Name: a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection at JoVE.com

Forskning på influensa virus i LM-S laboratorium er delvis finansiert av The New York influensa Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), et medlem av NIAID Centers of Excellence for influensa forskning og overvåkning (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) og ved Department of Defense (DoD) peer anmeldt Medical Research program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Forskere har basert på rekombinant reporter-uttrykker virus som Vital molekylær verktøy for å forstå og utvide på den nåværende forståelsen av viral replikering og patogenesen26,27,28, 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. de mest favoriserte reporter gener er luciferases og fluorescerende proteiner, hovedsakelig på grunn av den teknologiske fremskritt i deres identifisering, utvikling av forbedrede varianter, og deteksjon av imaging teknologier43 , 44 for alle , 45 for alle , 46 for alle , 47 for alle , 48. rekombinant reporter virus brukes ofte til å akselerere virological analyser, studere dynamikken i virus in vitro og in vivo, og for å teste effektiviteten av nå godkjent eller ny vaksine og terapeutiske tilnærminger26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40, 41,54. Dessverre, i tilfelle av IAV, var tidligere studier begrenset til uttrykk for et enkelt reporter gen, som hindrer den type studie som kan gjennomføres 26,27,28,29 , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. for å unngå denne begrensningen, har vi generert en replikering-kompetent bi-reporter IAV som uttrykker en Nluc luciferase og en Venus fluorescerende PROTEIN (BIRFLU).
I denne rapporten beskriver vi in vitro karakterisering av BIRFLU og de eksperimentelle tilnærminger for å bruke BIRFLU å spore viral infeksjon i vivo ved hjelp av en mus modell av IAV infeksjon. BIRFLU Nluc og Venus uttrykk korrelert med viral titers. I tillegg forble BIRFLU stabil og fortsatte å uttrykke begge reporter gener etter å ha blitt utvunnet fra lungene av infiserte mus. Denne tilnærmingen gir forskere en utmerket mulighet til å studere IAV i kulturperler celler og i dyremodeller, inkludert identifisering og utvikle nye terapeutiske alternativer for behandling av IAV infeksjoner.
Selv om BIRFLU har blitt generert ved hjelp av ryggraden i PR8, andre rekombinant IAV bruke annen type, under type eller viral belastning infrastruktur kan bli generert ved hjelp av samme eksperimentelle tilnærming. På samme måte, i denne rapporten beskrev vi de eksperimentelle prosedyrene for bruk av BIRFLU i en musemodell av IAV. Imidlertid kan BIRFLU være en verdifull teknologi for å evaluere IAV-smitte i andre dyremodeller.

Influensa et virus (IAV) er en innhyllet enkelt-strandet negativ-Sense segmentert RNA virus av Orthomyxoviridae familien1,2,3. Verdenshelseorganisasjon (WHO) anslår 3-5 millioner årlige influensa tilfeller og over 250 000 dødsfall fra influensa Worldwide4,5,6. Grupper som er spesielt sårbare for influensa inkluderer eldre, immunsupprimerte individer, og barn7,8,9,10,11. Selv om vaksiner er tilgjengelige og representerer den mest vanlige og effektive intervensjon mot viral infeksjon, er IAV i stand til raskt å utvikle og unnslippe eksisterende immunitet3,12,13, 14 priser og priser , 15. re-fremveksten av en pandemi H1N1 belastning i 2009 og fremveksten av patogene IAV gjentar den konstante trusselen mot menneskelig folkehelse over hele verden4,16.
