Name: a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection at JoVE.com

LM-S laboratuvarında grip virüsü üzerine yapılan araştırmalar, NIAID Grip Araştırma ve Gözetim (CEIRS) sözleşmesi No'nun bir üyesi olan New York Grip Mükemmellik Merkezi (NYICE) (NIH 272201400005C) tarafından kısmen finanse edilmektedir. HHSN272201400005C (NYICE) ve Savunma Bakanlığı (DoD) Hakemli Tıbbi Araştırma Programı (PRMRP) hibe W81XWH-18-1-0460.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Araştırmacılar anlamak ve viral çoğaltma ve patogenez26,27,28mevcut anlayış üzerine genişletmek için hayati moleküler araçlar olarak rekombinant muhabir-ifade virüsleri dayanıyordu, 29.000 , 30,5 000 , 31.000 , 32.000 , 33.000 , 34.000 , 35.000 , 36.000 , 37.000 , 38.000 , 39,5 000 , 40,5 000 , 41.000 , 54- En çok tercih edilen muhabir genler luciferases ve floresan proteinler, özellikle onların tanımlanmasında teknolojik gelişmeler nedeniyle, gelişmiş varyantların geliştirilmesi ve görüntüleme teknolojileri tarafından tespit43 , 44.000 , 45.000 , 46.000 , 47.000 , 48. Rekombinant muhabir virüsler genellikle virolojik tahlilleri hızlandırmak için kullanılır, in vitro ve in vivo virüslerin dinamikleri çalışma, ve şu anda onaylanmış veya yeni aşı ve tedavi yaklaşımlarının etkinliğini test etmek için26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Ne yazık ki, IAV durumunda, geçmiş çalışmalar tek bir muhabir genin ifade sınırlıydı, hangi yapılabilir çalışma türü engeller 26,27,28,29 , 30,5 000 , 31.000 , 32.000 , 33.000 , 34.000 , 35.000 , 36.000 , 37.000 , 38.000 , 39,5 000 , 40,5 000 , 41.000 , 54- Bu sınırlamayı önlemek için, bir Nluc luciferase ve Venüs floresan protein (BIRFLU) ifade eden bir çoğaltma-yetkili bi-reporter IAV oluşturduk.
Bu yazıda, BirFLU'nun in vitro karakterizasyonu ve IAV enfeksiyonunun fare modelini kullanarak in vivo viral enfeksiyonu izlemek için BIRFLU'yu kullanmak için deneysel yaklaşımları açıklıyoruz. BIRFLU Nluc ve Venüs ekspresyonu viral titrelerle ilişkilidir. Buna ek olarak, BIRFLU kararlı kaldı ve enfekte farelerin akciğerlerinden kurtarıldıktan sonra her iki muhabir genleri ifade etmeye devam etti. Bu yaklaşım, araştırmacılara IAV enfeksiyonlarının tedavisi için yeni tedavi alternatiflerinin tanımlanması ve geliştirilmesi de dahil olmak üzere, kültürlü hücrelerde ve hayvan modellerinde IAV'yi inceleme fırsatı sunmaktadır.
PR8'in belkemiği kullanılarak bir flu üretilmiş olmasına rağmen, aynı deneysel yaklaşım kullanılarak farklı tip, alt tip veya viral gerinim omurgaları kullanılarak diğer rekombinant IAV oluşturulabilir. Aynı şekilde, bu raporda IAV'nin fare modelinde BIRFLU'nun kullanımına ilişkin deneysel prosedürleri açıklanmıştır. Ancak, BIRFLU diğer hayvan modellerinde IAV enfeksiyonu değerlendirmek için değerli bir teknoloji olabilir.

Influenza A virüsü (IAV) Orthomyxoviridae ailesinin tek iplikçikli negatif-sense parçalı RNA virüsü1,2,3. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 3-5 milyon yıllık grip vakaları ve grip dünya çapında4,5,6250.000 'den fazla ölüm tahmin ediyor. Özellikle grip karşı savunmasız gruplar yaşlılar dahil, bağışıklık bireyler, ve çocuklar7,8,9,10,11. Aşılar mevcut ve viral enfeksiyona karşı en yaygın ve etkili müdahale temsil rağmen, IAV hızla gelişmeye ve önceden varolan bağışıklık kaçmak yapabiliyor3,12,13, 14.000 , 15. 2009 yılında bir pandemik H1N1 suşu yeniden ortaya çıkması ve patojenik IAV ortaya çıkması dünya çapında insan halk sağlığı için sürekli tehdit yineler4,16.
