Name: a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection at JoVE.com

Forskning på influenzavirus i LM-S laboratorium er delvist finansieret af New York influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), et medlem af NIAID Centre of Excellence for influenza forskning og overvågning (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) og af Department of Defense (DoD) peer reviewed medicinsk forskning program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.

Forfatterne har intet at afsløre.

Forskere har påberåbt sig rekombinant reporter-udtrykker vira som vitale molekylære værktøjer til at forstå og udvide på den nuværende forståelse af viral replikation og patogenese26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. de mest almindeligt begunstigede reporter gener er luciferaser og fluorescerende proteiner, primært på grund af de teknologiske fremskridt i deres identifikation, udvikling af forbedrede varianter, og detektion af imaging Technologies43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. rekombinant reporter virus bruges ofte til at fremskynde virologiske analyser, studere dynamikken i vira in vitro og in vivo, og til at teste effektiviteten af aktuelt godkendte eller nye vaccine og terapeutiske tilgange26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Desværre, i tilfælde af iav, tidligere undersøgelser var begrænset til udtryk for en enkelt reporter gen, som hindrer den type undersøgelse, der kunne udføres 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. for at undgå denne begrænsning har vi genereret en replikeringskompetent bi-reporter iav, der udtrykker en nluc der og en Venus fluorescerende protein (birflu).
I denne rapport beskriver vi in vitro-karakteriseringen af BIRFLU og de eksperimentelle tilgange til at bruge BIRFLU til at spore virus infektion in vivo ved hjælp af en musemodel af IAV-infektion. BIRFLU Nluc og Venus udtryk korrelerede med virale titers. Desuden forblev BIRFLU stabil og fortsatte med at udtrykke begge reporter gener efter at være blevet genvundet fra lungerne af inficerede mus. Denne tilgang giver forskerne en glimrende mulighed for at studere IAV i dyrkede celler og i dyremodeller, herunder identifikation og udvikling af nye terapeutiske alternativer til behandling af IAV-infektioner.
Selv om BIRFLU er blevet genereret ved hjælp af rygraden i PR8, andre rekombinant IAV ved hjælp af forskellige type, subtype eller viral stamme backbones kunne genereres ved hjælp af samme eksperimentelle tilgang. Ligeledes beskrev vi i denne rapport de eksperimentelle procedurer for brugen af BIRFLU i en musemodel af IAV. Men, BIRFLU kunne være en værdifuld teknologi til at evaluere IAV infektion i andre dyremodeller.

Influenza A-virus (IAV) er et indhyllet enkeltstrenget negativt-Sense-segmenteret RNA-virus fra Orthomyxoviridae -familien1,2,3. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anslår 3-5 millioner årlige influenza tilfælde og over 250.000 dødsfald fra influenza Worldwide4,5,6. Grupper, der er særligt sårbare over for influenza omfatter ældre, immunkompromitterede individer, og børn7,8,9,10,11. Selv om vacciner er tilgængelige og repræsenterer den mest almindelige og effektive intervention mod virus infektion, iav er i stand til hurtigt at udvikle sig og undslippe allerede eksisterende immunitet3,12,13, 14 , 15. genfremkomsten af en pandemisk H1N1-stamme i 2009 og fremkomsten af sygdomsfremkaldende iav gentager den konstante trussel mod menneskers folkesundhed på verdensplan4,16.