Under en epidemi eller pandemi, er det avgjørende å raskt bestemme patogenitet og transmissibility av nylig isolerte virus. For tiden tilgjengelige teknikker for å oppdage viruset er tidkrevende og noen ganger krever bruk av arbeidskrevende tilnærminger, som kan forsinke gjennomføringen av disse analysene17,18,19,20. Videre presenterer viral analyser er vanskelig å skalere opp, noe som kan være nødvendig i tilfelle av et utbrudd. Til slutt, bruken av godkjent dyr modeller av infeksjon, som mus, Guinea Pigs og oppspore er rutinemessig anvendt og er livsviktig inne studere influensa infeksjon, immun svar, og effekten av ny vaksiner og/eller antivirale midler. Men disse modellene er restriktive på grunn av manglende evne til å observere viral dynamikk i sanntid; Dette begrenser studiene til statisk bildebehandling av virusinfeksjoner21,22,23,24,25. Dyr som brukes i disse analysene er også euthanized for å fastslå viral belastning, og dermed øke antall dyr som kreves for å fullføre disse studiene26. For å omgå alle disse begrensningene, mange forskere stole på bruk av rekombinant replikering-kompetente, reporter-uttrykker IAVs, som er i stand til å akselerere virological analyser og oppdage viral belastning og formidling in vivo i sanntid26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Viktigere er disse reporter-uttrykker IAVs er i stand til å gjenskape på samme måte som ville-type (WT) IAVs i cellekultur og i dyremodeller av infeksjon33,42.
Fluorescerende og Puerto Mosquito proteiner er to reporter systemer som vanligvis brukes av forskere på grunn av deres følsomhet, stabilitet og brukervennlighet. I tillegg er det enorm støtte og avansement i fluorescerende og Puerto Mosquito protein deteksjon teknologier43,44,45,46,47,48 . Fluorescerende proteiner og luciferase har ulike egenskaper som tillater dem å gløde, spesielt forskjellige i hvordan glade stater er generert og hvordan utstråling oppdages43,44,45, 46,47,48. Fluorescerende proteiner er først begeistret av å absorbere energi, som senere frigjøres som lys på en annen bølgelengde når molekylene reduseres til en lavere energi tilstand43. På den annen side er bioluminesens avledet fra en kjemisk eksoterm reaksjon som involverer et substrat, oksygen, og noen ganger ATP for å produsere lys45. På grunn av de varierende egenskapene til disse to typer reporter proteiner, en kanskje mer fordelaktig enn de andre, avhengig av studiet av interesse. Mens fluorescerende proteiner er mye brukt til å observere mobilnettet lokalisering28,41, deres in vivo-signaler har utilstrekkelig intensitet og er ofte skjult av autofluorescence i live vev49. Derfor forskere stole på luciferases å evaluere viral dynamikk i levende organismer, selv om fluorescerende proteiner kan foretrekkes for ex vivo studier50,51,52,53. I motsetning til fluorescerende proteiner er luciferases mer praktisk for in vivo-studier og mer gjeldende i ikke-invasive tilnærminger26,27,28,29,30 , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34 for alle , 35 for alle , 36 for alle , 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 54. til syvende og sist, basert på type studier, må forskerne velge mellom bruk av enten et fluorescerende eller en luciferase reporter protein som sin avlesning, som fagene sine studier til en trade-off av funksjonalitet og følsomhet, og alvorlig begrenser nytten av rekombinant reporter virus. Videre er det bekymringer om sammenhengen mellom uttrykk for ulike reporter gener ved hjelp av fluorescens eller luciferase systemer og viral replikering eller formidling, som kan utgjøre en skade på tolkningen av data innhentet med reporter-uttrykker IAVs.
Vi har overvunnet denne begrensningen ved å generere en rekombinant replikering-kompetente bi-reporter IAV (BIRFLU) som koder for både et fluorescerende og en luciferase protein i samme viral Genova55 (figur 1). Her, NanoLuc luciferase (Nluc), en liten og lys Puerto Mosquito protein48, ble satt inn oppstrøms av hemagglutinin (ha) sekvensen i viral ha segmentet av influensa a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. I tillegg ble Venus, et hyppig brukt monomere fluorescerende protein, satt inn i den ikke-strukturelle (ns) viral segment32,33,36,41,55. Siden BIRFLU koder for både fluorescerende og luciferase reporter gener, kan enten reporter protein signal brukes som avlesning for å bestemme viral replikering og formidling in vitro eller in vivo55. Ytterligere informasjon om generering og in vitro eller in vivo karakterisering av BIRFLU finnes i vår siste utgivelse55. BIRFLU kan brukes til å teste effekten av antivirale medikamenter eller nøytralisere antistoffer via en roman fluorescerende-og Puerto Mosquito-basert microneutralization-analysen55. Videre kan BIRFLU også brukes til å evaluere viral dynamikk i en mus modell av infeksjon55. I dette manuskriptet beskriver vi prosedyrene for å karakterisere BIRFLU55 in vitro og hvordan man studerer BIRFLU-smitte hos mus med in vivo luminescence Imaging Systems for påvisning av Nluc in vivo eller Venus ex vivo.