Bir salgın veya pandemik sırasında, yeni izole edilen virüslerin patojenitesini ve geçirilme kabiliyetini hızla belirlemek çok önemlidir. Şu anda mevcut teknikleri virüs tespit etmek için zaman alıcı ve bazen bu analizlerin tamamlanmasını geciktirebilir zahmetli yaklaşımların kullanımını gerektirir17,18,19,20. Ayrıca, mevcut viral tahliller bir salgın durumunda gerekli olabilir, ölçeklendirmek zordur. Son olarak, fareler, kobaylar ve gelincikler gibi doğrulanmış hayvan enfeksiyonlarının kullanımı rutin olarak kullanılır ve grip enfeksiyonları, bağışıklık yanıtları ve yeni aşıların ve/veya antivirallerin etkinliğini incelemede hayati önem taşımaktadır. Ancak, bu modeller gerçek zamanlı olarak viral dinamikleri gözlemlemek için yetersizlik nedeniyle kısıtlayıcı; bu viral enfeksiyonların statik görüntüleme çalışmaları sınırlar21,22,23,24,25. Bu tahlillerde kullanılan hayvanlar da viral yükü belirlemek için ötenazi edilir, böylece bu çalışmaları tamamlamak için gerekli hayvan sayısını artırmak26. Tüm bu sınırlamaları aşmak için, birçok araştırmacı rekombinant çoğaltma-yetkin, muhabir ifade IAVs, hangi virolojik tahliller hızlandırılması ve gerçek zamanlı 26 içinde vivo viral yük ve yayma tespit yeteneğine sahip kullanımı güveniyor ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Daha da önemlisi, bu muhabir ifade IAVs hücre kültüründe vahşi tip (WT) IAVs benzer çoğaltmak edebiliyoruz ve enfeksiyon hayvan modellerinde33,42.
Floresan ve biyolüminesans proteinler, duyarlılıkları, stabilitesi ve kullanım kolaylığı nedeniyle araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan iki muhabir sistemdir. Buna ek olarak, floresan ve biyolüminesans protein algılama teknolojileri43,44,45,46,47,48 muazzam destek ve ilerleme var . Floresan proteinler ve luciferase onları kızdırma izin farklı özelliklere sahip, özellikle nasıl heyecanlı durumları oluşturulur ve nasıl yayılım tespit edilir farklı43,44,45, 46,47,48. Floresan proteinler ilk olarak enerjiyi emerek heyecanlanırlar, moleküller daha düşük bir enerji durumuna düştükçe daha sonra farklı bir dalga boyunda ışık olarak serbest bırakılır43. Öte yandan, biyolüminesans ışık üretmek için bir substrat, oksijen ve bazen ATP içeren bir kimyasal ekzotermik reaksiyon elde edilir45. Muhabir proteinlerin bu iki tür değişen özellikleri nedeniyle, bir ilgi çalışmaya bağlı olarak diğerinden daha belki daha avantajlı. Floresan proteinler yaygın hücresel lokalizasyon gözlemlemek için kullanılır iken28,41, onların in vivo sinyalleri yetersiz yoğunlukta ve genellikle canlı dokularda otofloresan tarafından gizlenmiş49. Bu nedenle, araştırmacılar canlı organizmalarda viral dinamikleri değerlendirmek için luciferases güveniyor, floresan proteinler ex vivo çalışmalar için tercih edilebilir rağmen50,51,52,53. Floresan proteinlerin aksine, luciferases in vivo çalışmalar için daha uygundur ve non-invaziv yaklaşımlar da uygulanabilir26,27,28,29,30 , 31.000 , 32.000 , 33.000 , 34.000 , 35.000 , 36.000 , 37.000 , 38.000 , 39,5 000 , 40,5 000 , 41.000 , 54- Sonuç olarak, çalışmanın türüne bağlı olarak, araştırmacılar, çalışmalarını işlevsellik ve hassasiyetlerin bir dengesine tabi tâyiçler olan floresan veya luciferase muhabiri protein in kullanımı arasında seçim yapmalıdırlar ve ciddi rekombinant muhabir virüslerin kullanışlılığını kısıtlar. Ayrıca, floresan veya luciferase sistemleri kullanan farklı muhabir genlerin ekspresyonu ile elde edilen verilerin yorumlanmasını tehlikeye atabilecek viral çoğaltma veya yayma arasındaki korelasyona ilişkin endişeler vardır. muhabir ifade IAVs.