Under en epidemi eller pandemi er det afgørende hurtigt at bestemme patogeniciteten og Trans lovligheden af nyligt isolerede vira. I øjeblikket tilgængelige teknikker til påvisning af virus er tidskrævende og undertiden kræver brug af omstændelig tilgange, som kan forsinke færdiggørelsen af disse analyser17,18,19,20. Desuden er det vanskeligt at opskalere de nuværende virale undersøgelser, hvilket kan være nødvendigt i tilfælde af et udbrud. Endelig anvendes validerede dyremodeller for infektion, såsom mus, marsvin og fritter, rutinemæssigt og er afgørende for at studere influenza infektioner, immunrespons og effekten af nye vacciner og/eller antivirale lægemidler. Men disse modeller er restriktive på grund af den manglende evne til at observere viral dynamik i realtid; Dette begrænser undersøgelserne til statisk billeddannelse af virale infektioner21,22,23,24,25. Dyr, der anvendes i disse analyser, er også aflives med henblik på at bestemme viral belastning, hvilket øger antallet af dyr, der kræves for at gennemføre disse undersøgelser26. For at omgå alle disse begrænsninger, er mange forskere afhængige af brugen af rekombinant replikation-kompetente, reporter-udtrykker IAVs, som er i stand til at accelerere virologiske analyser og påvisning af viral belastning og udbredelse in vivo i realtid26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Vigtigere, disse reporter-udtrykker iAVS er i stand til at replikere på samme måde som vild-type (WT) iAVS i cellekultur og i dyremodeller af infektion33,42.
Fluorescerende og bioluminescerende proteiner er to reporter-systemer, der almindeligvis anvendes af forskere på grund af deres følsomhed, stabilitet og brugervenlighed. Desuden er der enorm støtte og avancement i fluorescerende og bioluminescerende protein afsløring teknologier43,44,45,46,47,48 . Fluorescerende proteiner og der har forskellige egenskaber, der giver dem mulighed for at gløde, specifikt adskiller sig i, hvordan ophidset stater genereres, og hvordan emittering detekteres43,44,45, 46,47,48. Fluorescerende proteiner er først ophidset ved at absorbere energi, som efterfølgende frigives som lys på en anden bølgelængde, da molekylerne falder til en lavere energi tilstand43. På den anden side, bioluminescens er afledt af en kemisk eksoterm reaktion, der involverer et substrat, ilt, og nogle gange ATP for at producere lys45. På grund af de varierende egenskaber af disse to typer af reporter proteiner, en måske mere fordelagtig end den anden afhængigt af undersøgelsen af interesse. Mens fluorescerende proteiner er almindeligt anvendt til at observere cellulær lokalisering28,41, deres in vivo-signaler har utilstrækkelig intensitet og er ofte tilsløret af autofluorescens i levende væv49. Derfor er forskerne afhængige af luciferaser til at evaluere viral dynamik i levende organismer, selv om fluorescerende proteiner kan foretrækkes for ex vivo undersøgelser50,51,52,53. I modsætning til fluorescerende proteiner er luciferaser mere bekvemt for in vivo-undersøgelser og mere anvendelig i ikke-invasive tilgange26, 27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. i sidste ende, baseret på typen af undersøgelse, skal forskerne vælge mellem brugen af enten et fluorescerende eller en der reporter protein som deres udlæser, som undersøger deres undersøgelse til en trade-off af funktionaliteter og følsomheder, og alvorligt begrænser nytten af de rekombinante reporter vira. Desuden er der betænkeligheder med hensyn til sammenhængen mellem de forskellige reporter geners ekspression ved anvendelse af fluorescens-eller luciferasesystemer og viral replikation eller udbredelse, hvilket kan bringe fortolkningen af de data, der er indhentet med reporter-udtrykker IAVs.
Vi har overvundet denne begrænsning ved at generere en rekombinant replikation-kompetent bi-reporter IAV (BIRFLU), der koder for både et fluorescerende og et luciferaseprotein i samme virale genom55 (figur 1). Her blev nanoluc der (nluc), et lille og lyst bioluminescerende protein48, indsat opstrøms for hemagglutinin (ha)-sekvensen i det virale ha-segment af influenza a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Desuden blev Venus, et hyppigt anvendt Monofilament fluorescerende protein, indsat i det ikke-strukturelle (NS) virale segment32,33,36,41,55. Da birflu koder for både fluorescerende og der reporter gener, enten reporter protein signal kan anvendes som udlæser til bestemmelse af viral replikation og udbredelse in vitro eller in vivo55. Yderligere oplysninger om generering og in vitro eller in vivo karakterisering af BIRFLU kan findes i vores seneste publikation55. BIRFLU kan bruges til at teste effektiviteten af antivirale lægemidler eller neutraliserende antistoffer via en ny fluorescerende-og bioluminescerende mikroneutraliseringassay55. Desuden kan BIRFLU også bruges til at evaluere viral dynamik i en musemodel af infektion55. I dette manuskript beskriver vi de procedurer, som karakteriserer BIRFLU55 in vitro, og hvordan man STUDERER birflu-infektion i mus ved hjælp af in vivo luminescens billedbehandlingssystemer til påvisning af nluc in vivo eller af Venus ex vivo.