Kombinasjonen av cutting-edge teknikker i molekylærbiologi, dyr forskning og Imaging teknologier, bringer forskere en unik mulighet til å bruke BIRFLU for IAV forskning, inkludert studiet av virus-vert interaksjoner, dynamikken i viral infeksjon; utviklingen av romanen vaksine tilnærminger for terapeutisk behandling av IAV infeksjoner eller den potensielle bruken av IAV som en vaksine vektor for behandling av andre patogen infeksjoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS4</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>This software is used in 3.1.10 and 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Albumin solution (BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Store at 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture dishes 100mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used in 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C581-100</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7722-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five- to seven-week-old female BALB/c mice</td>
			<td>National Cancer Institute (NCI)</td>
			<td>555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 Motorized Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 4.7.2 software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumicount</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>H16-L10-4R5</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin 10%</td>
			<td>EMD</td>
			<td>65346-85</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-00-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 20000R Fast1394 Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-075-150</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vmax Kinetic plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection

Influensa A virus (IAVs) forårsake menneskelige luftveissykdommer som er forbundet med betydelige helsemessige og økonomiske konsekvenser. Som med andre virus, studere IAV krever bruk av arbeidskrevende sekundære tilnærminger for å oppdage tilstedeværelsen av viruset i infiserte celler og/eller i dyremodeller av smitte. Denne begrensningen har nylig blitt omgås med generering av rekombinant IAVs uttrykke lett sporbare fluorescerende eller Puerto Mosquito (luciferase) reporter proteiner. Imidlertid, forskning ha blitt tvunget å velge fluorescerende eller luciferase reporteren gener på grunn av det innskrenket behandlingskapasitet av det IAV Genova for inkluderer utenlandsk sekvenser. For å overvinne denne begrensningen, har vi generert en rekombinant replikering-kompetente bi-reporter IAV (BIRFLU) stabilt uttrykker både et fluorescerende og en luciferase reporter genet å enkelt spore IAV infeksjoner in vitro og in vivo. For dette formål, viral ikke-strukturell (NS) og hemagglutinin (HA) viral segmenter av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) ble modifisert til å kode fluorescerende Venus og Puerto Mosquito Nanoluc luciferase proteiner, henholdsvis. Her beskriver vi bruken av BIRFLU i en musemodell av IAV-smitte og påvisning av begge reporter gener ved hjelp av en in vivo Imaging system. Spesielt har vi observert en god sammenheng mellom uttrykk for både journalister og viral replikering. Kombinasjonen av cutting-edge teknikker i molekylærbiologi, dyr forskning og Imaging teknologi, gir forskerne en unik mulighet til å bruke dette verktøyet for influensa forskning, inkludert studiet av virus-vert interaksjoner og dynamikken i virusinfeksjoner. Viktigere, muligheten til genetisk endre viral Genova til å uttrykke to utenlandske gener fra ulike viral segmenter åpner opp muligheter til å bruke denne tilnærmingen for: (i) utviklingen av romanen IAV vaksiner, (II) generering av rekombinant IAVs som kan brukes som vaksine vektorer for behandling av andre menneskelige patogen infeksjoner.

