Name: analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Bu çalışma Charles Üniversitesi hibe PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 ve SVV 260310 tarafından desteklenmektedir. Biz mikroskobik ve görüntü analizi boru hattı gelişimi ile ilgili yardım için Ondřej Šebesta teşekkür ederiz. S . cerevisiae suşları için regenex laboratuvarına, ve japonet ve Hironori Niki 'nin laboratuvarına s. multiflorum suşlar için teşekkür ederiz. Ppc1-88 strain Maya genetik kaynak merkezi Japonya tarafından sağlandı. Microskopi, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu ve Çek Cumhuriyeti 'nin devlet bütçesi tarafından finanse edilen Konfokal ve floresans mikroskopi laboratuvarı 'nda yapılmıştır (Proje No. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 ve CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. çözüm ve medyanın hazırlanması
<ol><li>
Lipid boyama çözeltisi hazırlayın.
	<ol>
<li>Hisse senedi lipid boyama çözeltisi hazırlamak için 10 mg BODIPY 493/503 susuz DMSO (son konsantrasyon 1 mg/mL) on mL içinde çözülür. Tartım sırasında malzemenin kaybını önlemek için 10 mg BODIPY 493/503 şişenin tüm içeriğini çözün. Dikkat: DMSO deriden geçebilir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.</li>
		<li>1 mg/mL BODIPY 493/503 stok çözeltisi ve 900 μ...

<ol>
	<li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+lipids+of+yeasts:+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae,+Pichia+pastoris,+and+Yarrowia+lipolytica.">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li><li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+fat:+lipid+droplets+and+human+disease.">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li><li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica.">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li><li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li><li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+deletion+collection:+a+decade+of+functional+genomics.">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast,+Schizosaccharomyces+pombe.">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li><li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li><li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival.">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8 (2016).</li><li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC/C+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus.">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular &amp; Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li><li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+(BODIPY)+Derivatives+in+Liquids,+Lipid+Membranes,+and+Proteins.">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li><li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism.">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692 (2010).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li><li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast.">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li><li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-S&#225;nchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis.">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li><li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells.">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li><li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast:+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries.">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li><li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy.">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li><li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1,6-diphenylhexatriene.">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li><li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+Red+Quantifier:+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy.">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li><li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., W&#228;hlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-content/high-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models.">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li><li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant&#8217;Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production.">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li><li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis.">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li><li>Zach, R., Tvar&#367;&#382;kov&#225;, J., Sch&#228;tz, M., &#356;upa, O., Grallert, B., P&#345;evorovsk&#253;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+&#8220;cut&#8221;+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride.">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism &#8220;cut&#8221; mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li><li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li><li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+japonicus:+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts.">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li><li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis,+quiescence-exit+failure,+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA.">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).</li><li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus.">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li><li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p.">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li><li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast.">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li><li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape,+microtubule+organization,+and+cell-cycle+progression.">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li></ol>

Lipid metabolizması ve düzenlenmesi anlayışı hem temel biyoloji, hem de klinik ve biyoteknolojik uygulamalar için önemlidir. LD içeriği, hücrelerin lipid metabolizması durumunun uygun bir şekilde okunmasını, Floresan Mikroskobu ise LD içerik belirlenmesi için kullanılan önemli yöntemlerden biri olarak temsil eder. Sunulan protokol, tek LDs 'nin üç farklı ve morfolojik olarak farklı Maya türlerinde otomatik olarak algılanmasını ve niceliksel açıklamasını sağlar. Bizim bilgi için, hiçbir b...

Lipidler hücresel enerji ve karbon metabolizması, membran bileşenlerinin sentezini ve biyoaktif maddelerin üretimini önemli roller oynar. Lipid metabolizması çevresel koşullara, besin mevcudiyeti ve hücre döngüsü aşaması1' e göre ince ayarlı. İnsanlarda lipid metabolizması obezite, tip II diyabet ve kanser2gibi hastalıklara bağlı olmuştur. Endüstride, Mayalar gibi mikroorganizmalar tarafından üretilen lipidler, umut verici bir yenilenebilir dizel yakıt kaynağını temsil eder3. Hücreler sözde lipid damlacıkları (LDs) nötr lipidler depolar. Bu evrimsel olarak koruyucu organları triakilgliserler, steril esterler, bir dış fosfolipid Tek tabakalı ve ilişkili proteinler1oluşur. LDs endoplazmik reticulum kaynaklanan, hücre döngüsü veya büyüme faz dinamikleri uygulamak, ve hücresel lipid homeostazı için önemlidir1. LD numarası ve morfoloji, çeşitli büyüme koşullarında veya mutantların bir panelini taramasında lipid metabolizmasını asırken uygun bir vekil olarak kullanılabilir. Dinamik doğası göz önüne alındığında, bireysel LDs özelliklerini analiz yeteneğine teknikleri lipid metabolizması çalışmaları özellikle ilgi vardır.
