Name: a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection at JoVE.com

Forskning om influensavirus i LM-S laboratorium är delvis finansierat av New York influensa Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), en medlem av NIAID Centers of Excellence för influensaforskning och övervakning (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) och av försvarsdepartementet (DoD) peer reviewed medicinsk forskning program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.

Författarna har inget att avslöja.

Forskare har förlitat sig på rekombinanta reporter-uttrycker virus som vitala molekylära verktyg för att förstå och expandera på den nuvarande förståelsen av viral replikering och patogenes26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. de mest gynnade reportern gener är luciferases och fluorescerande proteiner, främst på grund av de tekniska framstegen i identifieringen, utveckling av förbättrade varianter, och detektering av imaging Technologies43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. rekombinanta reporter virus används ofta för att påskynda virologiska analyser, studera dynamiken av virus in vitro och in vivo, och för att testa effekten av nuvarande godkända eller nya vaccin och terapeutiska metoder26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Tyvärr, i fallet med iav, tidigare studier begränsades till uttrycket av en enda reporter gen, som hindrar den typ av studie som skulle kunna genomföras 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. för att undvika denna begränsning har vi genererat en replikerad bi-reporter iav som uttrycker en nluc luciferas och ett Venus fluorescerande protein (birflu).
I denna rapport beskriver vi in vitro-karakterisering av BIRFLU och experimentella metoder för att använda BIRFLU för att spåra virusinfektion in vivo med hjälp av en musmodell av IAV-infektion. BIRFLU Nluc och Venus uttryck korrelerade med virala titrar. Dessutom förblev BIRFLU stabil och fortsatte att uttrycka båda reportern gener efter att ha återhämtat sig från lungorna av infekterade möss. Detta tillvägagångssätt ger forskarna ett utmärkt tillfälle att studera IAV i odlade celler och i djurmodeller, inklusive identifiering och utveckling av nya terapeutiska alternativ för behandling av IAV-infektioner.
Även om BIRFLU har genererats med ryggraden i PR8, kan andra rekombinanta IAV med olika typ, subtyp eller virusstam stamnät genereras med hjälp av samma experimentella tillvägagångssätt. Likaså beskrev vi i denna rapport de experimentella förfarandena för användning av BIRFLU i en musmodell av IAV. BIRFLU kan dock vara en värdefull teknik för att utvärdera IAV-infektion i andra djurmodeller.

Influensavirus (IAV) är ett insvept, enkelsträngat, negativt segmenterat RNA-virus av Orthomyxoviridae -familjen1,2,3. Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattar 3-5 miljoner årliga influensafall och över 250 000 dödsfall från influensa i världen4,5,6. Grupper som är särskilt utsatta för influensa inkluderar äldre, immunokomprometterade individer, och barn7,8,9,10,11. Även vacciner finns tillgängliga och utgör den vanligaste och mest effektiva ingripande mot virusinfektion, iav kan snabbt utvecklas och undkomma redan existerande immunitet3,12,13, fjorton , 15. återkomsten av en pandemi H1N1 stam i 2009 och uppkomsten av patogena iav upprepar det ständiga hotet mot människors folkhälsa i hela världen4,16.