Generering og karakterisering av BIRFLU in vitro (figur 1 og figur 2)
En rekombinant replikering-kompetent IAV uttrykker to forskjellige reporter gener (BIRFLU) ble bygget ved hjelp av State of the art molekylærbiologi og plasmider omvendt genetikk teknikker (figur 1). Her valgte vi å bruke Nluc på grunn av flere fordeler fremfor andre luciferases, inkludert den lille størrelsen, ATP-uavhengighet, større intensitet, og optimalisert substrat48,60. Nluc ble klonet i HA segmentet av IAV PR8 etterfulgt av svin teschovirus (PTV) 2A kløft nettsted (2A) foran den åpne lese rammen (ORF) av HA (figur 1). Den ORF av HA inkludert tause mutasjoner å fjerne den opprinnelige pakking signaler og unngå mulige rekombinasjon. Den komplette HA emballasjen signalet ble lagt foran Nluc å tillate riktig innlemmelse av modifisert HA segmentet i virionet og Nluc og HA uttrykk fra samme viral RNA segmentet (figur 1). I tillegg ble det fluorescerende proteinet Venus klonet til en modifisert IAV PR8 NS segment som koder de to virale proteiner NS1 og NEP fra en enkelt transkripsjon32,36,41,54, i 57. For dette formål ble Venus smeltet til C-terminalen på NS1, og hele NEP ORF ble klonet nedstrøms for området PTV 2A kløft som ble plassert mellom NS1-Venus og NEP sekvenser (figur 1). Til syvende og sist, disse to modifiserte HA og NS viral plasmider konstruksjoner ble brukt i kombinasjon med resten av IAV PR8 Reverse genetikk plasmider å generere BIRFLU (figur 1). In vitro og in vivo karakterisering av BIRFLU har blitt beskrevet tidligere55.
I figur 2, karakterisert vi in vitro BIRFLU ved å fastsette Venus, Nluc, og np uttrykks nivåer ved hjelp av fluorescens og indirekte immunofluorescence tilnærminger (figur 2a, B). Confluent monolagere av MDCK-celler var enten uekte-infiserte eller infiserte (MOI 0,1) med WT eller BIRFLU PR8 virus, og ved 18 timer etter infeksjon ble Venus-uttrykket direkte evaluert ved hjelp av fluorescens mikroskopi (figur 2a, B). Nluc (figur 2a) og np-uttrykket (figur 2b) ble brukt av indirekte immunofluorescence ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for hvert protein. Som forventet, Venus og Nluc uttrykk ble oppdaget bare i celler infisert av BIRFLU og ikke i celler infisert av WT PR8 virus. I tillegg indirekte immunofluorescence mikroskopi avdekket NP uttrykk i både WT og BIRFLU PR8-infiserte celler. Ingen uttrykk for Venus, Nluc eller NP ble påvist, som forventet, i uekte-infiserte celler (Figur A, B).
For å evaluere Nluc uttrykks nivåer in vitro, var MDCK-celler smittet (MOI 0,001) med WT eller BIRFLU PR8 virus og Nluc aktivitet i vevs kultur supernatanter ble vurdert ved 24, 48, 72 og 96 h post-smitte (figur 2C). Bare Nluc aktivitet ble påvist i vev kultur supernatanter av MDCK celler infisert med BIRFLU (figur 2C). Nluc aktivitet i vevet kulturen supernatanter ble oppdaget så tidlig som 24 h post-smitte med høyere uttrykk nivåer på 96 h post-smitte, mest sannsynlig fordi Cytopathic effekt (CPE) indusert under viral infeksjon løslate Nluc protein beholdt inn i cellen. Å evaluere egnethet av BIRFLU i kulturperler celler, vekst Kinetics av WT og BIRFLU PR8 virus ble også evaluert (figur 2D) og tilstedeværelsen av smittsomme virus i vev kultur supernatanter ble bestemt av immun-fokus-analysen (figur 2D ). BIRFLU rep like Rings Kinetics var merkbart sammenlignbare med de av WT PR8 virus, men BIRFLU replikering ble litt forsinket og nådde ikke samme virale titers som WT PR8. Imidlertid, BIRFLU var kjøpedyktig rekkevidde titers av 5 x 107 PFU/ml (skikkelsen 2D), angir det gjengivelsen av to reporteren gener inne det viral Genova er ikke viktig blande inn BIRFLU replikering inne MDCK celler.
