Name: a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00
Duration: 5 min 21 s
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La ricerca sul virus dell'influenza nel laboratorio LM-S è parzialmente finanziata dal New York Influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 2722014000055C), membro del contratto NIAID Centers of Excellence for Excellence Research and Surveillance (CEIRS) No. HHSN272201400005C (NYICE) e dal Dipartimento della Difesa (DoD) Peer Reviewed Medical Research Program (PRMRP) concedere W81XWh-18-1-0460.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I ricercatori si sono affidati a virus ricombinanti che esprimono i virus come strumenti molecolari vitali per comprendere ed espandere l'attuale comprensione della replicazione virale e della patogenesi26,27,28, 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54. I geni reporter più comunemente favoriti sono le luciferasi e le proteine fluorescenti, principalmente a causa dei progressi tecnologici nella loro identificazione, nello sviluppo di varianti migliorate e nel rilevamento da parte delle tecnologie di imaging43 , 44 (di sistema) , 45 anni , 46 per quanto , 47 o , 48. I virus dei reporter ricombinanti sono spesso utilizzati per accelerare i saggi virologici, studiare le dinamiche dei virus in vitro e in vivo, e per testare l'efficacia degli approcci terapeutici e di vaccino attualmente approvati o nuovi,26, 27 ,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Purtroppo, nel caso dello IAV, gli studi passati sono stati limitati all'espressione di un singolo gene reporter, che ostacola il tipo di studio che potrebbe essere condotto 26,27,28,29 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54. Per evitare questa limitazione, abbiamo generato un bireporter competente alla replica Che esprime una luciferasi Nluc e una proteina fluorescente di Venere (BIRFLU).
In questa relazione, descriviamo la caratterizzazione in vitro di BIRFLU e gli approcci sperimentali per utilizzare BIRFLU per monitorare l'infezione virale in vivo utilizzando un modello murino di infezione da IAV. L'espressione BIRFLU Nluc e Venere è correlata ai titer virali. Inoltre, BIRFLU è rimasta stabile e ha continuato ad esprimere entrambi i geni dei reporter dopo essere stata recuperata dai polmoni dei topi infetti. Questo approccio offre ai ricercatori un'ottima opportunità per studiare lo IAV in cellule coltivate e in modelli animali, compresa l'identificazione e lo sviluppo di nuove alternative terapeutiche per il trattamento delle infezioni da IAV.
Sebbene BIRFLU sia stato generato utilizzando la spina dorsale della PR8, altri IAV ricombinanti che utilizzano backbone di tipo, sottotipo o virale di tipo diverso potrebbero essere generati utilizzando lo stesso approccio sperimentale. Allo stesso modo, in questa relazione abbiamo descritto le procedure sperimentali per l'uso di BIRFLU in un modello murino di IAV. Tuttavia, BIRFLU potrebbe essere una tecnologia preziosa per valutare l'infezione da IAV in altri modelli animali.

Influenza A virus (IAV) è un virus rna segmentato a senso negativo a singolo filamento avvolto della famiglia Orthomyxoviriridae 1,2,3. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima 3-5 milioni di casi annui di influenza e oltre 250.000 decessi da influenza in tutto il mondo4,5,6. I gruppi particolarmente vulnerabili all'influenza includono gli anziani, gli individui immunocompromessi e i bambini7,8,9,10,11. Sebbene i vaccini siano disponibili e rappresentino l'intervento più comune ed efficace contro l'infezione virale, lo IAV è in grado di evolvere rapidamente e sfuggire all'immunità preesistente3,12,13, 14 Del sistema , 15. Il riemergere di un ceppo pandemico H1N1 nel 2009 e l'emergere di iAV patogeni ribadisce la costante minaccia alla salute pubblica umana in tutto il mondo4,16.