Under en epidemi eller pandemi är det viktigt att snabbt fastställa patogenicitet och överförbarhet av nyligen isolerade virus. För närvarande tillgängliga tekniker för att upptäcka viruset är tidskrävande och ibland kräver användning av mödosamma metoder, vilket kan fördröja slutförandet av dessa analyser17,18,19,20. Dessutom är det svårt att skala upp nuvarande virus analyser, vilket kan vara nödvändigt vid ett utbrott. Slutligen, användningen av validerade djurmodeller av infektion, såsom möss, marsvin och illrar används rutinmässigt och är avgörande för att studera influensainfektioner, immunsvar, och effekten av nya vacciner och/eller antivirala läkemedel. Dessa modeller är dock restriktiva på grund av oförmåga att observera viral dynamik i realtid; Detta begränsarstudierna till statisk avbildning av virusinfektioner21,22,23,24,25. Djur som används i dessa analyser är också euthanized för att fastställa virusbelastningen, vilket ökar antalet djur som krävs för att slutföra dessa studier26. För att kringgå alla dessa begränsningar, många forskare förlitar sig på användning av rekombinant replikering-kompetenta, reporter-uttrycker IAVs, som kan påskynda virologiska analyser och upptäcka virusbelastning och spridning in vivo i realtid26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Viktigare, dessa reporter-uttrycker iAVS är kompetent att replikera på motsvarande sätt till Wild-Type (WT) iAVS i cellkultur och in djur modellerar av infektion33,42.
Fluorescerande och bioluminescerande proteiner är två reporter system som vanligen används av forskare på grund av deras känslighet, stabilitet och användarvänlighet. Dessutom finns det ett enormt stöd och avancemang i fluorescerande och bioluminescerande protein detektionstekniker43,44,45,46,47,48 . Fluorescerande proteiner och luciferas har olika egenskaper som gör att de kan glöda, särskilt olika i hur upphetsad stater genereras och hur mittancen detekteras43,44,45, 46,47,48. Fluorescerande proteiner är först upphetsad av absorberar energi, som därefter släpps som ljus på en annan våglängd som molekylerna minskar till ett lägre energitillstånd43. Å andra sidan, Mareld härstammar från en kemisk exoterm reaktion som innebär ett substrat, syre, och ibland ATP för att producera ljus45. På grund av de varierande egenskaperna hos dessa två typer av reporter proteiner, en kanske mer fördelaktigt än den andra beroende på studiet av intresse. Medan fluorescerande proteiner används ofta för att observera cellulära lokalisering28,41, deras in vivo-signaler har otillräcklig intensitet och är ofta skyms av autofluorescence i levande vävnader49. Därför förlitar sig forskarna på luciferaser för att utvärdera viral dynamik i levande organismer, även om fluorescerande proteiner kan föredras för ex vivo-studier50,51,52,53. Till skillnad från fluorescerande proteiner är luciferaser bekvämare för in vivo-studier och mer tillämpbara vid icke-invasiva metoder26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. i slutändan, baserat på vilken typ av studie, forskare måste välja mellan användning av antingen en fluorescerande eller en luciferas reporter protein som sin avläsning, som försökspersoner deras studie till en trade-off av funktioner och känslighet, och allvarligt begränsar nyttan av de rekombinanta reportern-virusen. Dessutom finns det farhågor om sambandet mellan uttrycket av olika rapportörer med fluorescens eller luciferas system och viral replikering eller spridning, vilket kan äventyra tolkningen av de uppgifter som erhållits med reporter-uttrycker IAVs.
Vi har övervunnit denna begränsning genom att generera en rekombinant replikerkompetent bi-reporter IAV (BIRFLU) som kodar för både fluorescerande och ett luciferasprotein i samma virala genom55 (figur 1). Här infördes nanoluc luciferas (nluc), en liten och ljus bioluminescerande protein48, uppströms hemagglutinin (ha) sekvens i viral ha segment av influensa a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Dessutom, Venus, en ofta använd monomeriska fluorescerande protein, sattes in i icke-strukturella (NS) viral segment32,33,36,41,55. Eftersom birflu kodar för både fluorescerande och luciferas reporter-gener, kan antingen reporter protein signal användas som avläsning för att bestämma viral replikation och spridning in vitro eller in vivo55. Ytterligare information om generering och in vitro-eller in vivo-karakterisering av BIRFLU finns i vår senaste publikation55. Birflu kan användas för att testa effektiviteten av antivirala läkemedel eller neutraliserande antikroppar via en roman fluorescerande-och Bioluminescent-baserade mikroneutraliseringstest assay55. Dessutom kan BIRFLU också användas för att utvärdera viral dynamik i en musmodell av infektion55. I detta manuskript beskriver vi procedurerna för att karakterisera birflu55 in vitro och hur man studerar birflu-infektion hos möss med hjälp av in vivo luminiscens Imaging Systems för detektion av nluc in vivo eller Venus ex vivo.