Sporing BIRFLU infeksjon i mus (Figur 3 og Figur 4)
Figur 3 er et skjematisk flytskjema for vurdering av BIRFLU dynamikk i en musemodell av IAV infeksjon. Fem-til-sju-ukers-gamle kvinnelige BALB/C mus var enten mock-smittet med 1x PBS eller infisert med 1 x 106 PFU av BIRFLU intranasalt. På 3 dager etter infeksjon, mus ble anesthetized med isoflurane og deretter injisert med Nluc substrat retro-orbitally. Alle mus ble umiddelbart plassert i IVIS instrumentet og Nluc signal ble vurdert i vivo ved hjelp av IVIS. Deretter ble mus euthanized og lungene ble høstet. Excised lungene ble deretter analysert ex vivo bruker in vivo imager å bestemme fluorescens intensitet via Venus uttrykk. Til slutt, mus lungene var homogenisert, og viral titers og stabilitet ble bestemt av plakk analysen. Plakk ble vurdert av den direkte fluorescens av Venus, ved immunostaining ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for Nluc og av krystall fiolett farging.
Tidligere beskrevet replikering-kompetent reporter-uttrykker IAVs uttrykke en enkelt reporter genet, oftest enten en fluorescerende eller en Puerto Mosquito protein, som surrogat for viral infeksjon og replikering. Men BIRFLU, er i stand til å uttrykke begge typer reporter gener ved viral infeksjon. For å vurdere sammenhengen mellom bioluminesens (in vivo Imaging) og fluorescens (ex vivo Imaging) etter BIRFLU infeksjon, var fem til syv uker gamle kvinnelige BALB/c-mus uekte-infisert med 1x PBS eller inokulert med BIRFLU (106 PFU) intranasalt . Nluc aktivitet (figur 4a) ble evaluert ved administrering av Nluc substrat injisert retro-orbitally på 3 dager etter infeksjon ved hjelp av en in vivo Imaging instrument. Vi valgte å evaluere bioluminesens på dag 3 fordi tidligere studier indikerte at IAV replikering, inkludert PR8, topper mellom dager 2 og 4 etter infeksjon24,54. Bioluminesens ble overvåket (figur 4a, topp) og brukes til å beregne gjennomsnittlig total Flux (Flux (Logg10 p/s) (figur 4a, bunn). Som spådd, mus inokulert med BIRFLU vist høy bioluminesens aktivitet, men ingen signal ble oppdaget i uekte-infiserte mus. Deretter ble lungene av infiserte mus høstet og Venus uttrykk ble vurdert ved hjelp av ex vivo Imaging (figur 4b, topp). Videre ble fluorescens gjennomsnittlige stråle effektivitet beregnet (figur 4b, bunn). De excised musene lungene ble også homogenisert for å bestemme viral titers og genetisk stabilitet av BIRFLU in vivo (figur 4c, D). Genetisk stabilitet av BIRFLU ble analysert gjennom plakk analysen ved hjelp av virus isolert fra mus lungene og fluorescerende mikroskopi (Venus, topp), immunostaining (Nluc, midten) og krystall fiolett farging (nederst). BIRFLU utvinnes fra mus lungene var i stand til å danne plaketter og stabilt uttrykker begge reporter gener (figur 4c). Spesielt observerte vi en god korrelasjon mellom bioluminesens og fluorescens signaler med viral replikering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk fremstilling av IAV PR8 WT-og BIRFLU-virionet struktur og områder. IAV er omgitt av en lipid bilayer som inneholder de to store viral glykoproteiner hemagglutinin (HA; svart) og neuraminidase (NA; blå). IAV inneholder åtte enkelt-strandet, negativ-Sense, RNA segmenter (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, og NS). Hver viral segmentet inneholder ikke-koding regioner (NCR) på 3 ' og 5 ' ender (svart bokser). Også på 3 ' og 5 ' slutten av viral (v) RNAs er emballasjen signaler, ansvarlig for effektiv encapsidation av vRNAs til begynnende virions (hvite bokser). IAV PR8 HA og NS viral segmenter og produkter