Durante un'epidemia o una pandemia, è fondamentale determinare rapidamente la patogenicità e la trasmissibilità dei virus appena isolati. Attualmente disponibili tecniche per rilevare il virus sono lunghe e talvolta richiedono l'uso di approcci laboriosi, che possono ritardare il completamento di queste analisi17,18,19,20. Inoltre, gli attuali saggi virali sono difficili da scalare, il che potrebbe essere necessario in caso di epidemia. Infine, l'uso di modelli animali convalidati di infezione, come topi, porcellini d'India e furetti, è usato regolarmente e sono fondamentali per studiare le infezioni influenzali, le risposte immunitarie e l'efficacia di nuovi vaccini e/o antivirali. Tuttavia, questi modelli sono restrittivi a causa dell'incapacità di osservare le dinamiche virali in tempo reale; questo limita gli studi all'imaging statico delle infezioni virali21,22,23,24,25. Anche gli animali utilizzati in questi saggi sono eutanasia per determinare il carico virale, aumentando così il numero di animali necessari per completare questi studi26. Per aggirare tutte queste limitazioni, molti ricercatori si affidano all'uso di IAV ricombinanti, competenti e giornalistici, in grado di accelerare i saggi virologici e rilevare il carico virale e la diffusione in tempo reale26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. È importante sottolineare che questi IAV che esprimono i reporter sono in grado di replicarsi in modo simile agli IAV wild-type (WT) nella coltura cellulare e nei modelli animali di infezione33,42.
Le proteine fluorescenti e bioluminescenti sono due sistemi di reporter comunemente utilizzati dai ricercatori a causa della loro sensibilità, stabilità e facilità d'uso. Inoltre, c'è un enorme supporto e progresso nelle tecnologie di rilevamento delle proteine fluorescenti e bioluminescenti43,44,45,46,47,48 . Le proteine fluorescenti e le luciferasi hanno proprietà diverse che permettono loro di brillare, in particolare diverse per quanto vengono generati gli stati eccitati e come viene rilevata l'emettitore43,44,45, 46,47,48. Le proteine fluorescenti sono prima eccitate assorbendo energia, che viene successivamente rilasciata come luce a una diversa lunghezza d'onda come le molecole diminuiscono a uno stato di energia inferiore43. D'altra parte, la bioluminescenza è derivata da una reazione esotermica chimica che coinvolge un substrato, ossigeno, e talvolta ATP al fine di produrre luce45. A causa delle diverse proprietà di questi due tipi di proteine reporter, uno forse più vantaggioso dell'altro a seconda dello studio di interesse. Mentre le proteine fluorescenti sono ampiamente utilizzate per osservare la localizzazione cellulare28,41, i loro segnali in vivo hanno un'intensità inadeguata e sono spesso oscurati dall'autofluorescenza nei tessuti vivi49. Pertanto, i ricercatori si basano su luciferasi per valutare la dinamica virale negli organismi vivi, anche se le proteine fluorescenti possono essere preferite per gli studi ex vivo50,51,52,53. A differenza delle proteine fluorescenti, le luciferasi sono più convenienti per gli studi in vivo e più applicabili negli approcci non invasivi26,27,28,29,30 , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54.In ultima analisi, sulla base del tipo di studio, i ricercatori devono scegliere tra l'uso di una proteina fluorescente o lucidferasi come loro lettura, che sottopone il loro studio a un compromesso di funzionalità e sensibilità, e gravemente limita l'utilità dei virus del reporter ricombinante. Inoltre, vi sono preoccupazioni circa la correlazione tra l'espressione di diversi geni reporter utilizzando sistemi di fluorescenza o luciferasi e la replica o diffusione virale, che potrebbe compromettere l'interpretazione dei dati ottenuti con giornalisti che esprimono IAV.
Abbiamo superato questa limitazione generando una replica ricombinante-competente Bi-reporter IAV (BIRFLU) che codifica sia per una proteina fluorescente e una lucidferasi nello stesso genoma virale55 (Figura 1). Qui, NanoLuc luciferate (Nluc), una piccola e luminosa proteina bioluminescente48, è stata inserita a monte della sequenza di emagglutinina (HA) nel segmento HA virale dell'influenza A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Inoltre, Venere, una proteina fluorescente monomerica di uso frequente, è stata inserita nel segmento virale non strutturale (NS)32,33,36,41,55. Poiché BIRFLU codifica per geni di reporter fluorescenti e luciferasi, il segnale proteico del reporter può essere utilizzato come lettura per determinare la replicazione virale e la diffusione in vitro o in vivo55. Ulteriori informazioni riguardanti la generazione e la caratterizzazione in vitro o in vivo di BIRFLU sono reperibili nella nostra recente pubblicazione55. BIRFLU può essere utilizzato per testare l'efficacia dei farmaci antivirali o neutralizzare gli anticorpi attraverso un nuovo test di microneutralizzazione fluorescente e bioluminescente55. Inoltre, BIRFLU può essere utilizzato anche per valutare la dinamica virale in un modello murino di infezione55. In questo manoscritto vengono descritte le procedure per caratterizzare BIRFLU55 in vitro e come studiare l'infezione da CANNAFLU nei topi utilizzando sistemi di imaging della luminescenza in vivo per l'individuazione di Nluc in vivo o di Venere ex vivo.