Kombinationen av banbrytande tekniker inom molekylärbiologi, djur forskning och bildteknik, ger forskarna en unik möjlighet att använda BIRFLU för IAV-forskning, inklusive studiet av virus-värdinteraktioner, dynamik av virusinfektion; utveckling av nya vaccin metoder för terapeutisk behandling av IAV-infektioner eller potentiell användning av IAV som vaccin vektor för behandling av andra patogena infektioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS4</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>This software is used in 3.1.10 and 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Albumin solution (BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Store at 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture dishes 100mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used in 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C581-100</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7722-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five- to seven-week-old female BALB/c mice</td>
			<td>National Cancer Institute (NCI)</td>
			<td>555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 Motorized Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 4.7.2 software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumicount</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>H16-L10-4R5</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin 10%</td>
			<td>EMD</td>
			<td>65346-85</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-00-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 20000R Fast1394 Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-075-150</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vmax Kinetic plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection

Influensavirus (iav) orsakar mänskliga luftvägssjukdomar som är förknippade med betydande hälso-och ekonomiska konsekvenser. Som med andra virus, studerar IAV kräver användning av mödosamma sekundära metoder för att upptäcka förekomsten av viruset i infekterade celler och/eller i djurmodeller av infektion. Denna begränsning har nyligen kringgås med generering av rekombinanta iAVS uttrycker lätt spåras fluorescerande eller bioluminescerande (luciferase) reporter proteiner. Emellertid, forskare har tvingats att välja fluorescerande eller luciferas reporter gener på grund av den begränsade kapaciteten hos iav genomet för att inkludera främmande sekvenser. För att övervinna denna begränsning, vi har genererat en rekombinant replikering kompetenta bi-reporter iav (birflu) stabilt uttrycker både en fluorescerande och en luciferas reporter gen för att enkelt spåra iav infektioner in vitro-och in vivo. I detta syfte ändrades de virala icke-strukturella (NS) och hemagglutinin (HA) virala segmenten av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) för att koda de fluorescerande Venus och de bioluminescerande Nanoluc luciferasproteinerna. Här beskriver vi användningen av BIRFLU i en musmodell av IAV-infektion och detektion av både rapportgener med hjälp av ett in vivo-bildbehandlings system. I synnerhet har vi observerat ett bra samband mellan uttrycken för både reportrar och viral replikering. Kombinationen av banbrytande tekniker inom molekylärbiologi, djur forskning och bildteknik, ger forskarna en unik möjlighet att använda detta verktyg för influensaforskning, inklusive studiet av virus-värdinteraktioner och dynamik av virusinfektioner. Det är viktigt att möjligheten att genetiskt förändra virusgenomet för att uttrycka två främmande gener från olika virala segment öppnar möjligheter att använda denna metod för: (i) utveckling av nya IAV-vacciner, (II) generering av rekombinanta IAVs- kan användas som vaccin vektorer för behandling av andra humana patogener infektioner.

