Name: a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00
Duration: 5 min 21 s
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एलएम-एस प्रयोगशाला में इन्फ्लूएंजा वायरस पर अनुसंधान आंशिक रूप से न्यूयॉर्क इन्फ्लुएंजा सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (NYICE) (NIH 272201400005C), इन्फ्लुएंजा अनुसंधान और निगरानी (सीईआईआरएस) अनुबंध के लिए उत्कृष्टता के NIAID केंद्र ोंको के एक सदस्य द्वारा आंशिक रूप से वित्त पोषित है। HHSN2722201400005C (NYICE) और रक्षा विभाग (DoD) सहकर्मी की समीक्षा की चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (PRMRP) अनुदान W81XWH-18-1-0460 द्वारा.

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

शोधकर्ताओं ने वायरल प्रतिकृति और रोगजनन की वर्तमान समझ को समझने और विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण आणविक उपकरण के रूप में वायरस पुनः संयोजक रिपोर्टर पर भरोसा किया है26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.सबसे अधिक इष्ट रिपोर्टर जीन luciferases और फ्लोरोसेंट प्रोटीन हैं, मुख्य रूप से उनकी पहचान में तकनीकी प्रगति के कारण, बेहतर वेरिएंट के विकास, और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों द्वारा पता लगाने43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48.रिकॉमबिनेंट रिपोर्टर वायरस का उपयोग अक्सर virological परख में तेजी लाने, विट्रो में और विवो में वायरस की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, और वर्तमान में अनुमोदित या नए टीके और चिकित्सीय दृष्टिकोण26की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए किया जाता है, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. दुर्भाग्य से, आईएवी के मामले में, पिछले अध्ययन एक ही रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति तक ही सीमित थे, जो 26,27,28,29 आयोजित किए जा सकने वाले अध्ययन के प्रकार में बाधा डालता है , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.इस सीमा से बचने के लिए, हम एक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर IAV है कि एक Nluc luciferase और एक वीनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन (BIRFLU) व्यक्त उत्पन्न किया है.
इस रिपोर्ट में, हम BIRFLU के इन विट्रो विशेषता और IAV संक्रमण के एक माउस मॉडल का उपयोग कर विवो में वायरल संक्रमण को ट्रैक करने के लिए BIRFLU का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन. BIRFLU Nluc और शुक्र अभिव्यक्ति वायरल titers के साथ सहसंबद्ध. इसके अलावा, BIRFLU स्थिर बने रहे और संक्रमित चूहों के फेफड़ों से बरामद होने के बाद दोनों रिपोर्टर जीन व्यक्त करने के लिए जारी रखा. इस दृष्टिकोण की पहचान और IAV संक्रमण के उपचार के लिए नए चिकित्सीय विकल्प के विकास सहित सुसंस्कृत कोशिकाओं में और पशु मॉडल में IAV का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है.
हालांकि BIRFLU PR8 की रीढ़ का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है, अन्य रिकॉमबिनेंट IAV विभिन्न प्रकार का उपयोग कर, उपप्रकार या वायरल तनाव रीढ़ एक ही प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. इसी तरह, इस रिपोर्ट में हम IAV के एक माउस मॉडल में BIRFLU के उपयोग के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन किया. हालांकि, BIRFLU अन्य पशु मॉडल में आईएवी संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान तकनीक हो सकती है।

इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) ओर्थोमाइक्सोविरिडी परिवार 1,2,3के एक ढंके हुए नकारात्मक-सेंस खंडित आरएनए वायरस है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) का अनुमान है कि 3-5 मिलियन वार्षिक इन्फ्लूएंजा के मामलों और दुनिया भर में इन्फ्लूएंजा से 250,000 से अधिक मौतें4,5,6. विशेष रूप से इन्फ्लुएंजा की चपेट में आने वाले समूहों में बुजुर्ग , प्रतिरक्षा - व्यक्तियों और बच्चोंके 7,8,9,10,11शामिल हैं . हालांकि टीके उपलब्ध हैं और वायरल संक्रमण के खिलाफ सबसे आम और प्रभावी हस्तक्षेप का प्रतिनिधित्व करते हैं, आईएवी तेजी से विकसित करने और preexisting प्रतिरक्षा से बचने में सक्षम है3,12,13, 14 , 15. 2009 में एक महामारी H1N1 तनाव के फिर से उभरने और रोगजनक IAV के उद्भव दुनिया भर में मानव सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए लगातार खतरा दोहराताहै 4,16.
एक महामारी या महामारी के दौरान, यह तेजी से रोगजनकता और नए अलग वायरस की transmissibility निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. वर्तमान में वायरस का पता लगाने के लिए उपलब्ध तकनीकें समय लेने वाली हैं औरकभी-कभी उनके लिए कठिन दृष्टिकोणों के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिससे इन विश्लेषणों के पूरा होने में 17 ,18,19,20की देरी हो सकती है . इसके अलावा, वर्तमान वायरल परख को पैमाने पर मुश्किल है, जो एक प्रकोप की स्थिति के दौरान आवश्यक हो सकता है. अंत में, संक्रमण के मान्य पशु मॉडल का उपयोग, जैसे चूहों, गिनी सूअरों और फेरेट नियमित रूप से उपयोग किया जाता है और इन्फ्लूएंजा संक्रमण, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, और नए टीकों की प्रभावकारिता और / हालांकि, इन मॉडलों वास्तविक समय में वायरल गतिशीलता का निरीक्षण करने में असमर्थता के कारण प्रतिबंधात्मक हैं; इस अध्ययन में वायरल संक्रमण के स्थैतिक इमेजिंग 21 ,22,23,24,25को सीमित किया गया है . इन परखों में प्रयुक्त पशुओं को वायरल लोड का निर्धारण करने के लिए भी इच्छामृत्यु दी जाती है, जिससे इन अध्ययनों को पूरा करने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्यामेंवृद्धि होती है . इन सभी सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, कई शोधकर्ताओं पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम, रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग IAVs, जो virological assays को तेज करने और वास्तविक समय में विवो में वायरल लोड और प्रसार का पता लगाने में सक्षम हैं के उपयोग पर भरोसा करते हैं26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. महत्वपूर्ण बात यह है कि ये रिपोर्टर-अभिव्यक्ति IAVs सेल संस्कृति में जंगली प्रकार (WT) IAVs और संक्रमण के पशु मॉडल में इसी तरह दोहराने में सक्षम हैं33,42.
फ्लोरोसेंट और bioluminescent प्रोटीन दो रिपोर्टर सिस्टम आमतौर पर उनकी संवेदनशीलता, स्थिरता और उपयोग में आसानी के कारण शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल कर रहे हैं. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट और bioluminescent प्रोटीन का पता लगाने प्रौद्योगिकियों में जबरदस्त समर्थन और प्रगतिहै 43,44,45,46,47,48 . फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ल्यूसिफरेज़ के अलग-अलग गुण होते हैं जो उन्हें चमकने की अनुमति देते हैं, विशेष रूप से यह अलग होता है कि उत्तेजित अवस्थाएं कैसे उत्पन्न होती हैं और उत्सर्जन का पता कैसे लगाया जाता है43,44,45, 46,47,48. फ्लोरोसेंट प्रोटीन पहले ऊर्जा को अवशोषित करके उत्तेजित होते हैं, जो बाद में एक अलग तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश के रूप में जारी किया जाता है क्योंकि अणु कम ऊर्जा अवस्था43में कम हो जाते हैं। दूसरी ओर, जैव-दीप्ति एक रासायनिक ऊष्माक्षेपी अभिक्रिया से प्राप्त होती है जिसमें प्रकाश45का उत्पादन करने के लिए सब्सट्रेट, ऑक्सीजन तथा कभी-कभी एटीपी शामिल होता है। रिपोर्टर प्रोटीन के इन दो प्रकार के अलग-अलग गुणों के कारण, एक शायद ब्याज के अध्ययन के आधार पर अन्य की तुलना में अधिक फायदेमंद. जहां फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग कोशिकीय स्थानीयकरण28,41का अवलोकन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है , वहीं उनके विवो संकेतों की तीव्रता अपर्याप्त होती है और अक्सर जीवित ऊतकों में स्वप्रवाहता 49 से अस्पष्ट हो जाती है . इसलिए, शोधकर्ता जीवित जीवों में वायरल गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए ल्यूसिफरेस पर भरोसा करते हैं, हालांकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन को पूर्व विवो अध्ययन50,51,52,53के लिए प्राथमिकता दी जा सकती है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विपरीत, luciferases विवो अध्ययन में और अधिक के लिए सुविधाजनक हैं गैर इनवेसिव दृष्टिकोण मेंलागू 26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.