La combinazione di tecniche all'avanguardia in biologia molecolare, ricerca animale e tecnologie di imaging, offre ai ricercatori l'opportunità unica di utilizzare BIRFLU per la ricerca IAV, compreso lo studio delle interazioni virus-ospite, le dinamiche dell'infezione virale; lo sviluppo di nuovi approcci vaccinali per il trattamento terapeutico delle infezioni da IAV o il potenziale uso di IAV come vettore di vaccino per il trattamento di altre infezioni patogene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS4</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>This software is used in 3.1.10 and 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Albumin solution (BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Store at 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture dishes 100mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used in 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C581-100</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7722-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five- to seven-week-old female BALB/c mice</td>
			<td>National Cancer Institute (NCI)</td>
			<td>555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 Motorized Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 4.7.2 software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumicount</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>H16-L10-4R5</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin 10%</td>
			<td>EMD</td>
			<td>65346-85</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-00-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 20000R Fast1394 Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-075-150</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vmax Kinetic plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection

I virus dell'influenza A (IAV) causano malattie respiratorie umane associate a conseguenze economiche e sanitarie significative. Come con altri virus, lo studio dello IAV richiede l'uso di laboriosi approcci secondari per rilevare la presenza del virus nelle cellule infette e/o nei modelli animali di infezione. Questa limitazione è stata recentemente aggirata con la generazione di IAV ricombinanti che esprimono proteine reporterstiche fluorescenti o bioluminescenti (luciferasi) facilmente tracciabili. Tuttavia, i ricercatori sono stati costretti a selezionare geni di reporter fluorescenti o luciferasi a causa della limitata capacità del genoma IAV per l'inclusione di sequenze estranee. Per superare questa limitazione, abbiamo generato un bireporter iav (BIRFLU) ricombinante che esprime stabilmente un gene di reporter fluorescente e luciferasi per tracciare facilmente le infezioni IAV in vitro e in vivo. A tal fine, i segmenti virali virali non strutturali (NS) ed emagglutinina (HA) dell'influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) sono stati modificati per codificare rispettivamente la Venere fluorescente e le proteine bioluminescenti Nanoluc luciferasi. Qui, descriviamo l'uso di BIRFLU in un modello murino di infezione da IAV e il rilevamento di entrambi i geni reporter utilizzando un sistema di imaging in vivo. In particolare, abbiamo osservato una buona correlazione tra le espressioni sia dei giornalisti che della replica virale. La combinazione di tecniche all'avanguardia in biologia molecolare, ricerca animale e tecnologie di imaging, fornisce ai ricercatori l'opportunità unica di utilizzare questo strumento per la ricerca influenzale, compreso lo studio delle interazioni virus-ospite e delle dinamiche di infezioni virali. È importante sottolineare che la fattibilità di modificare geneticamente il genoma virale per esprimere due geni estranei provenienti da diversi segmenti virali apre opportunità di utilizzare questo approccio per: (i) lo sviluppo di nuovi vaccini IAV, (ii) la generazione di IAV ricombinanti che possono essere utilizzati come vettori di vaccino per il trattamento di altre infezioni da patogeni umani.

