb bearbetning av mikroskopiska bilder och ger detaljerade kvantitativa utgångar för att enkelt jämföra prover som olika mutanter och celler som odlas under olika förhållanden. Till att börja med följer du med i det medföljande textprotokollet för att förbereda färgningslösningarna, kulturmedierna och cellerna.Se till att cellerna är friska och i önskad tillväxtfas innan experimentet körs. Därefter förbereda ett mikroskop coverslip för varje prov som ska avbildas. Sprid en mikroliter av glidbeläggningslösning på en ren täckplatta med hjälp av långsidan av en horisontellt placerad pipettspets.Låt beläggningslösningen torka helt och förvara därefter täcken i en dammfri miljö. Därefter mäta optiska tätheter av cellkulturer, och för kulturer som ska analyseras i samma tillväxtfas, försöka nå liknande värden bland alla testade kulturer för att säkerställa jämförbara experimentella förhållanden. Sedan pipettera en milliliter av cellkulturen i en 1,5-milliliter mikrocentrifugrör.För S.cerevisiae cellerna endast, tillsätt fem mikroliter av glidbeläggningslösningen till röret också. Sedan, kort virvel alla mikrocentrifugrör, och inkubera dem i 30 grader Celsius med skakning i fem minuter. Därefter lägger du till en mikroliter av lipidfärgningslösningen till varje kultur alikvot, och virvel dem kortfattat.Lägg sedan till 10 mikroliter av cellgränsvisualiseringslösningen, och virvel dem kort en andra gång. Samla in cellerna genom att centrifugera dem vid 1 000 gångers gravitation i tre minuter vid rumstemperatur. När du är klar spinning, ta bort 950 mikroliter från supernatanten och resuspend cellerna i de återstående supernatant med hjälp av en pipett.Därefter pipettera två mikroliter av den täta cellupphängningen på enlectin-belagda täcken. Placera sedan täcket på en ren mikroskopbild för att bilda en cellmonolager, och gå vidare till mikroskopi så snabbt som möjligt för att minimera artefakter i avbildning. Ställa in mikroskopet kräver långa exponeringar för starka ljuskällor som kan orsaka skador på provet och skeva resultat.Därför ställa in bildframställning villkor med hjälp av en dedikerad prov glida som inte kommer att ytterligare användas för lipid droplet kvantifiering. Placera det särskilda provet på scenen i en faskontrast eller differentialinterdifferenskontrastmikroskop setup, och fokusera på cellerna. I mikroskopets programvara ställer du in Z-stack-inställningarna så att de spänner över hela cellvolymen.Det totala vertikala avståndet beror på cellstorleken och antalet optiska skivor beror på måls numeriska bländare. Därefter ställer du in fokus för att flytta i förhållande till det centrala fokalplanet. Till bild lipiddroppar, experimentellt ställa in ljusintensiteten och exponeringstiden i den gröna kanalen.Var försiktig när bildframställning, som BODIPY är en mycket ljus fluorokrom som kan vara snabbt fotobleached. Minimera dessutom exponeringstiden för att undvika översaturation. Fånga den fullständiga gröna kanalen Z-stack först innan du byter till den blå kanalen för att förhindra att de mobila lipiddropparna suddas ut.Till bildcellsgränserna anger du experimentellt ljusintensiteten och exponeringstiden i den blå kanalen. Om möjligt, ställa in och använda en automatiserad experimentell arbetsflöde i mikroskopet styrprogramvara för att underlätta bildbehandling av flera prover under standardiserade förhållanden. Viktigt är att alla bilder måste förvärvas med samma inställningar för att möjliggöra lämplig jämförelse mellan samplingar.När bildförhållandena har optimerats fokuserar du på cellerna och avbildar dem i både de gröna och blå kanalerna. Bild flera synfält per prov för att få fram robusta, representativa data. Spara de blå och gröna bilderna på Z-stacken som 16-bitars, flerskikts-TIFF-filer.Se till att inkludera orden grön eller blå i motsvarande filnamn. Öppna mikroskopiska bilder i ImageJ, och ta bort alla bildstaplar som innehåller ett stort antal celler som flyttades under förvärvet. Dessa visas på olika positioner i enskilda Z-sektioner.Därefter tar du bort alla bildstaplar som innehåller mycket fluorescerande icke-cellpartiklar i den blå kanalen. Detta orsakas ofta av smuts