Generering och karakterisering av BIRFLU in vitro (figur 1 och figur 2)
En rekombinant replikation-kompetent IAV uttrycker två olika reporter gener (BIRFLU) konstruerades med hjälp av State of the art molekylär biologi och plasmid-baserade omvänd genetik tekniker (figur 1). Här valde vi att använda nluc på grund av flera fördelar jämfört med andra luciferases, inklusive dess ringa storlek, ATP-självständighet, större intensitet, och optimerad substrat48,60. Nluc klonas i ha-segmentet av iav PR8 följt av svin teschovirus (PTV) 2a klyvning plats (2a) framför den öppna läsbild (ORF) av ha (figur 1). ORF av HA inkluderade tysta mutationer för att ta bort de ursprungliga förpacknings signalerna och undvika eventuell rekombination. Den kompletta ha-förpackningssignalen lades framför nluc för att möjliggöra en korrekt inkorporering av det modifierade ha-segmentet i spjälkat virus-och nluc-och ha-uttrycket från samma virala RNA-segment (figur 1). Dessutom var det fluorescerande proteinet Venus klonade i en modifierad iav PR8 ns segment som kodar de två virala proteiner ns1 och NEP från en enda utskrift32,36,41,54, 57. För detta ändamål var Venus smält till C-terminalen av NS1 och hela NEP ORF var klonade nedströms av PTV 2A klyvning plats som placerades mellan NS1-Venus och NEP sekvenser (figur 1). Ytterst, dessa två modifierade HA och NS viral plasmid konstruktioner användes i kombination med resten av IAV PR8 omvänd genetik plasmider att generera BIRFLU (figur 1). In vitro-och in vivo-karakteriseringen av BIRFLU har beskrivits tidigare55.
I figur 2, vi kännetecknas in vitro-birflu genom att bestämma Venus, nluc, och NP uttrycks nivåer med fluorescens och indirekta immunofluorescensmetoder (figur 2A, B). Confluent enskiktslager av MDCK celler var antingen håna-infekterade eller infekterade (Moi 0,1) med WT eller birflu PR8 virus och, vid 18 h efter infektion, Venus uttryck utvärderades direkt med fluorescens mikroskopi (figur 2A, B). Nluc (figur 2A) och NP (figur 2b) uttryck visualiserades genom indirekt immunofluorescens med hjälp av antikroppar som är specifika för varje protein. Som väntat upptäcktes Venus och Nluc uttryck endast i celler infekterade av BIRFLU och inte i celler infekterade av WT PR8 virus. Dessutom avslöjade indirekt immunofluorescensmikroskopi NP-uttryck i både WT-och BIRFLU PR8-infekterade celler. Inget uttryck av Venus, Nluc eller NP upptäcktes, som förväntat, i mock-infekterade celler (figur A, B).
För att utvärdera nluc uttrycks nivåer in vitro, var MDCK celler infekterade (Moi 0,001) med WT eller birflu PR8 virus och nluc aktivitet i vävnad kultur samman supernatanterna utvärderades vid 24, 48, 72 och 96 h efter infektion (figur 2C). Endast nluc aktivitet upptäcktes i vävnad kultur samman supernatanterna av MDCK celler infekterade med birflu (figur 2C). Nluc aktivitet i vävnads kulturen samman supernatanterna upptäcktes så tidigt som 24 h post-infektion med högre uttrycks nivåer vid 96 h post-infektion, troligen på grund av cytopatisk effekt (CPE) inducerad under virusinfektion release nluc protein behålls i cellen. För att utvärdera lämplighet birflu i odlade celler, var tillväxtkinetik av WT och birflu PR8 virus också utvärderats (figur 2D) och förekomsten av smittsamma virus i vävnad kultur samman supernatanterna bestämdes genom immun-fokus assay (figur 2D ). Särskilt, birflu replikering kinetik var jämförbara med de av WT PR8 virus, även om birflu replikering var något försenad och nådde inte samma virala titrar som WT PR8. BIRFLU kunde dock nå titrar på 5 x 107 PFU/ml (figur 2D), vilket indikerar att uttrycket av två rapportörgener i viral genomet inte påtagligt stör birflu-replikation i MDCK-celler.