Generazione e caratterizzazione di BIRFLU in vitro (Figura 1 e Figura 2)
Un IAV ricombinante che esprime due diversi geni reporter (BIRFLU) è stato costruito utilizzando tecniche di biologia molecolare allo stato dell'arte e tecniche di genetica inversa basate sul plasmide (Figura 1). Qui, abbiamo scelto di utilizzare Nluc a causa di diversi vantaggi rispetto ad altre luciferasi, tra cui le sue piccole dimensioni, indipendenza ATP, maggiore intensità, e substrato ottimizzato48,60. Nluc è stato clonato nel segmento HA di IAV PR8 seguito dal sito di scissione porcine (PTV) 2A (2A) di fronte al telaio di lettura aperto (ORF) di HA (Figura1). L'ORF di HA includeva mutazioni silenziose per rimuovere i segnali di imballaggio originali ed evitare ogni possibile ricombinazione. Il segnale completo di imballaggio HA è stato aggiunto di fronte a Nluc per consentire una corretta incorporazione del segmento HA modificato nel virione e Nluc e l'espressione HA dallo stesso segmento di RNA virale (Figura 1). Inoltre, la proteina fluorescente Venere è stata clonata in un segmento IAV PR8 NS modificato che codifica le due proteine virali NS1 e NEP da una singola trascrizione32,36,41,54, 57. A tal fine, Venere è stata fusa al terminale C di NS1 e l'intero NEP ORF è stato clonato a valle del sito di scissione PTV 2A che è stato collocato tra le sequenze NS1-Venus e NEP (Figura 1). In definitiva, questi due costrutti di plasmide virali HA e NS modificati sono stati utilizzati in combinazione con il resto dei plasmidi di genetica inversa di IAV PR8 per generare BIRFLU (Figura 1). La caratterizzazione in vitro e in vivo di BIRFLU è stata descritta in precedenza55.
Nella Figura 2, abbiamo caratterizzato in vitro BIRFLU determinando i livelli di espressione di Venere, Nluc e NP utilizzando la fluorescenza e gli approcci di immunofluorescenza indiretta ( Figura2A, B). I monostrati confluenti delle cellule MDCK sono stati infettati o infetti (MOI 0.1) con virus WT o BIRFLU PR8 e, a 18 h dopo l'infezione, L'espressione di Venere è stata valutata direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza (Figura2A,B). L'espressione di Nluc (Figura 2A) e NP (Figura 2B) sono state visualizzate con immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi specifici per ogni proteina. Come previsto, l'espressione di Venere e Nluc è stata rilevata solo nelle cellule infettate da BIRFLU e non nelle cellule infettate dal virus WT PR8. Inoltre, la microscopia indiretta immunofluorescenza ha rivelato l'espressione NP nelle cellule infettate da WT e BIRFLU PR8. Nessuna espressione di Venere, Nluc o NP è stata rilevata, come previsto, in cellule infettate (Figura A,B).
Per valutare i livelli di espressione di Nluc in vitro, le cellule MDCK sono state infettate (MOI 0.001) con virus WT o BIRFLU PR8 e l'attività di Nluc nei supernatanti di coltura dei tessuti è stata valutata a 24, 48, 72 e 96 h dopo l'infezione (Figura 2C). Solo l'attività di Nluc è stata rilevata nella coltura tissutale dei supernatanti MDCK infettati da BIRFLU (Figura 2C). L'attività di Nluc nella coltura tissutale supernatanti è stata rilevata già 24 h dopo l'infezione con livelli di espressione superiore a 96 h dopo l'infezione, molto probabilmente perché l'effetto citopatico (CPE) indotto durante l'infezione virale rilascia la proteina Nluc conservata nella cellula. Per valutare l'idoneità del BIRFLU nelle cellule coltivate, è stata valutata anche la cinetica di crescita dei virus WT e BIRFLU PR8 (Figura 2D) e la presenza di virus infettivi nei supernatanti della coltura dei tessuti è stata determinata dal saggio di messa a fuoco immunitaria (Figura2D ). In particolare, la cinetica di replicazione BIRFLU era paragonabile a quella del virus WT PR8, anche se la replicazione BIRFLU è stata leggermente ritardata e non ha raggiunto gli stessi titoti virali del WT PR8. Tuttavia, BIRFLU è stato in grado di raggiungere i destinatari di 5 x 107 PFU/mL (Figura 2D), indicando che l'espressione di due geni reporter nel genoma virale non interferisce in modo significativo con la replicazione di BIRFLU nelle cellule MDCK.