Kombinationen af Cutting-Edge teknikker i molekylær biologi, dyreforskning og billeddannelse teknologier, bringer forskerne den enestående mulighed for at bruge BIRFLU til IAV forskning, herunder studiet af virus-vært interaktioner, dynamik viral infektion; udvikling af nye vaccine tilgange til terapeutisk behandling af IAV-infektioner eller potentiel anvendelse af IAV som vaccine vektor til behandling af andre patogeninfektioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS4</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>This software is used in 3.1.10 and 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Albumin solution (BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Store at 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture dishes 100mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used in 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C581-100</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7722-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five- to seven-week-old female BALB/c mice</td>
			<td>National Cancer Institute (NCI)</td>
			<td>555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 Motorized Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 4.7.2 software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumicount</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>H16-L10-4R5</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin 10%</td>
			<td>EMD</td>
			<td>65346-85</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-00-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 20000R Fast1394 Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-075-150</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vmax Kinetic plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection

Influenza A-vira (IAVs) forårsager luftvejssygdomme, der er forbundet med betydelige sundhedsmæssige og økonomiske konsekvenser. Som med andre vira, studere IAV kræver brug af omstændelig sekundære tilgange til at påvise tilstedeværelsen af virus i inficerede celler og/eller i dyremodeller af infektion. Denne begrænsning er for nylig blevet omgået med generering af rekombinante iAVS udtrykke let sporbare fluorescerende eller bioluminescerende (luciferase) reporter proteiner. Men, forskere har været tvunget til at vælge fluorescerende eller der reporter gener på grund af den begrænsede kapacitet iav genomet for herunder udenlandske sekvenser. For at overvinde denne begrænsning har vi genereret en rekombinant replikation-kompetent bi-reporter iav (birflu), der stabilt udtrykker både et fluorescerende og et der reporter-gen til nemt at spore iav-infektioner in vitro og in vivo. Med henblik herpå blev de virale ikke-strukturelle (NS) og hemagglutinin (ha) virale segmenter af influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) modificeret til at indkode fluorescerende Venus og de bioluminescerende nanoluc luciferaseproteiner. Her beskriver vi brugen af BIRFLU i en musemodel af IAV-infektion og påvisning af begge reporter-gener ved hjælp af et in vivo-billedbehandlingssystem. Vi har især observeret en god sammenhæng mellem udtryk for både journalister og viral replikation. Kombinationen af avancerede teknikker inden for molekylær biologi, dyreforskning og billeddannelsesteknologier giver forskerne en enestående mulighed for at bruge dette værktøj til influenza forskning, herunder studiet af interaktioner mellem virus og vært og dynamikken i virusinfektioner. Det er vigtigt, at muligheden for genetisk ændring af det virale genom for at udtrykke to fremmede gener fra forskellige virale segmenter åbner mulighed for at anvende denne tilgang til: i) udvikling af nye IAV-vacciner, II) generering af rekombinante IAVs, der kan anvendes som vaccine vektorer til behandling af andre humane patogen infektioner.