er angitt i svart. Sekvenser av Nluc, Venus, og PTV 2A er angitt i rødt, grønt og stripete bokser, henholdsvis. Den Skjematisk representasjon av endret HA og NS segmenter uttrykker Nluc og Venus, henholdsvis i BIRFLU er også indikert. Dette tallet er tilpasset fra Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Figur 2: in vitro karakterisering av BIRFLU. (A, B) Analyse av protein uttrykk ved direkte fluorescens og immunofluorescence. MDCK celler var uekte-infiserte eller infiserte (MOI 0,1) med PR8 WT eller BIRFLU virus. Infiserte celler ble fast ved 18 h post-smitte å direkte visualisere Venus uttrykk ved direkte fluorescerende mikroskopi og å visualisere Nluc (A) og viral np (B) uttrykk ved hjelp av spesifikke antistoffer og indirekte immunofluorescence. Kjerner ble farget med DAPI. Representative bilder (20x forstørrelse) vises. Skala stolper = 100 μm. (C, D) Vekst Kinetics av PR8 WT og BIRFLU. Nluc aktivitet (C) og viral titers (D) i VEV kultur supernatanter fra MDCK celler smittet (Moi 0,001) med WT og BIRFLU PR8 virus ble vurdert på angitte tidspunkter etter infeksjon. Data representerer midlene ± SD av triplicates. Viral titers ble bestemt av immun-Focus-analysen (FFU/mL). Prikket linje angir grensen for påvisning (200 FFU/ml). Dette tallet er tilpasset fra Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Figur 3: skjematisk representasjon for studiet av BIRFLU i mus. Uttrykk for Nluc og Venus reporter gener ble evaluert hos mus infisert med 1 x 106 PFU av BIRFLU bruker in vivo eller ex vivo Imaging. Kort, på dag 1, 5 til 7 uke gamle kvinnelige BALB/c mus var uekte-smittet (1x PBS) eller inokulert med 1 x 106 PFU av BIRFLU intranasalt. Ved dag 3 post-smitte, mus var mildt anesthetized bruker isoflurane og Nluc substrat ble injisert retro-orbitally. Nluc signalet ble direkte vurdert ved hjelp av in vivo Imaging. Umiddelbart etter avbildning ble musene euthanized og uttrykk for Venus i hele excised lunger ble analysert ved hjelp av ex vivo Imaging. Gjenopprettede mus lungene var homogenisert å evaluere viral replikering og stabilitet ved plakk analysen. Piler indikerer korrelasjon mellom fluorescens (Venus), immunostaining (Nluc) og krystall fiolett farging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Figur 4: in vivo bioluminesens og fluorescens uttrykk. Kvinner fem-til-sju-ukers-gamle BALB/c mus var uekte-infiserte (1x PBS) eller inokulert med 1 x 106 PFU av BIRFLU intranasalt. På dag 3 post-smitte, Nluc aktivitet (A) i hele musen ble bestemt. Representative bilder av en enkelt mus som viser stråleglans skala (p/sek/cm2/SR). Bioluminesens stråleglans verdier ble quantitated og den gjennomsnittlige totale Flux vises (Flux (log10 p/s). Etter Nluc avbildning ble lungene høstet for ex vivo Imaging (B). Representative bilder fra hele lungene vises. For å kvantifisere Venus uttrykk, gjennomsnittlig verdier av regioner av interesse (ROIs) ble normalisert til lunge Auto-fluorescens fra uekte-infiserte mus og fold endringer ble beregnet. Å analysere genetisk stabilitet av BIRFLU in vivo, virus utvinnes fra mus lungene ble analysert av plakk analysen ved hjelp av fluorescerende mikroskopi (Venus, topp), immunostaining (Nluc, midten) og krystall fiolett farging (nederst) (C). Representative bilder fra én mus vises. For å evaluere virus replikering, hele lungene var homogenisert etter tenkelig og brukes til å infisere MDCK celler og bestemme viral titers av plakk analysen (PFU/mL) (D). Piler angir korrelasjon mellom fluorescens (Venus), immunostaining (Nluc) og krystall fiolett farging. Barer representerer gjennomsnittlig ± SD av lunge virus titers. Dette tallet er tilpasset fra Logales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Vev kultur Media og løsninger</td>