Çeşitli maya türleri lipid ile ilgili metabolik yolları ve düzenlemeleri tanımlamak için kullanılan, ya da biyoteknolojide ilginç bileşikler veya yakıtlar üretmek için kullanılan1. Ayrıca, model Mayalar için, gibi tomurcuklanan Maya Saccharomyces cerevisiae veya uzaktan ilgili fisyon Maya mıtosaccharomyces pombe, Genom-geniş silme gerinim kütüphaneler kullanılabilir yüksek verim için kullanılabilir ekranlar4,5. Son zamanlarda ld kompozisyon ve dinamikleri S. pombeaçıklanan6,7,8,9, ve lipid metabolizması ile ilgili mutantlar gelişmekte olan model Maya izole edilmiştir Asoaccharomyces multiflorum10.
LD içerik ve dinamikleri incelemek için sayısız teknikler mevcuttur. Çoğu, Nile Red veya BODIPY 493/503 gibi lipophilik boyalar ile LDs boyama çeşit istihdam. İkincisi daha dar uyarma ve emisyon spektrumunu gösterir ve fosfolipidler (membranların)11' in aksine nötr lipidlere (LDs) doğru özgüllüğü artırmıştır. Fluorimetrik ve akış-sitometri yöntemleri, depolama lipid içeriğini etkileyen genler ve büyüme koşullarını ortaya çıkarmak için çeşitli mantar türlerde başarıyla kullanılmıştır12,13,14,15. Bu yöntemler yüksek verimlilik uygulamaları için uygun olmakla beraber, hücrelerde bireysel LDs 'nin sayılar ve morfolojisi ölçülemez, bu da büyüme koşulları ile genotürleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Tutarlı Raman saçılma veya dijital holografik microskopi ld düzeyinde veri verim, ancak özel pahalı ekipman16,17,18gerektiren etiket içermeyen yöntemlerdir. Diğer taraftan floresans mikroskobu, LD içeriğiyle ilgili ayrıntılı veriler sağlayabilir, yaygın olarak kullanılabilen enstrümanlar ve görüntü analiz yazılım araçlarını kullanarak. Çeşitli analiz iş akışları var ki, görüntü verilerinden hücre/ld algılamada farklı derece sofistike ve otomasyon özelliğine sahiptir ve büyük LDs19,20 ile Metazoan hücreler gibi değişik hücre türleri için optimize edilmiştir , 21ya da tomurcuklanan17,22,23. Bu yaklaşımlardan bazıları yalnızca 2D (örneğin, maksimum projeksiyon görüntülerde) çalışır, bu da hücresel LD içeriğini güvenilir bir şekilde tanımlamayabilir. Bilgi için, herhangi bir alet ld içerik ve morfoloji fisyon Maya mikroskobik veri belirlenmesi için yok. Otomatik ve sağlam LD seviyesi analizlerinin geliştirilmesi, yüksek hassasiyet ve gelişmiş istatistiksel güç getirir ve çoklu Maya türlerinde ideal olarak nötr lipid içeriği hakkında zengin bilgiler sağlar.