Spåra BIRFLU-infektion hos möss (figur 3 och figur 4)
Figur 3 är ett schematiskt flödesschema för bedömning av birflu Dynamics i en musmodell av iav-infektion. Fem till sju veckor gamla kvinnliga BALB/C möss var antingen håna-infekterade med 1x PBS eller infekterade med 1 x 106 PFU av birflu intranasalt. Vid 3 dagar efter infektion, möss bedövnings med isofluran och sedan injiceras med Nluc substrat retro-Orbitally. Alla möss placerades omedelbart i IVIS-instrumentet och Nluc-signalen utvärderades in vivo med hjälp av IVIS. Därefter var möss euthanized och lungor skördades. Exciderade lungor analyserades sedan ex vivo med in vivo-kameran för att bestämma fluorescensintensiteten via Venus-uttrycket. Slutligen, möss lungor var homogeniserade, och virala titrar och stabilitet bestämdes genom plack assay. Plack bedömdes genom den direkta fluorescensen av Venus, genom immunofärgning med antikroppar specifika för Nluc och Crystal Violet färgning.
Tidigare beskrivits replikerande-kompetenta reporter-uttrycker iAVS uttrycka en enda reporter gen, oftast antingen en fluorescerande eller ett bioluminescerande protein, som surrogat för virusinfektion och replikering. Men, BIRFLU, kan uttrycka båda typerna av rapportörer gener på virusinfektion. För att bedöma sambandet mellan bioluminescens (in vivo Imaging) och fluorescens (ex vivo Imaging) efter BIRFLU-infektion var fem till sju veckor gamla kvinnliga BALB/c-möss mock-infekterade med 1x PBS eller inokulerades med BIRFLU (106 PFU) intranasalt . Nluc-aktiviteten (figur 4a) utvärderades genom administrering av nluc-substrat injicerad retro-Orbitally vid 3 dagar efter infektion med ett in vivo Imaging-instrument. Vi valde att utvärdera bioluminescens dag 3 eftersom tidigare studier indikerade att iav-replikering, inklusive PR8, toppar mellan dag 2 och 4 efter infektion24,54. Bioluminescens övervakades (figur 4a, överst) och användes för att beräkna det genomsnittliga totala flödet (Flux (log10 p/s) (figur 4a, botten). Som förväntat, möss inokulerade med birflu visade hög Mareld aktivitet men ingen signal upptäcktes i mock-infekterade möss. Därefter skördades lungorna hos infekterade möss och Venus-uttrycket utvärderades med hjälp av ex vivo-avbildning (figur 4b, överst). Dessutom beräknades fluorescenens genomsnittliga strålnings effektivitet (figur 4b, botten). De censurerade möss lungorna var också homogeniseras för att bestämma de virala titrar och den genetiska stabiliteten av birflu in vivo (figur 4c, D). Genetisk stabilitet av BIRFLU analyserades genom plack analys med hjälp av virus isolerade från möss lungor och fluorescerande mikroskopi (Venus, Top), immunofärgning (Nluc, mitten) och Crystal Violet färgning (botten). BIRFLU återhämtade sig från möss lungorna kunde bilda plack och uttrycker stabilt båda reportern gener (figur 4c). I synnerhet observerade vi ett bra samband mellan bioluminescens och fluorescens signaler med viral replikering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Figur 1: schematisk representation av iav PR8 WT och birflu spjälkat virus struktur och genomsegment. IAV är omgivna av ett lipidbilayer som innehåller de två stora virala glykoproteinerna hemagglutinin (HA; svart) och neuraminidas (NA; blå). IAV innehåller åtta enkelsträngade, negativa-Sense, RNA segment (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, och NS). Varje viral segment innehåller icke-kodning regioner (NCR) vid 3 ' och 5 ' ändar (svarta lådor). Dessutom, vid 3 ' och 5 ' slutet av viral (v) rnas är förpackningen signaler, ansvarig för effektiv encapsidation av vrnas till begynnande virioner (vita lådor). IAV