			<td>Sammensetning</td>
			<td>Lagring</td>
			<td>Bruke</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Vev kultur medier: Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM), 10% fosterets storfe serum (FBS), 1% penicillin-Streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 mL FBS og 5 mL på 100% mer</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Vedlikehold av MDCK-celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Post-infeksjon medier: DMEM 0,3% av storfe ALBUMIN (ba), 1% PSG (DMEM 0,3% ba 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml på 35% BA og 5 ml med 100 prosent</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Vedlikehold av MDCK celler etter viral infeksjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x, fosfat bufret saltvann (PBS)</td>
			<td>80 g av NaCl, 2 g av KCl, 11,5 g av na2HPO4. 7H2O, 2 g av KH2PO4. Legg til ddH2O opptil 1 L. Juster pH til 7,3</td>
			<td>Romtemperatur</td>
			<td>Slik klargjør du 1x PBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>Fortynne 10x PBS med ddH2O</td>
			<td>Romtemperatur</td>
			<td>Vask celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Infeksjon Media: 1x PBS, 0,3% ba, 1% penicillin-STREPTOMYCIN (PS) (PBS/ba/PS).</td>
			<td>487 mL 1x PBS steril, 4,2 mL på 35% BA og 5 ml 100 x 1% PS (100 U/mL)</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Virusinfeksjoner</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Fiksering/permeabilization løsning: 4% formaldehyd, 0,5% Triton X-100 fortynnet i 1x PBS.</td>
			<td>400 mL nøytral bufret formalin 10%, 5 ml Triton X-100 og 595 mL 1x PBS</td>
			<td>Romtemperatur</td>
			<td>Fix og permeabilization av MDCK celler.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Blokkering løsning: 2,5% storfe serum ALBUMIN (BSA) i 1x PBS.</td>
			<td>2,5 g av BSA i 97,5 mL 1x PBS</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Blokkerings løsning for immunofluorescence og plakk analyser.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fortynning av antistoff oppløsning (1% BSA i 1x PBS)</td>
			<td>1 g BSA i 99 mL 1x PBS</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Fortynning av primære og sekundære antistoffer.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% krystall fiolett oppløsning</td>
			<td>1 g krystall fiolett i 400 mL av metanol. Tilsett 600 ml ddH2O</td>
			<td>Romtemperatur</td>
			<td>Farging av MDCK celler i plakk analyser.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl keton (TPCK)-behandlet Trypsin</td>
			<td>Forbered en 1, 000x lagerløsning på 1 mg/mL i ddH2O</td>
			<td>-20 ° c</td>
			<td>For virusinfeksjoner.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: vevs kultur medier og løsninger.

Watch this Scientific Journal Video about A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection at JoVE.com

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

En luciferase-fluorescerende reporter influensa virus for Live Imaging og kvantifisering av viral infeksjon

Influensa A virus (IAVs) er smittsom respiratoriske patogener som forårsaker årlige epidemier og sporadisk pandemier. Her beskriver vi en protokoll for å spore virale infeksjoner i vivo ved hjelp av en roman rekombinant luciferase og fluorescens-uttrykker bi-reporter IAV (BIRFLU). Denne tilnærmingen gir forskere et utmerket verktøy for å studere IAV in vivo.