Maya hücrelerinin 3D floresan mikroskopisi görüntülerden LD içerik analizi için bir iş akışı geliştirdik. Canlı hücreler, LDs 'nin görselleştirilmesi ve sırasıyla hücre sınırlarını belirlemek için bodipy 493/503 ve Cascade Blue dekstran ile lekelenecektir. Hücreler cam slaytlar üzerinde immobilize ve standart bir epifluorescence mikroskop kullanarak z-yığını görüntüleme tabi tutulur. Görseller, istatistiksel analizler için yaygın olarak kullanılan (ticari) bir paket olan MATLAB 'de uygulanan otomatik bir boru hattı tarafından işlenir. Ardışık düzen, Görüntü önişleme, segmentasyon (hücreler vs. arka plan, ölü hücrelerin kaldırılması) ve LD kimliği gerçekleştirir. LD boyutu ve floresan yoğunluğu gibi zengin LD düzeyinde veriler, daha sonra büyük elektronik tablo yazılım araçlarıyla uyumlu sekmeli bir formatta sağlanır. İş akışı, azot kaynağının mevcudiyeti S. pombe24' te lipid metabolizmasında etkisini belirlemek için başarıyla kullanıldı. Şimdi, s. pombe, s. multiflorum ve s. cerevisiae'deki iş akışının işlevselliğini, hücresel ld içeriğini etkileyen büyüme koşullarını veya mutantları kullanarak gösteriyoruz.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Adenine hemisulfate salt, &ge;99%</td>
<td>Merck</td>
<td>A9126-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D3922</td>
<td>for neutral lipid staining</td>
</tr>
<tr>
<td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>G7021</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1976</td>
<td>for negative staining of cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide, &ge;99.5%</td>
<td>Merck</td>
<td>D4540</td>
<td>or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves</td>
</tr>
<tr>
<td>EMM broth without dextrose</td>
<td>Formedium</td>
<td>PMD0405</td>
<td>medium may also be prepared from individual components</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji/ImageJ software</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent; for visual inspection of microscopic data</td>
</tr>
<tr>
<td>High precision cover glasses, 22x22 mm, No 1.5</td>
<td>VWR</td>
<td>630-2186</td>
<td>use any # 1.5 cover glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lectin from Glycine max (soybean)</td>
<td>Merck</td>
<td>L1395</td>
<td>for cell immobilization on slides</td>
</tr>
<tr>
<td>MATLAB software, version 9.2</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness</td>
<td>Knittel Glass</td>
<td>L762601.2</td>
<td>use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>pentaband filter set </td>
<td>Semrock</td>
<td>F66-985</td>
<td>brightfield, green and blue channels are sufficient</td>
</tr>
<tr>
<td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SP supplements</td>
<td>Formedium</td>
<td>PSU0101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>standard office computer capable of running MATLAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Universal peptone M66 for microbiology</td>
<td>Merck</td>
<td>1070431000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>UPLSAPO 60XO objective</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Formedium</td>
<td>YEA03</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
<td>Formedium</td>
<td>CYN0405</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

analysis of lipid droplet content in fission and budding yeasts using automated image processing

Lipid metabolizması ve düzenlenmesi hem temel hem de uygulamalı yaşam bilimleri ve biyoteknolojinin ilgisini çekmektedir. Bu bağlamda, çeşitli maya türleri lipid metabolik araştırma modelleri veya endüstriyel lipid üretimi için kullanılır. Lipid damlacıkları son derece dinamik depolama organları ve onların hücresel içerik lipid metabolik durumun uygun bir okuma temsil eder. Floresan mikroskopisi, hücresel lipid damlacıkları nicel analizinde tercih edilen bir yöntemdir, çünkü yaygın olarak kullanılabilir donanıma dayanır ve bireysel lipid damlacıkları analizine izin verir. Ayrıca, mikroskobik görüntü analizi, genel analiz verimi büyük ölçüde artan otomatik olabilir. Burada, üç farklı model Maya türü içinde bireysel lipid damlacıkları otomatik algılama ve niceliksel açıklaması için deneysel ve analitik bir iş akışı tarif: fisyon Mayalar şizofrik pombe ve Şizofreyeve tomurcuklanan Maya Saccharomyces cerevisiae. Lipid damlacıkları bodipy 493/503 ile görselleştirilebilir ve hücre sınırlarının tanımlanmanıza yardımcı olmak için kültür medyasına hücre geçirmez floresan dekstran eklenir. Hücreler yeşil ve mavi kanallarda 3D epifluorescence mikroskopiye tabi tutulur ve elde edilen z yığını görüntüleri bir MATLAB boru hattı tarafından otomatik olarak işlenir. Prosedür, büyük elektronik tabloda veya istatistiksel paketlerdeki akış analizleri için uygun olan sekmeli bir formatta hücresel lipid damlacık içeriği ve bireysel lipid damlacık özellikleri üzerinde zengin nicel verileri çıkarır. Hücre lipid metabolizmasını etkileyen çeşitli koşullarda lipid damlacık içeriğinin örnek analizlerini sağlıyoruz.