Bu sınırlamayı, aynı viral genom55'te hem floresan hem de luciferase proteini kodlayan rekombinant çoğaltma yetkin bi-reporter IAV (BIRFLU) üreterek aştık ( Şekil1). Burada, NanoLuc luciferase (Nluc), küçük ve parlak biyolüminesans protein48, influenza A / Porto Riko/08/1934 H1N1 viral HA segmentinde hemagglutinin (HA) dizisinin yukarı yerleştirildi (PR8)24,33, 40,55,56,57. Buna ek olarak, Venüs, sık kullanılan monomerik floresan protein, non-yapısal (NS) viral segment32,33,36,41,55içine yerleştirildi . Birflu hem floresan hem de luciferase muhabiri genleri için kodlar bu yana, ya muhabir protein sinyali viral çoğaltma ve in vitro veya in vivo55yaymak belirlemek için okuma olarak kullanılabilir. BirFLU'nun nesil ve in vitro veya in vivo karakterizasyonu ile ilgili ek bilgiler son yayınımızda bulunabilir55. BIRFLU yeni bir floresan ve biyolüminesans bazlı mikronötralizasyon testi 55 ile antiviral ilaçların etkinliğiniveya nötralize antikorların etkinliğini test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, BIRFLU da enfeksiyon bir fare modeli viral dinamikleri değerlendirmek için kullanılabilir55. Bu yazıda, BIRFLU55 in vitro karakterize prosedürleri ve nasıl in vivo veya Venüs ex vivo algılamak için in vivo lüminesans görüntüleme sistemleri kullanarak farelerde BIRFLU enfeksiyonu çalışma açıklanmıştır.
Moleküler biyoloji, hayvan araştırmaları ve görüntüleme teknolojilerinde en ileri tekniklerin birleşimi, araştırmacılara virüs-konak etkileşimleri, viral enfeksiyon dinamikleri dahil olmak üzere IAV araştırmaları için BIRFLU'yu kullanma fırsatı nı sunar; IAV enfeksiyonlarının terapötik tedavisi için yeni aşı yaklaşımlarının geliştirilmesi veya Diğer patojen enfeksiyonların tedavisinde aşı vektörü olarak IAV'nin potansiyel kullanımı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS4</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>This software is used in 3.1.10 and 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Albumin solution (BA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Store at 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture dishes 100mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used in 4.4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C581-100</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7722-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Five- to seven-week-old female BALB/c mice</td>
			<td>National Cancer Institute (NCI)</td>
			<td>555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 Motorized Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 4.7.2 software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumicount</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td>This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>H16-L10-4R5</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin 10%</td>
			<td>EMD</td>
			<td>65346-85</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-00-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 20000R Fast1394 Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-075-150</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vmax Kinetic plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a luciferase-fluorescent reporter influenza virus for live imaging and quantification of viral infection

Influenza A virüsleri (IAVs) önemli sağlık ve ekonomik sonuçları ile ilişkili insan solunum hastalığı neden. Diğer virüslerde olduğu gibi, IAV'yi incelemek, virüs hücrelerinde ve/veya enfeksiyon hayvan modellerinde virüsün varlığını saptamak için zahmetli ikincil yaklaşımların kullanılmasını gerektirir. Bu sınırlama son zamanlarda kolayca izlenebilir floresan veya biyolüminesans (luciferase) muhabir proteinleri ifade rekombinant IAVs üretimi ile atlatılmış olmuştur. Ancak araştırmacılar, IAV genomunun yabancı dizileri de içeren kısıtlı kapasitesi nedeniyle floresan veya luciferase muhabiri genlerini seçmek zorunda kalmıştır. Bu sınırlamayı aşmak için, iav enfeksiyonlarını in vitro ve in vivo olarak kolayca takip etmek için hem floresan hem de luciferase muhabiri genini ifade eden bir rekombinant çoğaltma-yetkin bi-reporter IAV (BIRFLU) oluşturduk. Bu amaçla, influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) viral olmayan yapısal olmayan (NS) ve hemagglutinin (HA) viral segmentleri floresan Venüs ve biyolüminesans Nanoluc luciferase proteinlerini kodlamak için değiştirildi. Burada BirFLU'nun IAV enfeksiyonunun fare modelinde kullanımını ve in vivo görüntüleme sistemi kullanarak her iki muhabir genin invivo görüntüleme sistemini tespit insini anlatıyoruz. Özellikle, hem muhabirlerin ifadeleri ve viral çoğaltma arasında iyi bir korelasyon gözlemledik. Moleküler biyoloji, hayvan araştırmaları ve görüntüleme teknolojilerinde en ileri tekniklerin birleşimi, araştırmacılara virüs-konak etkileşimleri ve dinamikleri de dahil olmak üzere grip araştırmaları için bu aracı kullanma fırsatı sağlar. viral enfeksiyonlar. Daha da önemlisi, farklı viral segmentlerden iki yabancı genifade etmek için genetik olarak viral genomu değiştirmek için fizibilite için bu yaklaşımı kullanmak için fırsatlar açılır: (i) yeni IAV aşılarının geliştirilmesi, (ii) rekombinant IAVs üretimi diğer insan patojen enfeksiyonlarının tedavisinde aşı vektörleri olarak kullanılabilir.