Generering og karakterisering af BIRFLU in vitro (figur 1 og figur 2)
En rekombinant replikation-kompetent IAV udtrykker to forskellige reporter gener (BIRFLU) blev konstrueret ved hjælp af state of the art molekylær biologi og plasmid-baserede reverse genetik teknikker (figur 1). Her valgte vi at bruge nluc på grund af flere fordele i forhold til andre luciferaser, herunder dens lille størrelse, ATP-uafhængighed, større intensitet og optimeret substrat48,60. Nluc blev klonet ind i ha-segmentet for iav PR8 efterfulgt af svine-svine (PTV) 2a-kavaler pladsen (2a) foran den åbne læse ramme (ORF) af ha (figur 1). ORF af HA inkluderede tavse mutationer for at fjerne de originale emballerings signaler og undgå enhver mulig rekombination. Det komplette HA-emballerings signal blev tilføjet foran Nluc for at muliggøre korrekt inkorporering af det modificerede HA-segment i virion-og Nluc-og HA-ekspression fra det samme virale RNA-segment (figur 1). Desuden blev det fluorescerende protein Venus klonet ind i en modificeret iav PR8 NS segment, som koder de to virale proteiner NS1 og NEP fra en enkelt afskrift32,36,41,54, 57. Med henblik herpå blev Venus smeltet til C-terminalen i NS1, og hele NEP ORF blev klonet nedstrøms for PTV 2A-spaltningen, der blev placeret mellem NS1-Venus-og NEP-sekvenserne (figur 1). I sidste ende, disse to modificerede HA og NS viral plasmid konstruktioner blev anvendt i kombination med resten af IAV PR8 reverse genetik plasmider at generere BIRFLU (figur 1). In vitro og in vivo karakterisering af BIRFLU er blevet beskrevet tidligere55.
I figur 2, vi karakteriseret in vitro birflu ved at bestemme Venus, nluc, og NP ekspressionsniveauer ved hjælp af fluorescens og indirekte immunofluorescens tilgange (figur 2a, B). Confluent-monolag af mdck-celler var enten mock-inficerede eller inficerede (Moi 0,1) med WT eller birflu PR8 vira, og ved 18 timer efter infektion blev Venus Expression direkte evalueret ved hjælp af Fluorescens mikroskopi (figur 2a, B). Nluc (figur 2a) og NP (figur 2b) udtryk blev visualiseret ved indirekte immunofluorescens ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for hvert protein. Som forventet blev Venus og Nluc ekspression kun detekteret i celler inficeret af BIRFLU og ikke i celler inficeret med WT PR8 virus. Desuden afslørede indirekte immunofluorescens mikroskopi NP-ekspression i både WT og BIRFLU PR8-inficerede celler. Ingen udtryk for Venus, Nluc eller NP blev detekteret, som forventet, i mock-inficerede celler (figur A, B).
For at evaluere nluc-ekspressions niveauerne in vitro blev mdck-celler inficeret (Moi 0,001) med WT eller birflu PR8 vira og nluc-aktivitet i vævskultur supernatanter blev vurderet ved 24, 48, 72 og 96 h efter infektion (figur 2c). Kun nluc-aktivitet blev påvist i vævskultur supernatanter af mdck-celler inficeret med birflu (figur 2c). Nluc aktivitet i vævs kulturen supernatanter blev detekteret så tidligt som 24 h efter infektion med højere ekspressionsniveauer ved 96 h efter infektion, sandsynligvis fordi den cytopatiske effekt (CPE) induceret under viral infektion frigive nluc protein bevaret ind i cellen. For at evaluere egnetheden af birflu i dyrkede celler blev vækst kinetikken for WT og birflu PR8 vira også evalueret (figur 2D), og tilstedeværelsen af infektiøs virus i vævskultur supernatanter blev bestemt af immun fokus analyse (figur 2D ). Især var BIRFLU-replikeringkinetikken sammenlignelig med WT PR8-virusset, selv om BIRFLU-replikation var en anelse forsinket og ikke nåede de samme virale titre som WT PR8. Men, birflu var i stand til at nå titre af 5 x 107 PFU/ml (figur 2D), hvilket indikerer, at ekspression af to reporter gener i det virale genom ikke signifikant interfererer med birflu replikation i mdck celler.