अंत में, अध्ययन के प्रकार के आधार पर, शोधकर्ताओं को या तो एक फ्लोरोसेंट या एक luciferase रिपोर्टर प्रोटीन के उपयोग के बीच उनके readout के रूप में चुनना चाहिए, जो कार्यक्षमताओं और संवेदनशीलता के एक व्यापार बंद करने के लिए अपने अध्ययन विषयों, और गंभीर रूप से पुनः संयोजक रिपोर्टर वायरस की उपयोगिता को प्रतिबंधित करता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट या ल्यूसिफरेस सिस्टम और वायरल प्रतिकृति या प्रसार का उपयोग कर के विभिन्न रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के बीच संबंध के बारे में चिंता है, जो के साथ प्राप्त डेटा की व्याख्या ख़तरे में डालना हो सकता है रिपोर्टर-रिपोर्ट-रिपोर्ट आईएवी.
हम एक पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) है कि दोनों एक फ्लोरोसेंट और एक एक ही वायरल जीनोम55 में एक luciferase प्रोटीन के लिए encodes पैदा करके इस सीमा को दूर किया है (चित्र 1) . यहाँ, NanoLuc luciferase (Nluc), एक छोटे और उज्ज्वल bioluminescent प्रोटीन48, इन्फ्लूएंजा A/Puerto रिको/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, के वायरल हा खंड में हेमग्लूटिनिन (एचए) अनुक्रम के ऊपर डाला गया था 40,55,56,57. इसके अलावा, शुक्र, एक बार इस्तेमाल किया monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन, गैर संरचनात्मक (एनएस) वायरल खंड32,33,36,41,55में डाला गया था. चूंकि BIRFLU दोनों फ्लोरोसेंट और luciferase रिपोर्टर जीन के लिए encodes, या तो रिपोर्टर प्रोटीन संकेत readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है वायरल प्रतिकृति और विट्रो में या विवो55में प्रसार निर्धारित करने के लिए . उत्पादन के बारे में अतिरिक्त जानकारी और इन इन इन इन इन या BIRFLU के vivo लक्षणीकरण में हमारे हाल के प्रकाशन55में पाया जा सकता है . BIRFLU एंटीवायरल दवाओं की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक उपन्यास फ्लोरोसेंट के माध्यम से एंटीबॉडी बेअसर- और bioluminescent आधारित microneutralization परख55. इसके अलावा, BIRFLU भी संक्रमण55के एक माउस मॉडल में वायरल गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पांडुलिपि में, हम इन विट्रो में BIRFLU55 की विशेषता के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन और कैसे विवो में Nluc का पता लगाने के लिए या वीनस पूर्व vivo के लिए vivo luminscence इमेजिंग सिस्टम में उपयोग कर चूहों में BIRFLU संक्रमण का अध्ययन करने के लिए.
आणविक जीव विज्ञान, पशु अनुसंधान और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में अत्याधुनिक तकनीकों का संयोजन, शोधकर्ताओं को आईएवी अनुसंधान के लिए BIRFLU का उपयोग करने का अनूठा अवसर लाता है, जिसमें वायरस-होस्ट इंटरैक्शन, वायरल संक्रमण की गतिशीलता का अध्ययन शामिल है; आईएवी संक्रमण के चिकित्सीय उपचार या अन्य रोगजनक संक्रमण के उपचार के लिए एक टीका वेक्टर के रूप में आईएवी के संभावित उपयोग के लिए उपन्यास टीका दृष्टिकोण का विकास।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS4</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>This software is used in 3.1.10 and 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Albumin solution (BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Store at 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture dishes 100mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used in 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C581-100</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7722-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five- to seven-week-old female BALB/c mice</td>
			<td>National Cancer Institute (NCI)</td>
			<td>555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 Motorized Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 4.7.2 software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumicount</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>H16-L10-4R5</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin 10%</td>
			<td>EMD</td>
			<td>65346-85</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-00-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 20000R Fast1394 Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-075-150</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vmax Kinetic plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection

इन्फ्लुएंजा एक वायरस (IAVs) मानव श्वसन रोग है कि महत्वपूर्ण स्वास्थ्य और आर्थिक परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है कारण. अन्य वायरस के साथ के रूप में, IAV का अध्ययन संक्रमित कोशिकाओं में वायरस की उपस्थिति का पता लगाने के लिए कठिन माध्यमिक दृष्टिकोण के उपयोग की आवश्यकता है और / इस सीमा को हाल ही में पुनः संयोजक IAVs की पीढ़ी के साथ दरकिनार किया गया है आसानी से पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट या bioluminescent (luciferase) रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त. हालांकि, शोधकर्ताओं को विदेशी दृश्यों सहित के लिए आईएवी जीनोम की प्रतिबंधित क्षमता के कारण फ्लोरोसेंट या ल्यूसिफरेस रिपोर्टर जीन का चयन करने के लिए मजबूर किया गया है। इस सीमा को दूर करने के लिए, हम एक पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) stably दोनों एक फ्लोरोसेंट और एक luciferase रिपोर्टर जीन व्यक्त करने के लिए आसानी से इन विट्रो में और विवो में आईएवी संक्रमण को ट्रैक उत्पन्न किया है. इस उद्देश्य के लिए, इन्फ्लुएंजा ए/Puerto रिको/8/34 H1N1 (PR8) के वायरल गैर-संरचनात्मक (एनएस) और हेमग्लूटिनिन (एचए) वायरल खंडों को क्रमशः फ्लोरोसेंट वीनस और बायोल्युमिनेसेंट नैनोलुक लूसीफेरेप्रोटीन को सांकेतिक करने के लिए संशोधित किया गया था। यहाँ, हम आईएवी संक्रमण के एक माउस मॉडल में BIRFLU के उपयोग और दोनों रिपोर्टर जीन का पता लगाने के एक में विवो इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर वर्णन. विशेष रूप से, हम दोनों पत्रकारों और वायरल प्रतिकृति की अभिव्यक्ति के बीच एक अच्छा संबंध देखा है. आणविक जीव विज्ञान, पशु अनुसंधान और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में अत्याधुनिक तकनीकों का संयोजन, शोधकर्ताओं को इन्फ्लूएंजा अनुसंधान के लिए इस उपकरण का उपयोग करने का अनूठा अवसर प्रदान करता है, वायरस होस्ट बातचीत और गतिशीलता के अध्ययन सहित वायरल संक्रमण. महत्वपूर्ण बात, आनुवंशिक रूप से वायरल जीनोम को बदलने के लिए विभिन्न वायरल क्षेत्रों से दो विदेशी जीन व्यक्त करने की व्यवहार्यता के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के अवसरों को खोलता है: (i) उपन्यास IAV टीकों के विकास, (ii) पुनः संयोजक IAVs की पीढ़ी है कि अन्य मानव रोगजनक संक्रमण के उपचार के लिए टीका वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