Birflu in vitro üretimi ve karakterizasyonu (Şekil 1 ve Şekil 2)
İki farklı muhabir genini (BIRFLU) ifade eden bir rekombinant çoğaltma-yetkili IAV, son teknoloji moleküler biyoloji ve plazmid bazlı ters genetik teknikleri kullanılarak inşa edilmiştir (Şekil1). Burada, küçük boyutu, ATP-bağımsızlık, daha fazla yoğunluk ve optimize substrat48,60dahil olmak üzere diğer luciferases üzerinde çeşitli avantajlar nedeniyle Nluc kullanmayı seçti. Nluc IAV PR8 HA segmentine klonlanmış ve ardından ha'nın açık okuma çerçevesi (ORF) önünde domuz teschovirus (PTV) 2A dekolte alanı (2A) izlemiştir (Şekil 1). HA ORF orijinal ambalaj sinyalleri kaldırmak ve olası rekombinasyon önlemek için sessiz mutasyonlar dahil. Tam HA ambalaj sinyali, değiştirilmiş HA segmentinin aynı viral RNA segmentinden virion ve Nluc ve HA ekspresyonuna uygun şekilde dahil edilmesine izin vermek için Nluc'un önüne eklenmiştir (Şekil1). Buna ek olarak, floresan protein Venüs tek bir transkript ns1 ve NEP kodlar modifiye IAV PR8 NS segmentine klonlanmış oldu32,36,41,54, 57. yıl. Bu amaçla Venüs, NS1'in C-terminaline kaynaşmış ve tüm NEP ORF, NS1-Venüs ve NEP dizileri arasına yerleştirilen PTV 2A dekolte alanının aşağısına klonlanmış (Şekil1). Sonuç olarak, bu iki modifiye HA ve NS viral plazmid yapılar IAV PR8 ters genetik plazmidler geri kalanı ile birlikte birflu oluşturmak için kullanılmıştır (Şekil 1). BIRFLU in vitro ve in vivo karakterizasyonu daha önce55açıklanmıştır .
Şekil2'de Floresan ve dolaylı immünoresans yaklaşımları kullanılarak Venüs, Nluc ve NP ekspresyon düzeylerini belirleyerek in vitro BIRFLU karakterize edildik (Şekil 2A,B). MDCK hücrelerinin en fluent monolayers ya mock-enfekte veya enfekte (MOI 0.1) WT veya BIRFLU PR8 virüsleri ile ve, 18 saat post-enfeksiyon, Venüs ekspresyonu doğrudan floresan mikroskop isiyle değerlendirildi (Şekil2A,B). Nluc (Şekil 2A) ve NP (Şekil 2B) ekspresyonu her proteine özgü antikorlar kullanılarak dolaylı immünfloresans ile görselleştirildi. Beklendiği gibi, Venüs ve Nluc ekspresyonu sadece BIRFLU tarafından enfekte hücrelerde saptırıldı, WT PR8 virüsü ile enfekte hücrelerde değil. Buna ek olarak, dolaylı immünoresans mikroskopisi hem WT hem de BIRFLU PR8-enfekte hücrelerde NP ekspresyonu saptamıştır. Venüs, Nluc veya NP ifadesi beklendiği gibi sahte enfekte hücrelerde algılanmadı (ŞekilA,B).