Sporing af BIRFLU-infektion i mus (figur 3 og figur 4)
Figur 3 er et skematisk flowdiagram til vurdering af birflu dynamik i en musemodel af iav infektion. Fem-til-syv-ugers gamle kvindelige BALB/C-mus var enten mock-inficerede med 1x PBS eller inficeret med 1 x 106 PFU af birflu intranasally. På 3 dage efter infektion, blev mus bedøvet med isofluran og derefter injiceres med Nluc substrat retro-orbitally. Alle mus blev straks anbragt i IVIS-instrumentet, og Nluc-signalet blev vurderet in vivo ved hjælp af IVIS. Dernæst blev mus aflives og lunger blev høstet. De fjernede lunger blev derefter analyseret ex vivo ved hjælp af in vivo Imager til bestemmelse af fluorescens intensitet via Venus ekspression. Endelig blev mus lunger homogeniseret, og viral titre og stabilitet blev bestemt af plaque assay. Plaques blev vurderet af Venus ' direkte fluorescens, ved immun farvning ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for Nluc og ved krystalviolet farvning.
Tidligere beskrevne replikation-kompetente reporter-udtrykker IAVs udtrykker et enkelt reporter gen, oftest enten et fluorescerende eller et bioluminescerende protein, som surrogat for viral infektion og replikation. Men, BIRFLU, er i stand til at udtrykke begge typer af reporter gener på viral infektion. For at vurdere korrelationen mellem bioluminescens (in vivo-billeddannelse) og fluorescens (ex vivo-billeddannelse) efter BIRFLU-infektion var fem-til-syv uger gamle kvindelige BALB/c-mus mock-inficerede med 1x PBS eller inokuleret med BIRFLU (106 PFU) intranasalt . Nluc-aktiviteten (figur 4a) blev evalueret ved administration af nluc-substrat injiceret retroorbitalt ved 3 dage efter infektion med et in vivo-billedbehandlings instrument. Vi valgte at evaluere bioluminescens på dag 3, fordi tidligere undersøgelser indikerede, at iav-replikation, herunder PR8, toppe mellem dag 2 og 4 efter infektion24,54. Bioluminescens blev overvåget (figur 4a, top) og anvendt til at beregne den gennemsnitlige totale flux (flux (log10 p/s) (figur 4a, bund). Som forudset, mus inokuleret med BIRFLU viste høj bioluminescens aktivitet, men ingen signal blev påvist i mock-inficerede mus. Derefter blev lungerne af inficerede mus høstet og Venus ekspression blev vurderet ved hjælp af ex vivo Imaging (figur 4b, top). Desuden blev fluorescens gennemsnitlige stråle effektivitet beregnet (figur 4b, bund). De fjernede mus lunger blev også homogeniseret for at bestemme viral titre og den genetiske stabilitet af birflu in vivo (figur 4c, D). Genetisk stabilitet af BIRFLU blev analyseret gennem plaque assay ved hjælp af vira isoleret fra mus lunger og fluorescerende mikroskopi (Venus, top), immun farvning (Nluc, midten) og krystalviolet farvning (bund). BIRFLU genvundet fra mus lunger var i stand til at danne plaques og stabilt udtrykker både reporter gener (figur 4c). Vi observerede især en god korrelation mellem bioluminescens-og fluorescens signaler med viral replikation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Figur 1: skematisk gengivelse af iav PR8 WT og birflu virion struktur og genom segmenter. Iav er omgivet af en lipid-tolags, der indeholder de to store virale glycoproteiner hemagglutinin (ha; sort) og neuraminidasetypen (na; blå). IAV indeholder otte enkelt-strandede, negative-Sense, RNA segmenter (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, og NS). Hver viral segment indeholder ikke-kodning regioner (NCR) på 3 ' og 5 ' ender (sorte bokse). Også, på 3 ' og 5 ' ende af viral (v) RNAs er emballagen signaler, ansvarlig for den effektive encapsidation af vrnas i spirende virions (hvide kasser). IAV PR8 HA og NS virale segmenter