वायरल संक्रमण के लाइव इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन के लिए एक लुसिफेरेज़-फ्लोरेसेंट रिपोर्टर इन्फ्लुएंजा वायरस

इन्फ्लुएंजा एक वायरस (आईएवी) संक्रामक श्वसन रोगजनक हैं जो वार्षिक महामारियों और कभी-कभी महामारी का कारण बनते हैं। यहाँ, हम एक उपन्यास रिकॉमबिनेंट luciferase और फ्लोरोसेंट-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) का उपयोग कर विवो में वायरल संक्रमण को ट्रैक करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस दृष्टिकोण विवो में आईएवी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है.

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

शोधकर्ताओं ने पहले रिकॉम्बिनेंट इन्फ्लूएंजा वायरस उत्पन्न किया है जो या तो फ्लोरोसेंट या बायोल्यूमिनेसेंट प्रोटीन रिपोर्टर्स को व्यक्त करते हैं । इंफ्लूएंजा वायरस में रिपोर्टर जीन की हमारी एकल अभिव्यक्ति का हिस्सा गंभीर रूप से प्रयोगों में इसके उपयोग को सीमित करता है । हमारा प्रोटोकॉल बाइरिपोर्टर इन्फ्लूएंजा वायरस के उपयोग का वर्णन करता है जो फ्लोरोसेंट और बायोल्यूमिनेसेंट रिपोर्टर जीन दोनों को व्यक्त करता है, और इसलिए इसकी सीमा बढ़ जाती है।इस तकनीक का मुख्य लाभ इन विट्रो और वीवो अध्ययनों के लिए एकल पुनर्संयोजन इन्फ्लूएंजा वायरस का उपयोग है। इस तकनीक का प्रदर्शन करते समय, लूसिफ़ेरेस सब्सट्रेट का तेजी से इंजेक्शन और चूहों से निपटने की उचित योजना महत्वपूर्ण है, क्योंकि सब्सट्रेट जल्दी से चयापचय होता है। इसके अलावा, बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल का पता लगाने में सुधार करने के लिए चूहों की शेविंग की सिफारिश की जाती है।चूहों को संक्रमित करने के लिए, 1X पीबीएस में BIRFLU तैयार करके शुरू करें। टीका लगाने तक बर्फ पर वायरस बनाए रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि माउस एनेस्थेटाइज्ड है, तो अंगुली चुटकी पलटा की अनुपस्थिति की जांच करें, और इसे तैयार BIRFLU कमजोर पड़ने के साथ इंट्रानासैलाई टीका करें।सुनिश्चित करें कि सभी चूहे अपने पिंजरों में लौटने से पहले ठीक से सांस ले रहे हैं। इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और शुरुआती प्रेस करें, फिर इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों को सेट करें। BIRFLU से संक्रमित चूहों की निगरानी करने के लिए, बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल का पता लगाने में सुधार करने के लिए अपनी छाती को शेव करें।एक बार चूहों को एनेस्थेटाइज्ड करने के बाद, एनएलयूसी लूसिफ़ेरेस सब्सट्रेट के 100 माइक्रोलीटर को रेट्रो-ऑर्बिटली प्रशासित करने के लिए 22 गेज सुई का उपयोग करें, जो पीबीएस में एक से 10 तक पतला हो जाता है। इंजेक्शन के तुरंत बाद, जानवरों को आइसोलेशन चैंबर में रखें, जिसमें उनकी छाती का सामना करना पड़ रहा है। फिर, इमेजिंग उपकरण में आइसोलेशन चैंबर रखें, दरवाजा बंद करें, और छवियों को प्राप्त करें।इमेजिंग के बाद, चूहों को उनके पिंजरों में वापस करें और जब तक वे पूरी तरह से ठीक नहीं हो जाते तब तक उनकी निगरानी करें। ब्याज और क्लिक करने के उपाय के एक क्षेत्र को नामित करके अधिग्रहीत बायोल्यूमिनेसेंस डेटा का विश्लेषण करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर आरओआई टूल का उपयोग करें। माउस फेफड़ों के पूर्व वीवो इमेजिंग करने के लिए, पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार फेफड़ों को इकट्ठा करें, छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें, और इमेजिंग के लिए पैरामीटर सेट करें।एक बार मशीन शुरू हो जाने के बाद, फेफड़ों को एक काले रंग की पृष्ठभूमि ट्रे में रखें, और यह सुनिश्चित करें कि ऊतकों को एक दूसरे से अलग कर दिया जाए। इमेजर में ट्रे का परिचय दें, दरवाजा बंद करें, और छवियों को प्राप्त करें। इमेजिंग के बाद, ऊतकों को तुरंत हटा दें और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर स्टोर करें यदि नमूनों पर उसी दिन कार्रवाई की जाएगी।यदि उन्हें बाद में संसाधित किया जाएगा, तो उन्हें सूखी बर्फ पर एक ट्यूब में जल्दी से फ्रीज करें, और उन्हें 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। छवियों को संसाधित करने के लिए, आरओआई टूल का चयन करें, प्रत्येक व्यक्तिगत फेफड़ों के आसपास रुचि के क्षेत्रों को आकर्षित करें, और उपाय पर क्लिक करें। संक्रमित कोशिकाओं में वीनस, एनक्यूसी और एनपी अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण करके विट्रो में बीआईआरएफयू की विशेषता है।वीनस और एनएनएलयू अभिव्यक्ति केवल BIRFLU से संक्रमित कोशिकाओं में पता लगाया जाता है, जबकि एनपी दोनों जंगली प्रकार PR8 और BIRFLU संक्रमित कोशिकाओं में व्यक्त की जाती है । नकली संक्रमित कोशिकाओं में कोई अभिव्यक्ति नहीं देखी जाती है। इसके अलावा, Nluc गतिविधि 24, ४८, ७२, और ९६ घंटे के बाद संक्रमण में ऊतक संस्कृति supernatants में मापा गया है ।यह संक्रमण के बाद 24 घंटे के रूप में जल्दी पता चला है, और अभिव्यक्ति के स्तर में ९६ घंटे में वृद्धि हुई है । यह भी प्रदर्शित किया जा सकता है कि BIRFLU की प्रतिकृति काइनेटिक्स जंगली प्रकार पीआर 8 वायरस के बराबर हैं। BIRFLU में फ्लोरोसेंट और बायोल्यूमिनेसेंट रिपोर्टर जीन दोनों को व्यक्त करने की क्षमता है, और दोनों के बीच सहसंबंध का आकलन वीवो और माउस फेफड़ों के पूर्व वीवो इमेजिंग में किया जा सकता है।बीआरएफयू से संक्रमित चूहों के फेफड़ों में वीवो और फ्लोरेसेंस पूर्व वीवो में उच्च बायोल्यूमिनेसेंस प्रदर्शित किया गया। वीवो में बीआईआरएफयू के वायरल टाइटर्स और जेनेटिक स्टेबिलिटी का भी निर्धारण किया गया है । पट्टिका माउस फेफड़ों से वायरस परsays से पता चला है कि वायरस सजीले टुकड़े फार्म और दोनों रिपोर्टर जीन व्यक्त कर सकते हैं ।BIRFLU का उपयोग एंटीवायरल की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने और इन्फ्लूएंजा के खिलाफ एंटीबॉडी को बेअसर करने के लिए भी किया जा सकता है। इन परख से उत्पादन सभी एक दूसरे के साथ सहसंबद्ध थे और जल्दी और करने के लिए आसान कर रहे हैं ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Bioluminescent इमेजिंग बीच योगवाहिता जांच स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया इन्फ्लुएंजा और शिशु चूहे में एक वायरस