Monitoraggio dell'infezione da BIRFLU nei topi (Figura 3 e Figura 4)
La figura 3 è un diagramma di flusso schematico per la valutazione delle dinamiche BIRFLU in un modello murino di infezione da IAV. I topi femminili BALB/C di cinque-sette settimane sono stati infettati con 1x PBS o infettati da 1 x 106 PFU di BIRFLU per intranasaalmente. A 3 giorni dopo l'infezione, i topi sono stati anestesizzati con isoflurane e poi iniettati con Nluc substrato retroorbitale. Tutti i topi sono stati immediatamente posizionati nello strumento IVIS e il segnale Nluc è stato valutato in vivo utilizzando l'IVIS. Successivamente, i topi sono stati eutanasia e i polmoni sono stati raccolti. I polmoni eccitati sono stati poi analizzati ex vivo usando l'imager in vivo per determinare l'intensità della fluorescenza attraverso l'espressione di Venere. Infine, i polmoni dei topi sono stati omogeneizzati, e i titori virali e la stabilità sono stati determinati dal saggio placca. Le placche sono state valutate dalla fluorescenza diretta di Venere, immunostando utilizzando anticorpi specifici per Nluc e dalla colorazione viola di cristallo.
Gli IAV che esprimono in precedenza la replicazione-competente esprimono un singolo gene reporter, il più delle volte una proteina fluorescente o bioluminescente, come surrogato dell'infezione virale e della replicazione. Tuttavia, BIRFLU, è in grado di esprimere entrambi i tipi di geni reporter in base all'infezione virale. Per valutare la correlazione tra bioluminescenza (imaging in vivo) e fluorescenza (imaging ex vivo) dopo l'infezione da BIRFLU, i topi femminili BALB/c di cinque-sette settimane sono stati infettati con 1x PBS o inoculati con BIRFLU (106 PFU) intranasaalmente . L'attività di Nluc (Figura 4A) è stata valutata dalla somministrazione del substrato Nluc iniettato retroorbitalmente a 3 giorni dopo l'infezione utilizzando uno strumento di imaging in vivo. Abbiamo scelto di valutare la bioluminescenza al giorno 3 perché studi precedenti hanno indicato che la replica IAV, tra cui PR8, picchi tra i giorni 2 e 4 post-infezione24,54. La bioluminescenza è stata monitorata (Figura 4A, in alto) e utilizzata per calcolare il flusso totale medio (Flusso (log10 p/s) (Figura 4A, in basso). Come previsto, i topi inoculati con BIRFLU mostravano un'elevata attività di bioluminescenza, ma non è stato rilevato alcun segnale nei topi infetti finti. Successivamente, i polmoni dei top infetti sono stati raccolti e l'espressione di Venere è stata valutata utilizzando l'imaging ex vivo (Figura 4B, superiore). Inoltre, è stata calcolata l'efficienza radiante media a fluorescenza (Figura4B, fondo). I polmoni di topi eccitati sono stati omogeneizzati anche per determinare i titer virali e la stabilità genetica di BIRFLU in vivo (Figura 4C, D). La stabilità genetica di BIRFLU è stata analizzata attraverso il test della placca usando i virus isolati dai polmoni dei topi e dalla microscopia fluorescente (Venere, in alto), dall'immunostaining (Nluc, al centro) e dalla colorazione viola di cristallo (in basso). LA BIRFLU recuperata dai polmoni nei topi è stata in grado di formare placche ed esprime stabilmente entrambi i geni dei reporter (Figura 4C). In particolare, abbiamo osservato una buona correlazione tra bioluminescenza e segnali di fluorescenza con replicazione virale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica della struttura e del genoma Di IAV PR8 WT e BIRFLU. IAV sono circondati da un bistrato lipidico contenente le due principali lecoproteine virali hemagglutinin (HA; nero) e neuraminidase (NA; blu). IAV contengono otto segmenti di RNA a filamento singolo, senso negativo, RNA (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M e NS). Ogni segmento virale contiene regioni non codificanti (NCR) alle estremità 3' e 5' (scatole nere). Inoltre, alla fine 3 e 5 ' della fine degli RNA virali (v) sono i segnali di imballaggio, responsabili dell'efficiente encapsidazione dei vRNA in virioni nascenti (scatole