PR8 HA och NS viral segment och produkter är indikerade i svart. Sekvenser av Nluc, Venus och PTV 2A anges i röda, gröna respektive randiga rutor. Den schematiska representationen av de modifierade HA-och NS-segmenten som uttrycker Nluc respektive Venus i BIRFLU anges också. Denna siffra har anpassats från Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Figur 2: in vitro-karakterisering av BIRFLU. (a, B) Analys av proteinuttryck genom direkt fluorescens och immunofluorescensen. MDCK celler var mock-infekterade eller infekterade (MOI 0,1) med PR8 WT eller BIRFLU virus. Infekterade celler fastställdes till 18 h efter infektion för att direkt visualisera Venus uttryck genom direkt fluorescerande mikroskopi och för att visualisera Nluc (A) och viral NP (B) uttryck med hjälp av specifika antikroppar och indirekta immunofluorescens. Kärnor färgas med DAPI. Representativa bilder (20x förstoring) visas. Skalstreck = 100 μm. (C, D) Tillväxtkinetik av PR8 WT och BIRFLU. Nluc aktivitet (C) och viral titrar (D) i vävnad kultur samman supernatanterna från MDCK celler infekterade (Moi 0,001) med WT och birflu PR8 virus bedömdes vid de angivna tiderna efter infektion. Data representerar medel ± SD av tre exemplar. Viral titrar bestämdes genom immun-fokus assay (FFU/ml). Streckad linje betecknar detektionsgränsen (200 FFU/ml). Denna siffra har anpassats från Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Figur 3: schematisk representation för studier av BIRFLU hos möss. Uttryck för Nluc-och Venus-rapportgener utvärderades hos möss infekterade med 1 x 106 PFU av birflu med in vivo-eller ex vivo-avbildning. Kort, på dag 1, 5 till 7 vecka gamla kvinnliga BALB/c möss var håna-infekterade (1x PBS) eller inokuleras med 1 x 106 PFU av birflu intranasalt. På dag 3 efter infektion, möss var milt bedövningsmedel med isofluran och Nluc substrat injicerades retro-Orbitally. Nluc signal bedömdes direkt med hjälp av in vivo Imaging. Omedelbart efter avbildning, möss var euthanized och uttryck av Venus i hela censurerade lungor analyserades med ex vivo Imaging. Återvunna möss lungor var homogeniserade för att utvärdera viral replikering och stabilitet genom plack assay. Pilar indikerar korrelation mellan fluorescens (Venus), immunofärgning (Nluc) och Crystal Violet färgning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Figur 4: in vivo-uttryck för bioluminescens och fluorescens. Kvinnliga fem till sju veckor gamla BALB/c möss var mock-infekterade (1x PBS) eller inokulerades med 1 x 106 PFU av birflu intranasalt. Vid dag 3 efter infektion bestämdes Nluc Activity (a) i hela musen. Representativa bilder av en enda mus som visar radians skala (p/SEK/cm2/SR). Bioluminescens strålningsvärdena kvantifierades och det genomsnittliga totala flödet visas (Flux (log10 p/s). Efter Nluc-avbildning skördades lungor för ex vivo-avbildning (B). Representativa bilder från hela lungorna visas. För att kvantifiera Venus-uttrycket normaliserades medelvärdet av intresseområden (ROIs) till lung autofluorescens från mock-infekterade möss och veck förändringar beräknades. För att analysera den genetiska stabiliteten hos BIRFLU in vivo analyserades virus från möss i lungorna genom plackanalys med hjälp av fluorescerande mikroskopi (Venus, Top), immunofärgning (Nluc, Middle) och Crystal Violet-färgning (botten) (C). Representativa bilder från en mus visas. För att utvärdera virusreplikering, hela lungorna var homogeniseras efter avbildning och används för att infektera MDCK celler och bestämma virala titrar av plack assay (PFU/mL) (D). Pilar indikerar korrelation mellan fluorescens (Venus), immunofärgning (Nluc) och kristall violett färgning. Staplarna representerar medelvärdet ± SD av lung virus titrar. Denna siffra har anpassats från Logales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Vävnadskultur medier och lösningar</td>