og produkter er indikeret med sort. Sekvenser af Nluc, Venus og PTV 2A er angivet i henholdsvis rød, grøn og stribet boks. Den skematiske gengivelse af de modificerede HA-og NS-segmenter, der udtrykker henholdsvis Nluc og Venus i BIRFLU, er også indiceret. Dette tal er blevet tilpasset fra Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Figur 2: in vitro karakterisering af BIRFLU. (A, B) Analyse af protein ekspression ved direkte fluorescens og immunofluorescens. MDCK-celler var mock-inficerede eller inficerede (MOI 0,1) med PR8 WT eller BIRFLU vira. Inficerede celler blev fastsat til 18 h efter infektion for direkte at visualisere Venus udtryk ved direkte fluorescerende mikroskopi og at visualisere Nluc (A) og viral NP (B) udtryk ved hjælp af specifikke antistoffer og indirekte immunofluorescens. Kerner blev plettet med DAPI. Repræsentative billeder (20x forstørrelse) vises. Skala stænger = 100 μm. (C, D) Vækst kinetik af PR8 WT og BIRFLU. Nluc aktivitet (C) og viral titre (D) i vævskultur supernatanter fra mdck celler inficeret (Moi 0,001) med WT og birflu PR8 vira blev vurderet på de angivne tidspunkter efter infektion. Data repræsenterer midlerne ± SD af triplicater. Viral titre blev bestemt af immun-Focus assay (FFU/ml). Punkteret linje angiver detektionsgrænsen (200 FFU/ml). Dette tal er blevet tilpasset fra Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Figur 3: skematisk repræsentation for studiet af BIRFLU i mus. Ekspression af Nluc og Venus reporter gener blev evalueret hos mus inficeret med 1 x 106 PFU af birflu med in vivo eller ex vivo Imaging. Kort, på dag 1, 5 til 7 uger gamle kvindelige BALB/c mus var mock-inficerede (1x PBS) eller inokuleret med 1 x 106 PFU af birflu intranasally. På dag 3 efter infektion, mus blev mildt bedøvet ved hjælp af isofluran og Nluc substrat blev injiceret retro-orbitally. Nluc-signalet blev direkte vurderet ved hjælp af in vivo-billeddannelse. Umiddelbart efter billeddannelse blev mus aflives og ekspression af Venus i hele exciserede lunger blev analyseret ved hjælp af ex vivo-billeddannelse. Gendannede mus lunger blev homogeniseret for at evaluere viral replikation og stabilitet ved plaque assay. Pilene indikerer korrelation mellem fluorescens (Venus), immun farvning (Nluc) og krystalviolet farvning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Figur 4: in vivo bioluminescens og fluorescens udtryk. Kvindelige fem til syv uger gamle BALB/c-mus var mock-inficerede (1x PBS) eller inokuleret med 1 x 106 PFU af birflu intranasally. På dag 3 efter infektion blev Nluc aktivitet (A) i hele musen fastlagt. Repræsentative billeder af en enkelt mus, der viser Radiance Scale (p/sek/cm2/SR). Bioluminescens Radiance værdier blev kvantiteret, og den gennemsnitlige totale flux vises (flux (log10 p/s). Efter Nluc-billeddannelse blev der høstet lunger til ex vivo-billeddannelse (B). Repræsentative billeder fra hele lunger vises. For at kvantificere Venus ekspression blev middelværdien af regioner af interesse (ROIs) normaliseret til lunge Auto-fluorescens fra mock-inficerede mus og fold ændringer blev beregnet. For at analysere den genetiske stabilitet af BIRFLU in vivo, vira genvundet fra mus lunger blev analyseret af plaque assay ved hjælp af fluorescerende mikroskopi (Venus, top), immun farvning (Nluc, midten) og krystalviolet farvning (bund) (C). Repræsentative billeder fra én mus vises. For at evaluere virusreplikation blev hele lunger homogeniseret efter billeddannelse og anvendt til at inficere MDCK-celler og bestemme virale titre ved plaque assay (PFU/mL) (D). Pilene indikerer korrelation mellem fluorescens (Venus), immun farvning (Nluc) og krystalviolet farvning. Søjler repræsenterer den gennemsnitlige ± SD af lunge virus titre. Dette tal er blevet tilpasset fra Logales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Væv kultur medier og løsninger</td>