bianche). IAV PR8 HA e NS segmenti virali e prodotti sono indicati in nero. Le sequenze di Nluc, Venere e PTV 2A sono indicate rispettivamente in strisce rosse, verdi e a strisce. È indicata anche la rappresentazione schematica dei segmenti HA e NS modificati che esprimono rispettivamente Nluc e Venere in BIRFLU. Questa cifra è stata adattata da Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Figura 2: caratterizzazione in vitro di BIRFLU. (A, B) Analisi dell'espressione proteica per fluorescenza diretta e immunofluorescenza. Le cellule MDCK sono state infettate o infettate (MOI 0.1) da virus PR8 WT o BIRFLU. Le cellule infette sono state fissate a 18 h dopo l'infezione per visualizzare direttamente l'espressione di Venere mediante microscopia fluorescente diretta e per visualizzare l'espressione di Nluc (A) e NP virale (B)utilizzando anticorpi specifici e immunofluorescenza indiretta. Nuclei sono stati macchiati con DAPI. Vengono visualizzate immagini rappresentative (20 volte l'ingrandimento). Barre della scala: 100 m. (C, D) Cinetica di crescita di PR8 WT e BIRFLU. L'attività di Nluc (C) e i titori virali (D) nei supernatanti della coltura tissutale provenienti da cellule MDCK infettate (MOI 0.001) con virus WT e BIRFLU PR8 sono stati valutati nei periodi di post-infezione. I dati rappresentano la media : SD dei triplicati. I titer virali sono stati determinati dal saggio di messa a fuoco immunitaria (FFU/mL). La linea punteggiata indica il limite di rilevamento (200 FFU/ml). Questa cifra è stata adattata da Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Figura 3: Rappresentazione schematica per lo studio della CANNAFLU nei topi. Espressione dei geni reporter di Nluc e Venere è stata valutata in topi infetti da 1 x 106 PFU di CANNAFLU utilizzando immagini in vivo o ex vivo. In breve, il giorno 1, 5 a 7 settimana-vecchie topi BALB / c femminili sono stati simulati infettati (1x PBS) o inoculati con 1 x 106 PFU di BIRFLU intranasaalmente. Al giorno 3 post-infezione, i topi erano leggermente anestesizzati usando isoflurane e il substrato Nluc veniva iniettato retroorbitalmente. Il segnale Nluc è stato valutato direttamente utilizzando l'imaging in vivo. Subito dopo l'imaging, i topi sono stati eutanasia e l'espressione di Venere in polmoni interi ascisi è stata analizzata utilizzando l'imaging ex vivo. I polmelli murini recuperati sono stati omogeneizzati per valutare la replicazione virale e la stabilità mediante test di placca. Le frecce indicano la correlazione tra fluorescenza (Venere), immunostaining (Nluc) e colorazione viola di cristallo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Figura 4: Espressione di bioluminescenza e fluorescenza in vivo. Le femmine di quattro-sette settimane di topi BALB/c sono state infettate in modo mock-infetto (1x PBS) o inoculate con 1 x 106 PFU di BIRFLU intranasaalmente. Al giorno 3 dopo l'infezione, è stata determinata l'attività nluc (A) in tutto il mouse. Immagini rappresentative di un singolo mouse che mostrano la scala di radianza (p/sec/cm2/sr). Sono stati quantificati i valori di radianza della bioluminescenza e viene mostrato il flusso totale medio (Flusso (Log10 p/s). Dopo l'imaging di Nluc, i polmoni sono stati raccolti per l'imaging ex vivo (B). Vengono mostrate immagini rappresentative da polmoni interi. Per quantificare l'espressione di Venere, sono stati calcolati i valori medi delle regioni di interesse (ROI) in base alla auto-fluorescenza polmonare da topi infettati in modo fittizio. Per analizzare la stabilità genetica di BIRFLU in vivo, i virus recuperati dai polmoni dei topi sono stati analizzati mediante analisi della placca utilizzando la microscopia fluorescente (Venere, in alto), l'immunostaining (Nluc, al centro) e la colorazione viola cristallina (in basso) (C). Vengono visualizzate le immagini rappresentative da un solo mouse. Per valutare la replicazione dei virus, i polmoni interi sono stati omogeneizzati dopo l'imaging e utilizzati per infettare le cellule MDCK e determinare i titoli virali con un assaggio di placca (PFU/mL) (D). Le frecce indicano la correlazione tra fluorescenza (Venere), immunostaining (Nluc) e colorazione viola di cristallo. Le barre rappresentano la media : SD di titer virus polmonari. Questa cifra è stata adattata da Logales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Media e soluzioni per la cultura dei tessuti</td>