Nluc ekspresyon düzeylerini in vitro olarak değerlendirmek için, MDCK hücreleri WT veya BIRFLU PR8 virüsleri ile enfekte edildi (MOI 0.001) ve doku kültürü supernatants Nluc aktivitesi 24, 48, 72 ve 96 h post-enfeksiyon değerlendirildi (Şekil2C). BIRFLU (Şekil2C)ile enfekte MDCK hücrelerinin doku kültüründe sadece Nluc aktivitesi saptandı. Doku kültüründe nluc aktivitesi supernatants 96 h post-enfeksiyon yüksek ekspresyon düzeyleri ile 24 saat post-enfeksiyon gibi erken tespit edildi, büyük olasılıkla çünkü sitopatik etkisi (CPE) viral enfeksiyon salınımı sırasında indüklenen Nluc protein muhafaza hücreiçine. Kültürlü hücrelerde BIRFLU'nun uygunluğunu değerlendirmek için WT ve BIRFLU PR8 virüslerinin büyüme kinetiği de değerlendirildi (Şekil2D) ve doku kültüründe enfeksiyöz virüsün varlığı immün odak testi ile belirlendi (Şekil 2D ). Özellikle, BIRFLU çoğaltma kinetik WT PR8 virüsü ile karşılaştırılabilir, BIRFLU çoğaltma biraz gecikmiş ve WT PR8 aynı viral titreleri ulaşmadı rağmen. Ancak, BIRFLU 5 x 107 PFU/mL (Şekil2D)titrelerine ulaşabildi ve viral genomdaki iki muhabir genin ekspresyonunun MDCK hücrelerindeki BIRFLU çoğalmasını önemli ölçüde etkilemediğini belirtti.
Farelerde BIRFLU enfeksiyonunun izlenmesi (Şekil 3 ve Şekil 4)
Şekil 3, IAV enfeksiyonunun fare modelinde BIRFLU dinamiklerinin değerlendirilmesi için bir şematik akış şemasıdır. Beş ila yedi haftalık dişi BALB/C farelerya ya 1x PBS ile bulaşmış ya da 1 x 106 PFU birflu intranasally ile enfekte olmuştur. 3 gün sonra, fareler isofluran e-posta ile anestezi edildi ve daha sonra nluc substrat retro-orbital ile enjekte edildi. Tüm fareler derhal IVIS cihazına yerleştirildi ve Nluc sinyali IVIS kullanılarak in vivo olarak değerlendirildi. Daha sonra fareler ötenazi yedirildi ve akciğerleri hasat edildi. Excised akciğerler daha sonra Venüs ekspresyonu ile floresan yoğunluğunu belirlemek için in vivo görüntüleyici kullanılarak ex vivo analiz edildi. Son olarak fare akciğerleri homojenleştirildi ve plak tsay ile viral titreler ve stabilite belirlendi. Plaklar Venüs'ün doğrudan floresansı, Nluc'a özgü antikorlar kullanılarak immünboyama ve kristal mor boyama ile değerlendirildi.
Daha önce açıklanan çoğaltma-yetkili muhabir-ifade IAVs tek bir muhabir gen ifade, en sık ya bir floresan veya biyolüminesans protein, viral enfeksiyon ve çoğaltma için vekil olarak. Ancak, BIRFLU, viral enfeksiyon üzerine muhabir genlerin her iki tip ifade edebiliyoruz. Birflu enfeksiyonu sonrası biyolüminesans (in vivo görüntüleme) ile floresan (ex vivo görüntüleme) arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için, beş ila yedi haftalık dişi BALB/c fareler 1x PBS ile enfekte olmuş veya BIRFLU (106 PFU) intranasile aşılanmış . Nluc aktivitesi (Şekil4A)in vivo görüntüleme cihazı kullanılarak 3 gün sonra retro-orbital enjekte edilen Nluc substrat uygulaması ile değerlendirildi. Biz gün 3 biyolüminesans değerlendirmek için seçtim çünkü önceki çalışmalarda IAV çoğaltma, PR8 dahil, gün 2 ve 4 post-enfeksiyon24arasında zirveleri gösterdi,54. Biyolüminesans izlendi (Şekil4A, üst) ve ortalama toplam akı hesaplamak için kullanılan (Akı (log10 p/s) (Şekil4A, alt). Tahmin edildiği gibi, BIRFLU ile aşılanan fareler yüksek biyolüminesans aktivitesi gösterdi, ancak sahte enfekte farelerde sinyal tespit edilmedi. Daha sonra enfekte farelerin akciğerleri hasat edildi ve Venüs ekspresyonu ex vivo görüntüleme (Şekil4B, üst) kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca floresan ortalama radyant verimi hesaplanmıştır (Şekil4B, alt). Eksinti farelerin akciğerleri de viral titreleri ve BIRFLU in vivo genetik stabilitesini belirlemek için homojenize edildi (Şekil 4C,D). BIRFLU'nun genetik stabilitesi fare akciğerlerinden izole edilen virüsler ve floresan mikroskopi (Venüs, üst), immünboyama (Luc, orta) ve