			<td>Sammansättning</td>
			<td>Lagring</td>
			<td>Använda</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Vävnad kultur media: Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM), 10% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 mL FBS och 5 mL 100x PSG.</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Underhåll av MDCK-celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Media efter infektion: dmem 0,3% bovint albumin (ba), 1% PSG (DMEM 0,3% BA 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA och 5 ml 100x PSG</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Underhåll av MDCK-celler efter virusinfektion</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X fosfatbuffrad saltlösning (PBS)</td>
			<td>80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g na2HPO4. 7h2O, 2 g KH2Po4. Lägg till ddH2O upp till 1 L. Justera pH till 7,3</td>
			<td>Rumstemperatur</td>
			<td>För att förbereda 1x PBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>Späd 10X PBS med ddH2O</td>
			<td>Rumstemperatur</td>
			<td>Tvätta celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Infektion media: 1x pbs, 0,3% BA, 1% penicillin-streptomycin (PS) (PBS/BA/PS).</td>
			<td>487 mL 1x PBS steril, 4,2 mL 35% BA och 5 ml 100x 1% PS (100 U/mL)</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Virusinfektioner</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Fixering/permeabiliseringslösning: 4% formaldehyd, 0,5% Triton X-100 utspädd i 1x PBS.</td>
			<td>400 mL neutral buffrad formalin 10%, 5 ml Triton X-100 och 595 mL 1x PBS</td>
			<td>Rumstemperatur</td>
			<td>Fix och depolarisering av MDCK celler.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Blockerande lösning: 2,5% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS.</td>
			<td>2,5 g BSA i 97,5 mL 1x PBS</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Blockerande lösning för immunofluorescens och plackanalyser.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lösning för antikropps utspädning (1% BSA i 1x PBS)</td>
			<td>1 g BSA i 99 mL 1x PBS</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Utspädning av primära och sekundära antikroppar.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% kristall violett lösning</td>
			<td>1 g kristallviolett i 400 mL metanol. Tillsätt 600 ml ddH2O</td>
			<td>Rumstemperatur</td>
			<td>Färgning av MDCK-celler i plack-analyser.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonylfenylalanyl klormetyl keton (tpck)-behandlad trypsin</td>
			<td>Bered en 1 000 x stamlösning på 1 mg/mL i ddH2O</td>
			<td>-20 ° c</td>
			<td>För virusinfektioner.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: vävnads kulturs medier och lösningar.

Watch this Scientific Journal Video about A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection at JoVE.com

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

En Luciferase-fluorescerande reporter influensa virus för levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion

Influensa A virus (iav) är smittsam respiratoriska patogener som orsakar årliga epidemier och enstaka pandemier. Här beskriver vi ett protokoll för att spåra virusinfektioner in vivo med hjälp av en roman rekombinant luciferas och Fluorescence-uttrycker bi-reporter iav (birflu). Detta tillvägagångssätt ger forskare ett utmärkt verktyg för att studera IAV in vivo.