			<td>composizione</td>
			<td>deposito</td>
			<td>usare</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Media di coltura dei tessuti: Il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM), il 10 % Siero Bovino Fetale (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-glutamine (PSG) (DMEM 10 % FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 mL di FBS e 5 mL di 100x PSG.</td>
			<td>4 gradi centigradi</td>
			<td>Manutenzione delle cellule MDCK</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Supporti post-infezione: DMEM 0.3% Albumina Bovina (BA), 1% PSG(DMEM 0.3% BA 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml di 35 % BA e 5 ml di 100x PSG</td>
			<td>4 gradi centigradi</td>
			<td>Manutenzione delle cellule MDCK dopo l'infezione virale</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 volte la salina memorizzata nel buffer del fosfato (PBS)</td>
			<td>80 g di NaCl, 2 g di KCl, 11,5 g di Na2HPO4.7H2O, 2 g di KH2PO4. Aggiungere gg2O fino a 1 L. Regolare il pH a 7,3</td>
			<td>temperatura ambiente</td>
			<td>Per preparare 1x PBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>Diluire 10x PBS con ddH2O</td>
			<td>temperatura ambiente</td>
			<td>Lavare le cellule</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Supporti di infezione: 1x PBS, 0,3% BA, 1% Penicillina-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS).</td>
			<td>487 mL 1x PBS sterile, 4,2 mL di 35% BA e 5 ml di 100x 1% PS(100 U/mL)</td>
			<td>4 gradi centigradi</td>
			<td>Infezioni virali</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Soluzione di fissaggio/permeabilizzazione: 4% formaldeide, 0,5% triton X-100 diluito in 1x PBS.</td>
			<td>400 mL neutro buffered formalina 10%, 5 ml di Triton X-100 e 595 mL di 1x PBS</td>
			<td>temperatura ambiente</td>
			<td>Correzione e permeabilizzazione delle cellule MDCK.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Soluzione di blocco: 2,5% Bovine Serum Albumin (BSA) in 1x PBS.</td>
			<td>2,5 g di BSA in 97,5 mL di 1x PBS</td>
			<td>4 gradi centigradi</td>
			<td>Soluzione di blocco per immunofluorescenza e saggi di placca.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di diluizione anticorpale (1% BSA in 1x PBS)</td>
			<td>1 g di BSA in 99 mL di 1x PBS</td>
			<td>4 gradi centigradi</td>
			<td>Diluizione di anticorpi primari e secondari.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione viola cristallo 0.1%</td>
			<td>1 g di cristallo viola in 400 mL di metanolo. Aggiungere 600 ml di ddH2O</td>
			<td>temperatura ambiente</td>
			<td>Colorazione delle cellule MDCK nei saggi di placca.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl cloromemethyl chetone (TPCK) -trattato trypsin</td>
			<td>Preparare una soluzione di stock 1.000x a 1 mg/mL in ddH2O</td>
			<td>-20 gradi centigradi</td>
			<td>Per infezioni virali.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Media e soluzioni per la cultura dei tessuti.

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A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Un virus fluorescente di Luciferasi-fluorescente Reporter per l'imaging dal vivo e la quantificazione dell'infezione virale

I virus dell'influenza A (IAV) sono patogeni respiratori contagiosi che causano epidemie annuali e pandemie occasionali. Qui, descriviamo un protocollo per monitorare le infezioni virali in vivo utilizzando una nuova luciferasi ricombinante e la fluorescenza-espressione bireporter IAV (BIRFLU). Questo approccio fornisce ai ricercatori un eccellente strumento per studiare IAV in vivo.