på bildmaterialytan eller föroreningar i odlingsmediet och kan störa detektion av celler i deras närhet. Ta också bort alla bildstaplar som innehåller en stor andel döda celler.Dessa bilder kommer att visa celler med ökad blå fluorescens jämfört med de levande cellerna. Medan förekomsten av några döda celler i provet är vanligtvis inte ett problem och dessa celler automatiskt kasseras under analys, vissa döda eller döende celler kan ibland kännas igen som levande celler av segmentering algoritm och därmed skeva de rapporterade resultaten. För att påbörja analys i MATLAB, först skapa en huvudmapp och kopiera alla MATLAB skript till denna plats.Därefter skapa undermappar med namnen på de olika jästarter, och kopiera respektive TIFF bilder till dessa platser. Nu, starta MATLAB, öppna skriptet MAIN. m, och kör skriptet.I menyn väljer du jästarten som ska analyseras och starta bildbehandling. Inspektera och bearbeta utdatafilerna enligt behov med hjälp av en kalkylrapportredigerare eller ett statistikpaket. Arbetsflödet producerar semikolonavgränsade CSV-filer och segmenterade TIFF-filer med identifierade cellobjekt och lipiddroppar.Visas här är vild-typ S.pombe celler som odlades i antingen komplexa YES medium eller definierade EMM medium. Jämfört med celler som odlas i YES-mediet upptäcktes färre lipiddroppar och högre färgningsintensitet per enhet av cellvolym i EMM-mediet. Dessutom var enskilda lipiddroppar som bildas i EMM-medium större och visade en ökad total färgningsintensitet.Detta är överens med tidigare fynd av ökad lagrad lipidhalt i celler som odlas i EMM. Därefter visar dessa bilder S.japonicus celler från exponentiella och tidiga stationära kulturer som odlas i YES medium. Celler som går in i stillastående fas visade ett markant minskat antal lipiddroppar per enhet av cellvolymen medan volym-normaliserade lipid droplet fluorescens intensitet minskade något mellan de två villkoren.De tidiga stationära-fas lipid droppar var typiskt måttligt större i storlek och hade måttligt högre totala fluorescens intensitet jämfört med droppar från exponentiellt växande celler. I S.cerevisiae celler som odlas till exponentiell kontra stationär fas, stationära celler innehöll något färre lipiddroppar per volymenhet jämfört med exponentiellt växande celler. Men deras volym-normaliserade droppen fluorescens intensitet nästan fördubblats.Denna kraftiga ökning av den totala lipid droplet innehåll berodde på den mycket högre fluorescens intensitet och volym av enskilda lipiddroppar i stationär fas. Efter denna procedur kan utdata aggregeras i ett statistiskt paket som R för att skapa tomter av summerade resultat och köra statistiska tester på eventuella observerade skillnader i lipiddroppinnehåll. I princip kan bildbehandlingspipeline användas för analys av lipiddroppinnehåll i andra mikroorganismer eller för att analysera andra punktliknande subcellulära strukturer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Fastställande av molekylära strukturer av HIV Envelope Glycoproteins med Cryo-elektrontomografi och automatisk Sub-tomogram Snittar

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Avbildning av HIV-1 kuvert-inducerad Virologiskt Synapse och signalering av syntetiska lipiddubbelskikt

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Underlätta Drug Discovery: En automatiserad hög halt Inflammation analys i zebrafisk

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolering, bearbetning och analys av murina Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En halvautomatisk metoden att förbereda antikropp Cocktails för Immunophenotypic Analys av humant perifert blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatiserad bildbaserad kvantifiering av neutrofila extracellulära fällor med NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiserad beteendevetenskaplig analys av stor C. elegans populationer med ett brett fält-of-view spårning plattform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Protokoll för bildbehandling för analys av diffusionen och klusterstorleken av membranreceptorer av fluorescensmikroskopi

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...