			<td>Sammensætning</td>
			<td>Opbevaring</td>
			<td>Bruge</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Væv kultur medier: Dulbecco's modificerede ørne medium (DMEM), 10% føtal bovin serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 mL FBS og 5 mL 100x PSG.</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Vedligeholdelse af MDCK-celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Post-infektion medier: dmem 0,3% kvæg ALBUMIN (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% BA 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA og 5 ml 100x PSG</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Vedligeholdelse af MDCK-celler efter virus infektion</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x fosfat bufferet saltvand (PBS)</td>
			<td>80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g af na2HPO4. 7h2O, 2 g af KH2po4. Tilføj ddH2O op til 1 L. Juster pH til 7,3</td>
			<td>Stuetemperatur</td>
			<td>Sådan forberedes 1x PBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>Fortyndet 10x PBS med ddH2O</td>
			<td>Stuetemperatur</td>
			<td>Vaske celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Infektion medier: 1x PBS, 0,3% BA, 1% penicillin-streptomycin (PS) (PBS/BA/PS).</td>
			<td>487 mL 1x PBS steril, 4,2 mL 35% BA og 5 ml 100x 1% PS (100 U/mL)</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Virale infektioner</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Fiksering/permeabiliseringsvæske: 4% formaldehyd, 0,5% Triton X-100 fortyndet i 1x PBS.</td>
			<td>400 mL neutral Buffered formalin 10%, 5 ml Triton X-100 og 595 mL 1x PBS</td>
			<td>Stuetemperatur</td>
			<td>Fix og permeabilization af MDCK celler.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Blokerende opløsning: 2,5% bovin serum ALBUMIN (BSA) i 1x PBS.</td>
			<td>2,5 g BSA i 97,5 mL 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Blokerende opløsning til immunofluorescens og plaque assays.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antistoffortyndingsopløsning (1% BSA i 1x PBS)</td>
			<td>1 g BSA i 99 mL 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Fortynding af primære og sekundære antistoffer.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% krystalviolet opløsning</td>
			<td>1 g krystalviolet i 400 mL methanol. Tilsæt 600 ml ddH2O</td>
			<td>Stuetemperatur</td>
			<td>Farvning af MDCK celler i plaque assays.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonylphenylalanyl klormethyl keton (tpck)-behandlet trypsin</td>
			<td>Forbered en 1.000 x stamopløsning ved 1 mg/mL i Hedeselskabet2O</td>
			<td>-20 °C</td>
			<td>For virusinfektioner.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: vævskultur medier og opløsninger.

Watch this Scientific Journal Video about A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection at JoVE.com

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

En luciferase-fluorescerende reporter influenza virus til levende billeddannelse og kvantificering af viral infektion

Influenza A-vira (IAVs) er smitsomme luftvejs patogener, der forårsager årlige epidemier og lejlighedsvis pandemier. Her beskriver vi en protokol til at spore virale infektioner in vivo ved hjælp af en roman rekombinant der og fluorescens-udtrykker bi-reporter iav (birflu). Denne fremgangsmåde giver forskerne et glimrende værktøj til at studere IAV in vivo.