kristal mor boyama (alt) kullanılarak plak analizi ile analiz edildi. Fare akciğerlerinden elde edilen BIRFLU plaklar oluşturabildi ve her iki muhabir genini de ifade edebildi (Şekil 4C). Özellikle, biyolüminesans ve floresan sinyalleri arasında viral replikasyon ile iyi bir korelasyon gözlendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Şekil 1: IAV PR8 WT ve BIRFLU virion yapısı ve genom segmentlerinin şematik gösterimi. IAV iki büyük viral glikoproteinler hemagglutinin içeren bir lipid çift katmanlı çevrilidir (HA; siyah) ve nöraminidaz (NA; mavi). IAV sekiz tek telli, negatif-sense, RNA segmentleri (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M ve NS) içerir. Her viral segment 3' ve 5' uçlarında (kara kutular) kodlamayan bölgeleri (NCR) içerir. Ayrıca, viral (v) RNA'ların 3' ve 5' ucunda, vRNA'ların yeni doğan viriasyonlara (beyaz kutular) verimli bir şekilde saklanmasından sorumlu ambalaj sinyalleri bulunur. IAV PR8 HA ve NS viral segmentleri ve ürünleri siyah olarak belirtilmiştir. Nluc, Venüs ve PTV 2A dizileri sırasıyla kırmızı, yeşil ve çizgili kutularda gösterilir. Nluc ve Venüs'ü ifade eden modifiye EDILMIŞ HA ve NS segmentlerinin şematik gösterimi de BIRFLU'da belirtilmiştir. Bu rakam Nogales ve ark.55'tenuyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Şekil 2: BirFLU'nun in vitro karakterizasyonu. (A, B) Doğrudan floresan ve immünofloresan ile protein ekspresyonunun analizi. MDCK hücreleri pr8 WT veya BIRFLU virüsleri ile mock-infected veya enfekte (MOI 0.1) idi. Enfekte hücreler, venüs ekspresyonunu doğrudan floresan mikroskopi ile görselleştirmek ve Belirli antikorlar ve dolaylı immünoresans kullanarak Nluc (A) ve viral NP (B) ekspresyonunu görselleştirmek için 18 saat sonrası enfeksiyon sonrası sabitlendi. Çekirdekler DAPI ile lekelendi. Temsili görüntüler (20x büyütme) gösterilir. Ölçek çubukları = 100 μm. (C, D) PR8 WT ve BIRFLU büyüme kinetik. Nluc aktivitesi(C) ve viral titreler (D) doku kültüründe enfekte MDCK hücrelerinden (MOI 0.001) WT ve BIRFLU PR8 virüsleri ile supernatants belirtilen zamanlarda enfeksiyon sonrası değerlendirildi. Veriler, triplicates± ± SD anlamına gelir. Viral titreler immün odak tsay (FFU/mL) ile belirlendi. Noktalı çizgi algılama sınırını gösterir (200 FFU/ml). Bu rakam Nogales ve ark.55'tenuyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Şekil 3: Farelerde BIRFLU çalışması için şematik gösterim. In vivo veya ex vivo görüntüleme kullanılarak 1 x 106 PFU BIRFLU ile enfekte farelerde Nluc ve Venüs muhabir genlerinin ekspresyonu değerlendirildi. Kısaca, gün 1, 5-7 haftalık dişi BALB / c fareler mock-enfekte edildi (1x PBS) veya birflu intranasally 1 x 106 PFU ile aşılanmış. 3. gün enfeksiyon sonrası fareler isofluran kullanılarak hafif anestezi edildi ve Nluc substratı retro-orbital olarak enjekte edildi. Nluc sinyali in vivo görüntüleme kullanılarak doğrudan değerlendirildi. Görüntülemeden hemen sonra fareler ötenazi yedirildi ve venüs'ün tüm ekstremakciğerlerde ekspresyonu ex vivo görüntüleme kullanılarak analiz edildi. Kurtarılan fare akciğerleri plak tsay ile viral replikasyon ve stabiliteyi değerlendirmek için homojenleştirildi. Oklar floresan (Venüs), immünboyama (Nluc) ve kristal mor boyama arasındaki ilişkiyi gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Şekil 4: In vivo biyolüminesans ve floresan ekspresyonu. Dişi beş ila yedi haftalık BALB/c fareler ipe enfekte (1x PBS) veya 1 x 106 PFU birflu intranasally ile aşılandı. Gün 3 enfeksiyon sonrası, Nlucaktivitesi (A) tüm fare tespit edildi. Parlaklık ölçeğini (p/sn/cm2/sr) gösteren tek bir farenin temsili görüntüleri. Biyolüminesans parlaklık değerleri sayısallaştırıldı ve ortalama toplam akı gösterilmiştir (Akı (Log10 p/s). Nluc görüntülemeden sonra, akciğerler ex vivogörüntüleme (B) için hasat