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Forskare har tidigare genererat rekombinanta influensavirus som uttrycker antingen fluorescerande eller bioluminescerande proteinreportrar. En del av vårt enda uttryck för reportergener i influensavirus begränsar dess användning i experiment allvarligt. Vårt protokoll beskriver användningen av bireporter influensavirus som uttrycker både fluoresent och bioluminescerande reporter gener, och därför överstiger dess begränsning.Den största fördelen med denna teknik är användningen av ett enda rekombinant influensavirus för in vitro- och in vivo-studier. När du utför denna teknik, snabb injektion av luciferasubstrat och korrekt planering av möss hantering är viktigt, eftersom substratet snabbt metaboliseras. Också, rakning av möss rekommenderas för att förbättra detektion av bioluminescerande signal.För att infektera mössen, börja med att förbereda BIRFLU i 1X PBS. Underhåll viruset på is tills inokulering. Kontrollera om det saknas tå nypa reflex för att se till att musen är sövd, och inokulera det intranasalt med den beredda BIRFLU utspädning.Se till att alla möss andas ordentligt innan de återvänder till sina burar. Öppna bildhanteringsprogrammet och tryck på Initialize, ställ sedan in de parametrar som ska användas för bildåtergivningen. För att övervaka mössen infekterade med BIRFLU, raka bröstet för att förbättra detektion av bioluminescerande signal.När mössen är sövda, använd en 22 gauge nål för att retro-orbitally administrera 100 mikroliter av Nluc luciferasubstrat, utspädd en till 10 i PBS. Omedelbart efter injektionen, placera djuren i isoleringskammaren med bröstet uppåt. Placera sedan isoleringskammaren i bildbehandlingsinstrumentet, stäng dörren och skaffa bilder.Efter bildbehandling, returnera mössen till sina burar och övervaka dem tills de har återhämtat sig helt. Använd verktyget för bildhanteringsprogram ROI för att analysera de förvärvade bioluminescensdata genom att utse en region av intresse och klicka på mått. För att utföra ex vivo bildframställning av muslungor, samla lungorna enligt manuskriptriktningarna, starta bildförvärvsprogrammet och ställa in parametrarna för bildtagning.När maskinen är initierad, placera lungorna i en svart bakgrund bricka, och se till att vävnaderna separeras från varandra. Föra in facket i imager, stänga dörren, och skaffa bilder. Efter avbildning, ta bort vävnaderna omedelbart och förvara dem på is vid fyra grader Celsius om proverna kommer att behandlas på samma dag.Om de kommer att behandlas senare, frysa dem snabbt i ett rör på torris, och lagra dem på 80 grader Celsius. Om du vill bearbeta bilderna väljer du ROI-verktyget, ritar av intresseområden runt var och en av de enskilda lungorna och klickar på mått. BIRFLU har karakteriserats in vitro genom att bestämma Venus, Nluc och NP-uttrycksnivåer i infekterade celler.Venus och Nluc uttryck är bara detekteras i celler som smittats av BIRFLU, medan NP uttrycks i både vild-typ PR8 och BIRFLU-infekterade celler. Inget uttryck observeras i mock-infekterade celler. Vidare har Nluc aktivitet mätts i vävnadskultur supernatanter på 24, 48, 72 och 96 timmar efter infektion.Det upptäcks så tidigt som 24 timmar efter infektion, och uttrycksnivåerna ökar vid 96 timmar. Det kan också påvisas att replikationskinetik av BIRFLU är jämförbara med det vilda PR8-viruset. BIRFLU har förmågan att uttrycka både fluorescerande och bioluminescerande reportergener, och korrelationen mellan de två kan bedömas med hjälp av in vivo och ex vivo-avbildning av en muslunga.Lungorna hos möss infekterade med BIRFLU visade hög bioluminescens in vivo och fluorescens ex vivo. Viral titers och genetisk stabilitet birflu in vivo har också fastställts. Plack analyser på virus från mus lungor visade att viruset kan bilda plack och uttrycka både reporter gener.BIRFLU skulle också kunna användas för att utvärdera effektiviteten av antivirala och neutraliserande antikroppar mot influensa. Utdata från dessa analyser alla var korrelerade med varandra och är snabba och enkla att göra.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes för influensa A-virus Upptäckt och isolering från svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

I vitro Demontering av influensa A-virus-kapsider genom gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mätning influensaneuraminidas Inhibition Antikroppstitrar genom enzymkopplad lektin analys

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserade neuraminidas Inhibition analys för att bedöma känsligheten hos influensavirus till The neuraminidashämmaren Class of Virushämmande

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influensa A Virus studier på en musmodell av infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging Cell interaktion i luftrör slemhinna under influensa virusinfektion med två-photon Intravital mikroskopi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...