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

इन्फ्लुएंजा वायरस के लिए उच्च throughput जांच विधि

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

स्वाइन से इन्फ्लुएंजा ए वायरस का पता लगाने और अलगाव के लिए नाक पोंछे

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

ढाल centrifugation द्वारा इन्फ्लुएंजा एक वायरस capsids की इन विट्रो disassembly में

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

मापने एंजाइम से जुड़ी Lectin परख द्वारा इन्फ्लुएंजा neuraminidase निषेध एंटीबॉडी titers

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

प्रतिदीप्ति आधारित neuraminidase निषेध परख विषाणु-विरोधी की neuraminidase अवरोध करनेवाला वर्ग के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

इंफ्लूएंजा संक्रमण के एक माउस मॉडल में एक वायरस अध्ययन

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

बचने इंफ्लूएंजा वायरस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के भागने के वेरिएंट की पीढ़ी

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

इमेजिंग सेल सांस म्यूकोसा में संपर्क के दौरान इंफ्लूएंजा वायरस के संक्रमण का उपयोग कर दो-फोटॉन Intravital माइक्रोस्कोपी

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग पुनः संयोजक सार्स-सीओवी-2 का उपयोग करते हुए के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में वायरल संक्रमण की लाइव इमेजिंग और मात्रा का ठहराव

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...