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Forskere har tidligere genereret rekombinant influenza virus, der udtrykker enten fluorescerende eller bioluminescerende protein reportere. En del af vores enkelt udtryk for reporter gener i influenzavirus alvorligt begrænser dens anvendelse i eksperimenter. Vores protokol beskriver brugen af bireporter influenza virus, der udtrykker både fluoresent og bioluminescerende reporter gener, og derfor overvinder sin begrænsning.Den største fordel ved denne teknik er brugen af et enkelt rekombinant influenzavirus til in vitro- og in vivo-undersøgelser. Når du udfører denne teknik, hurtig injektion af luciferase substrat og korrekt planlægning af mus håndtering er vigtig, fordi substratet er hurtigt metaboliseres. Også, barbering af mus anbefales at forbedre påvisning af bioluminescerende signal.For at inficere musene skal du starte med at forberede BIRFLU i 1X PBS. Vedligehold virus på is indtil vaccination. Kontroller, om tåens knivspidsrefleks ikke er til stede for at sikre, at musen bedøves, og inokuler den intranasalt med den forberedte BIRFLU-fortynding.Sørg for, at alle mus trækker vejret ordentligt, før de returneres til deres bure. Åbn billedsoftwaren, og tryk på Initialiser, og angiv derefter de parametre, der skal bruges til billedbehandling. For at overvåge mus inficeret med BIRFLU, barbere deres bryst for at forbedre påvisning af det bioluminescerende signal.Når musene er bedøvet, bruge en 22 gauge nål til retro-orbitalt administrere 100 mikroliter af Nluc luciferase substrat, fortyndet en til 10 i PBS. Umiddelbart efter injektionen skal dyrene i isolationskammeret med brystet opad. Derefter skal du placere isolationskammeret i billedinstrumentet, lukke døren og hente billeder.Efter billeddannelse, returnere musene til deres bure og overvåge dem, indtil de er fuldt tilbagebetalt. Brug værktøjet til investeringsafkast af billedbehandlingssoftware til at analysere de erhvervede bioluminescensdata ved at udpege et område af interesse og klikke på mål. For at udføre ex vivo billeddannelse af muselunger, indsamle lungerne i henhold til manuskriptet retninger, starte billedet erhvervelse software, og indstille parametrene for billedbehandling.Når maskinen er initialiseret, skal lungerne i en sort baggrundsbakke, og sikre, at vævene er adskilt fra hinanden. Indfør bakken i imageren, luk døren, og ansk af billederne. Efter billeddannelse fjernes vævsvævet straks og opbevares på is ved fire grader Celsius, hvis prøverne vil blive behandlet samme dag.Hvis de vil blive behandlet senere, fryse dem hurtigt i et rør på tøris, og gemme dem på 80 grader Celsius. Hvis du vil behandle billederne, skal du vælge værktøjet INVESTERINGSAFKAST, tegne interesseområder omkring hver af de enkelte lunger og klikke på målpunkt. BIRFLU har været karakteriseret in vitro ved at bestemme Venus, Nluc, og NP ekspressionsniveauer i inficerede celler.Venus og Nluc udtryk påvises kun i celler inficeret med BIRFLU, mens NP udtrykkes i både vildtype PR8 og BIRFLU-inficerede celler. Intet udtryk observeres i mock-inficerede celler. Desuden er Nluc-aktiviteten blevet målt i vævskultursupernatanter ved 24, 48, 72 og 96 timer efter infektionen.Det opdages så tidligt som 24 timer efter infektion, og udtrykket niveauer stige på 96 timer. Det kan også påvises, at replikation kinetik af BIRFLU kan sammenlignes med den vilde type PR8 virus. BIRFLU har evnen til at udtrykke både fluorescerende og bioluminescerende reporter gener, og sammenhængen mellem de to kan vurderes ved hjælp af in vivo og ex vivo imaging af en mus lunge.Lungerne af mus inficeret med BIRFLU viste høj bioluminescens in vivo og fluorescens ex vivo. Virale titere og genetisk stabilitet af BIRFLU in vivo er også blevet bestemt. Plaque assays på virus fra mus lunger viste, at virus kan danne plaques og udtrykke både reporter gener.BIRFLU kan også anvendes til at evaluere effektiviteten af antivirale og neutraliserende antistoffer mod influenza. Outputtet fra disse analyser alle var korreleret med hinanden og er hurtige og nemme at gøre.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influenza A-virus Detection og Isolering fra svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In vitro Demontering af influenza A-virus capsider ved gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescensbaseret neuraminidase-inhiberingsassay i vurdering af den følsomhed over influenzavira til neuraminidaseinhibitoren Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza A Virus undersøgelser i en musemodel af infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation af undslippe varianter af neutraliserende Influenza Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging celle interaktion i trakeal slimhinde under Influenza virusinfektion ved hjælp af to-foton Intravital mikroskopi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live imaging og kvantificering af virusinfektion i K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af reporter-udtrykkende rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...