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

I ricercatori hanno precedentemente generato virus influenzali ricombinanti che esprimono reporter di proteine fluorescenti o bioluminescenti. Parte della nostra unica espressione di geni reporter nel virus influenzale limita gravemente il suo uso negli esperimenti. Il nostro protocollo descrive l'uso del virus dell'influenza bireporter che esprime geni reporter fluoresenti e bioluminescenti, e quindi supera la sua limitazione.Il principale vantaggio di questa tecnica è l'uso di un singolo virus influenzale ricombinante per studi in vitro e in vivo. Quando si esegue questa tecnica, è importante una rapida iniezione del substrato di luciferasi e una corretta pianificazione della manipolazione dei topi, perché il substrato viene rapidamente metabolizzato. Inoltre, si consiglia la rasatura dei topi per migliorare il rilevamento del segnale bioluminescente.Per infettare i topi, iniziare preparando il BIRFLU in 1X PBS. Mantenere il virus sul ghiaccio fino all'inoculazione. Verificare l'assenza del riflesso di avvicinamento delle dita dei piedi per assicurarsi che il mouse sia anestetizzato e inocularlo per via intranasale con la diluizione BIRFLU preparata.Assicurati che tutti i topi respirino correttamente prima di riportarli nelle loro gabbie. Aprire il software di imaging e premere Initialize, quindi impostare i parametri che verranno utilizzati per l'imaging. Per monitorare i topi infetti da BIRFLU, radersi il petto per migliorare il rilevamento del segnale bioluminescente.Una volta che i topi sono anestetizzati, utilizzare un ago calibro 22 per somministrare retrò orbitalmente 100 microlitri di substrato di Nluc luciferasi, diluito uno a 10 in PBS. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare gli animali nella camera di isolamento con il petto rivolto verso l'alto. Quindi, posizionare la camera di isolamento nello strumento di imaging, chiudere la porta e acquisire immagini.Dopo l'imaging, riportare i topi nelle loro gabbie e monitorarli fino a quando non si sono completamente ripresi. Utilizzare lo strumento di ROI del software di imaging per analizzare i dati di bioluminescenza acquisiti designando una regione di interesse e facendo clic su misura. Per eseguire l'imaging ex vivo dei polmoni del topo, raccogliere i polmoni in base alle direzioni del manoscritto, avviare il software di acquisizione delle immagini e impostare i parametri per l'imaging.Una volta inizializzata la macchina, posizionare i polmoni in un vassoio di sfondo nero e assicurarsi che i tessuti siano separati l'uno dall'altro. Introdurre il vassoio nell'imager, chiudere la porta e acquisire immagini. Dopo l'imaging, rimuovere immediatamente i tessuti e conservarli sul ghiaccio a quattro gradi Celsius se i campioni verranno elaborati lo stesso giorno.Se verranno elaborati in seguito, congelarli rapidamente in un tubo su ghiaccio secco e conservarli a 80 gradi Celsius. Per elaborare le immagini, selezionare lo strumento ROI, disegnare le aree di interesse attorno a ciascuno dei singoli polmoni e fare clic su misura. BIRFLU è stato caratterizzato in vitro determinando i livelli di espressione di Venere, Nluc e NP nelle cellule infette.L'espressione di Venere e Nluc viene rilevata solo nelle cellule infettate da BIRFLU, mentre l'NP è espresso sia in cellule di tipo selvatico PR8 che in cellule infettate da BIRFLU. Nessuna espressione è osservata nelle cellule finte infette. Inoltre, l'attività di Nluc è stata misurata in supernanti di coltura tissutale a 24, 48, 72 e 96 ore dopo l'infezione.Viene rilevato già 24 ore dopo l'infezione e i livelli di espressione aumentano a 96 ore. Si può anche dimostrare che la cinetica di replicazione di BIRFLU è paragonabile al virus PR8 di tipo selvatico. BIRFLU ha la capacità di esprimere geni reporter sia fluorescenti che bioluminescenti, e la correlazione tra i due può essere valutata utilizzando l'imaging in vivo ed ex vivo di un polmone di topo.I polmoni dei topi infetti da BIRFLU mostrarono un'alta bioluminescenza in vivo e fluorescenza ex vivo. Sono stati inoltre determinati tatri virali e stabilità genetica di BIRFLU in vivo. Test di placca sui virus dei polmoni del topo hanno dimostrato che il virus può formare placche ed esprimere entrambi i geni reporter.BIRFLU potrebbe anche essere utilizzato per valutare l'efficacia degli anticorpi antivirali e neutralizzanti contro l'influenza. L'output di questi saggi era tutto correlato tra loro e sono veloci e facili da fare.

Research

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Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

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Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

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