Tüm prosedür Şekil 1 ' de (tomurcuklanan Maya iş akışı benzerdir), ve aşağıda biz nasıl iş akışı çeşitli koşullarda üç farklı maya türleri ld içeriği incelemek için kullanılabilir örnekler sağlamak için fisyon mayıları özetlenmiştir bilinen hücresel LD içeriğini etkilemek için. Her örnek tek bir biyolojik deneyi temsil eder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59889/59889...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing at JoVE.com

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Bu protokol, çeşitli maya türlerinde hücresel depolama lipid içeriğinin sayısal küçük ve büyük ölçekli analizlerini kolaylaştırır ve bunu tarafsız ve standart bir şekilde yapar. Bu teknik, mikroskobik görüntülerin hızlı bir şekilde işlenmesine olanak sağlar ve çeşitli mutantlar ve çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler gibi örnekleri kolayca karşılaştırmak için ayrıntılı nicel çıktılar sağlar. Başlamak için, boyama çözümlerini, kültür ortamını ve hücreleri hazırlamak için eşlik eden metin protokolünü uygulayın.Deneyi çalıştırmadan önce hücrelerin sağlıklı ve istenilen büyüme aşamasında olduğundan emin olun. Ardından, görüntülenecek her örnek için bir mikroskop kapağı hazırlayın. Yatay olarak konumlandırılmış pipet ucunun uzun tarafını kullanarak bir mikrolitre slayt kaplama çözeltisini temiz bir kapak kaymasıüzerine yayın.Kaplama çözeltisinin tamamen kurumasını bekleyin ve kapakları tozsuz bir ortamda saklayın. Daha sonra, hücre kültürlerinin optik yoğunluklarını ölçün ve aynı büyüme aşamasında analiz edilecek kültürler için, karşılaştırılabilir deneysel koşulları sağlamak için tüm test edilmiş kültürler arasında benzer değerlere ulaşmaya çalışın. Sonra, pipet hücre kültürünün bir mililitre 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine.Sadece S.cerevisiae hücreleri için, tüpe de slayt kaplama çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Sonra, kısaca tüm mikrosantrifüj tüpleri girdap, ve beş dakika sallayarak 30 santigrat derece onları kuluçka. Daha sonra, her kültür aliquot lipid boyama çözeltisi bir mikrolitre ekleyin ve kısa bir süre onları girdap.Daha sonra, hücre sınır görselleştirme çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin ve onları kısa bir süre ikinci kez girdap. Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 1,000 kez yerçekimi santrifüj ederek toplayın. İpliği bittiğinde, supernatant'tan 950 mikrolitre çıkarın ve bir pipet kullanarak kalan süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın.Sonra, pipet lektin kaplı bir kapak üzerine yoğun hücre süspansiyon iki mikrolitre. Daha sonra, bir hücre monokatmanı oluşturmak için temiz bir mikroskop slayt üzerine coverslip yerleştirin ve görüntüleme eserler en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk mikroskopi devam edin. Mikroskobun kurulması, numuneye zarar verebilecek ve sonuçları çarpıtabilecek güçlü ışık kaynaklarına uzun süre maruz kalma gerektirir.Bu nedenle, lipid damlacık nicelleştirme için daha fazla kullanılmayacak özel bir örnek slayt kullanarak görüntüleme koşulları ayarlayın. Özel örneği faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrast mikroskop kurulumu aşamasına yerleştirin ve hücrelere odaklanın. Mikroskobun yazılımında, Z-stack ayarlarını tüm hücre hacmine yayılabilecek şekilde ayarlayın.Toplam dikey uzaklık hücre boyutuna bağlıdır ve optik dilimlerin sayısı hedefin sayısal diyafram bağlıdır. Ardından, merkezi odak düzlemine göre hareket etmek için odak ayarlayın. Lipid damlacıklarını görüntülemek için, yeşil kanaldaki ışık yoğunluğunu ve maruz kalma süresini deneysel olarak ayarlayın.BODIPY hızla fotobleached olabilir çok parlak bir florokrom olduğu gibi görüntüleme yaparken dikkatli olun. Ayrıca, aşırı doygunluğu önlemek için pozlama süresini en aza indirin. Mobil lipid damlacıklarının bulanıklaşmasını önlemek için mavi kanala geçmeden önce tam yeşil kanal Z-yığınını yakalayın.Hücre sınırlarını görüntülemek için, mavi kanaldaki ışık yoğunluğunu ve pozlama süresini deneysel olarak ayarlayın. Mümkünse, standart koşullarda birden fazla numunenin görüntülenmesikolaylaştırılmasını kolaylaştırmak için mikroskop kontrol yazılımında otomatik bir deneysel iş akışı ayarlayın ve kullanın. Daha da önemlisi, örnekler arasında uygun karşılaştırma sağlamak için tüm görüntüler aynı ayarlar kullanılarak elde edilmelidir.Görüntüleme koşulları optimize edildikten sonra hücrelere odaklanın ve hem yeşil hem de mavi kanallarda görüntüleyin. Sağlam, temsili veriler elde etmek için örnek başına birden çok görüş alanı görüntüleyin. Mavi ve yeşil kanal Z-stack görüntülerini 16 bit, çok katmanlı TIFF dosyaları olarak kaydedin.