edildi. Tüm akciğerlerden temsili resimler gösterilir. Venüs ekspresyonunu ölçmek için, ilgi bölgelerinin (ROI) ortalama değerleri, sahte enfekte farelerden akciğer oto-floresanına normalleştirildi ve kıvrım değişiklikleri hesaplandı. Birflu in vivo'nun genetik stabilitesini analiz etmek için fare akciğerlerinden elde edilen virüsler floresan mikroskopi (Venüs, üst), immünboyama (Nluc, orta) ve kristal mor boyama (alt) (C) kullanılarak plak testinde analiz edildi. Bir fareden temsili görüntüler gösterilir. Virüs replikasyonunu değerlendirmek için görüntüleme sonrası tüm akciğerler homojenleştirildi ve MDCK hücrelerine bulaşmaya ve plaktesti (PFU/mL) (D) ile viral titreleri belirlemek için kullanıldı. Oklar floresan (Venüs), immünboyama (Nluc) ve kristal mor boyama arasındaki ilişkiyi gösterir. Çubuklar akciğer virüsü titrelerinin ortalama ± SD'sini temsil eder. Bu rakam Logales ve ark.55'tenuyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Doku kültürü ortamı ve çözümleri</td>
			<td>Kompozisyon</td>
			<td>Depolama</td>
			<td>Kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Doku kültürü ortamı: Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM), 10 % Fetal Sığır Serumu (FBS), %1 Penisilin-Streptomisin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10 % FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 mL FBS ve 5 mL 100x PSG.</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>MDCK hücrelerinin bakımı</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Enfeksiyon sonrası ortam: DMEM %0.3 Büyükbaş Albumin (BA), %1 PSG (DMEM %0.3 BA % 1 PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4.2 ml % 35 BA ve 5 ml 100x PSG</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Viral enfeksiyon sonrası MDCK hücrelerinin bakımı</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Fosfat tamponlu salin (PBS)</td>
			<td>NaCl 80 g, KCl 2 g, Na 11.5 g2HPO4.7H2O, KH2PO 2 g4. ddH2O'dan 1 L'ye kadar ekle pH'ı 7,3'e ayarla</td>
			<td>Oda sıcaklığı</td>
			<td>1x PBS hazırlamak için</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>DDH2O ile seyreltik 10x PBS</td>
			<td>Oda sıcaklığı</td>
			<td>Hücreleri yıkama</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Enfeksiyon ortamları: 1x PBS, 0.3% BA, 1% Penisilin-Streptomisin (PS) (PBS / BA /PS).</td>
			<td>487 mL 1x PBS steril, 4.2 mL %35 BA ve 5 ml %100x 1 PS(100 U/mL)</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Viral enfeksiyonlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Fiksasyon/permeabilizasyon çözeltisi: %4 formaldehit, %0.5 triton X-100 1x PBS seyreltilir.</td>
			<td>400 mL nötr tamponlu formalin %10, Triton X-100 5 ml ve 1x PBS 595 mL</td>
			<td>Oda sıcaklığı</td>
			<td>MDCK hücrelerinin düzeltilmesi ve permeabilizasyonu.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Bloklama çözümü: 1x PBS'de %2.5 Sığır Serum Albumini (BSA).</td>
			<td>1x PBS 97,5 mL'de 2,5 g BSA</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>İmmünfluoresans ve plak tahlilleri için blokaj çözümü.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antikor seyreltme çözeltisi (1x PBS'de %1 BSA)</td>
			<td>1x PBS 99 mL'de 1 g BSA</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Primer ve sekonder antikorların seyreltilmesi.</td>
		</tr>
<tr>
<td>%0,1 kristal mor çözelti</td>
			<td>400 mL metanolde 1 g kristal menekşe. 600 ml ddH2O ekleyin</td>
			<td>Oda sıcaklığı</td>
			<td>Plak tahlillerinde MDCK hücrelerinin boyanma.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonyl fenililel klorometil keton (TPCK) ile tedavi edilen tripsin</td>
			<td>ddH2O'da 1 mg/mL'de 1000x stok çözeltisi hazırlayın</td>
			<td>-20 °C</td>
			<td>Viral enfeksiyonlar için.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Doku kültürü ortamı ve çözümleri.