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Forskere har tidligere generert rekombinante influensavirus som uttrykker enten fluorescerende eller bioluminescerende proteinreportere. En del av vårt eneste uttrykk for reportergener i influensavirus begrenser bruken i eksperimenter alvorlig. Vår protokoll beskriver bruken av bireporter influensavirus som uttrykker både fluoriserende og bioluminescerende reportergener, og derfor overgår begrensningen.Den største fordelen med denne teknikken er bruk av et enkelt rekombinant influensavirus for in vitro- og in vivo-studier. Når du utfører denne teknikken, er rask injeksjon av luciferase substrat og riktig planlegging av mushåndtering viktig, fordi substratet raskt metaboliseres. Også barbering av mus anbefales å forbedre påvisning av bioluminescerende signal.For å infisere musene, start med å forberede BIRFLU i 1X PBS. Opprettholde viruset på is til inokulasjon. Kontroller for fraværet av tåklemmerefleksen for å sikre at musen er bedøvet, og inokuler den intranasalt med forberedt BIRFLU-fortynning.Sørg for at alle mus puster riktig før de returnerer dem til burene sine. Åpne bildeprogramvaren og trykk initialiser, og angi deretter parameterne som skal brukes til avbildningen. For å overvåke musene som er infisert med BIRFLU, barber brystet for å forbedre påvisning av bioluminescerende signal.Når musene er bedøvet, bruk en 22 gauge nål til retro-orbitalt administrere 100 mikroliter av Nluc luciferase substrat, fortynnet en til 10 i PBS. Umiddelbart etter injeksjon, plasser dyrene i isolasjonskammeret med brystet vendt opp. Deretter plasserer du isolasjonskammeret i bildeinstrumentet, lukker døren og skaffer bilder.Etter avbildning, returner musene til burene sine og overvåk dem til de er helt gjenopprettet. Bruk verktøyet for bildebehandlingsprogramvare til å analysere de anskaffede bioluminescensdataene ved å angi et interesseområde og klikkemål. For å utføre ex vivo avbildning av muselunger, samle lungene i henhold til manuskriptet retninger, starte bildet oppkjøpet programvare, og sette parametrene for bildebehandling.Når maskinen er initialisert, legg lungene i en svart bakgrunnsskuff, og sørg for at vevet er skilt fra hverandre. Introdder skuffen i bildeleren, lukk døren og hent bilder. Etter avbildning, fjern vevet umiddelbart og lagre dem på is ved fire grader Celsius hvis prøvene vil bli behandlet på samme dag.Hvis de vil bli behandlet senere, fryse dem raskt i et rør på tørris, og lagre dem på 80 grader Celsius. Hvis du vil behandle bildene, velger du roi-verktøyet, tegner interesseområder rundt hver av de enkelte lungene og klikker mål. BIRFLU har blitt karakterisert in vitro ved å bestemme Venus, Nluc og NP uttrykk nivåer i infiserte celler.Venus og Nluc uttrykk oppdages bare i celler infisert av BIRFLU, mens NP uttrykkes i både villtype PR8 og BIRFLU-infiserte celler. Ingen uttrykk observeres i mock-infiserte celler. Videre har Nluc aktivitet blitt målt i vev kultur supernatanter på 24, 48, 72, og 96 timer etter infeksjon.Det oppdages så tidlig som 24 timer etter infeksjon, og uttrykksnivåene øker på 96 timer. Det kan også demonstreres at replikering kinetikk av BIRFLU er sammenlignbare med wild-type PR8 virus. BIRFLU har evnen til å uttrykke både fluorescerende og bioluminescerende reportergener, og korrelasjonen mellom de to kan vurderes ved hjelp av in vivo og ex vivo avbildning av en muselunge.Lungene til mus infisert med BIRFLU viste høy bioluminescens in vivo og fluorescens ex vivo. Viral titers og genetisk stabilitet av BIRFLU in vivo er også bestemt. Plakkanalyser på virusene fra muselunger viste at viruset kan danne plakk og uttrykke begge reportergenene.BIRFLU kan også brukes til å evaluere effektiviteten av antivirale og nøytraliserende antistoffer mot influensa. Utgangen fra disse analysene var alle korrelert med hverandre og er raske og enkle å gjøre.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influensa A virus Detection og isolering mot svine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Demontering av influensa A virus kapsider ved gradientsentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling av Influensa neuraminidase Inhibering antistofftitere ved enzym-bundet lektin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserte Neuraminidase inhiberingsanalyse for å vurdere i hvilken grad influensavirus til neuraminidase Inhibitor Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influensa A Virus studier i en musemodell av infeksjon

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generasjon av Escape varianter av nøytralisere influensa Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Bildebehandling celle interaksjon i Tracheal Mucosa under influensa Virus smitte med to-fotonet Intravital mikroskopi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levende avbildning og kvantifisering av virusinfeksjon hos K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av Reporter-Expressing Rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...