İlgili dosya adlarına yeşil veya mavi sözcükleri eklediğinden emin olun. ImageJ'de mikroskobik görüntüleri açın ve edinme sırasında hareket eden önemli sayıda hücre içeren görüntü yığınlarını kaldırın. Bunlar, bireysel Z bölümlerinde farklı konumlarda görünür.Ardından, mavi kanalda yüksek floresan olmayan hücre parçacıkları içeren görüntü yığınlarını kaldırın. Bu genellikle görüntüleme yüzeyindeki kir veya tarım ortamındaki kirlerden kaynaklanır ve çevrelerindeki hücrelerin tespitini etkileyebilir. Ayrıca, ölü hücrelerin büyük bir oranda içeren görüntü yığınları kaldırın.Bu görüntüler canlı hücrelere göre artan mavi floresan hücreleri görüntüler. Örnekte birkaç ölü hücrenin varlığı genellikle bir sorun olmasa da ve bu hücreler analiz sırasında otomatik olarak atılırken, bazı ölü veya ölmekte olan hücreler bazen segmentasyon algoritması tarafından canlı hücre olarak tanınabilir ve böylece bildirilen sonuçları çarpıtabilir. MATLAB'da çözümlemeye başlamak için önce bir ana klasör oluşturun ve tüm MATLAB komut dosyalarını bu konuma kopyalayın.Ardından, çeşitli maya türlerinin adlarını içeren alt klasörler oluşturun ve ilgili TIFF görüntülerini bu konumlara kopyalayın. Şimdi, MATLAB'ı başlatın, ANA komut dosyasını açın. m ve komut dosyası çalıştırın.Menüde, analiz edilecek maya türlerini seçin ve görüntü işlemeye başlayın. Bir elektronik tablo düzenleyicisi veya istatistiksel paket kullanarak çıktı dosyalarını gerektiği gibi inceleyin ve işleyin. İş akışı, yarı kolondan ayrılmış CSV dosyaları ve algılanan hücre nesneleri ve lipid damlacıkları ile segmente TIFF dosyaları üretir.Burada gösterilen karmaşık EVET orta veya tanımlanan EMM orta yetiştirilen yabani tip S.pombe hücreleri vardır. EMM ortamda YES ortamda yetişen hücrelerle karşılaştırıldığında hücre hacmi birimi başına daha az lipid damlacıkları ve daha yüksek boyama yoğunluğu saptandı. Ayrıca EMM ortamda oluşan bireysel lipid damlacıkları daha büyüktü ve toplam boyama yoğunluğu arttı.Bu emm yetiştirilen hücrelerde artan depolanmış lipid içeriği önceki bulgular ile uyum içindedir. Daha sonra, bu görüntüler EVET ortamda yetiştirilen üstel ve erken sabit kültürlerden S.japonicus hücreleri göstermektedir. Sabit faza giren hücreler hücre hacmibirimi başına lipid damlacıklarının belirgin bir şekilde azaldığını gösterirken, hacim normalleştirilmiş lipid damlacık floresans yoğunluğu iki durum arasında biraz azaldı.Erken sabit faz lipid damlacıkları genellikle orta derecede büyük boyutta ve üssel büyüyen hücrelerden damlacıklar ile karşılaştırıldığında orta derecede daha yüksek toplam floresan yoğunluğu vardı. S.cerevisiae hücrelerinde üssel karşı sabit faza kadar yetiştirilen, sabit hücreler katlanarak büyüyen hücrelere göre birim başına biraz daha az lipid damlacıkları içeriyordu. Ancak, hacim normalleştirilmiş damlacık floresan yoğunluğu neredeyse iki katına çıktı.Genel lipid damlacık içeriğindeki bu keskin artış, sabit fazdaki tek tek lipid damlacıklarının çok daha yüksek floresan yoğunluğu ve hacminden kaynaklandı. Bu yordamı takiben, çıktı verileri, özetlenen sonuçların çizimlerini oluşturmak ve lipid damlacık içeriğinde gözlenen herhangi bir farklılık üzerinde istatistiksel testler yapmak için R gibi istatistiksel bir paketiçinde toplanabilir. Prensip olarak, görüntü işleme boru hattı diğer mikroorganizmalardaki lipid damlacık içeriğinin analizi veya diğer nokta benzeri hücre altı yapıları analiz etmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...