Watch this Scientific Journal Video about A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection at JoVE.com

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Influenza A virüsleri (IAVs) yıllık salgınlara ve ara sıra salgınlara neden olan bulaşıcı solunum patojenleridir. Burada, yeni bir rekombinant luciferase ve floresan ifade iki muhabir IAV (BIRFLU) kullanarak vivo viral enfeksiyonları izlemek için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım in vivo IAV çalışma için mükemmel bir araç ile araştırmacılar sağlar.

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Araştırmacılar daha önce floresan veya biyolüminesans protein muhabirleri ifade rekombinant grip virüsleri üretti. Grip virüsündeki muhabir genleri tek ifademizin bir parçası deneylerde kullanımını ciddi şekilde sınırlar. Protokolümüz, hem florhem biyolüminesans muhabir genlerini ifade eden ve bu nedenle sınırlandırılmasını aşan bireporter influenza virüsü kullanımını açıklamaktadır.Bu tekniğin en büyük avantajı in vitro ve in vivo çalışmalar için tek bir rekombinant influenza virüsü nün kullanılmasıdır. Bu tekniği yaparken, luciferase substrat hızlı enjeksiyon ve fare işleme uygun planlama önemlidir, substrat hızlı bir şekilde metabolize çünkü. Ayrıca, farelerin tıraş biyolüminesans sinyal in saptama geliştirmek için tavsiye edilir.Farelere bulaştırmak için BIRFLU'yu 1X PBS olarak hazırlayarak başlayın. Aşı olana kadar virüsü buzda saklar. Farenin anestezi aldığından emin olmak için ayak tutam refleksinin yokluğunu kontrol edin ve hazırlanan BIRFLU seyreltme ile intranasiye sini aşılayın.Tüm farelerin kafeslerine geri dönmeden önce düzgün nefes aldıklarından emin olun. Görüntüleme yazılımını açın ve Initialize tuşuna basın, ardından görüntüleme için kullanılacak parametreleri ayarlayın. BIRFLU ile enfekte fareler izlemek için, biyolüminesans sinyalin tespitini geliştirmek için göğüs tıraş.Fareler anestezi edildikten sonra, PBS'de 1 ila 10 arasında seyreltilmiş 100 mikrolitre Nluc luciferase substratını retro-orbital olarak yönetmek için 22 gauge iğne kullanın. Enjeksiyondan hemen sonra, hayvanları göğüsleri yukarı bakacak şekilde izolasyon odasına yerleştirin. Daha sonra izolasyon odasını görüntüleme aletine yerleştirin, kapıyı kapatın ve görüntüler edinin.Görüntülemeden sonra, fareleri kafeslerine geri getirin ve tamamen iyileşene kadar onları izleyin. Bir ilgi alanı atayarak ve önlemi tıklayarak edinilmiş biyolüminesans verilerini analiz etmek için görüntüleme yazılımı Yatırım Getirisi aracını kullanın. Fare akciğerlerinin ex vivo görüntülemesini gerçekleştirmek için, el yazması talimatlara göre akciğerleri toplayın, görüntü edinme yazılımını başlatın ve görüntüleme parametrelerini ayarlayın.Makine başharfe bulaştığında, akciğerleri siyah bir arka plan tepsiye yerleştirin ve dokuların birbirinden ayrıldığından emin olun. Tepsiyi görüntüleyiciye tanıtılın, kapıyı kapatın ve görüntü edinin. Görüntülemeden sonra, hemen dokuları çıkarın ve numuneler aynı gün işlenecekse, dört santigrat derecede buzüzerinde saklayın.Daha sonra işlenecekse, onları kuru buz üzerinde bir tüpte hızlıbir şekilde dondurun ve 80 santigrat derecede saklayın. Görüntüleri işlemek için YG aracını seçin, her bir akciğerin etrafında ilgi alanları çizin ve ölçü'ye tıklayın. BIRFLU enfekte hücrelerde Venüs, Nluc ve NP ekspresyon düzeylerini belirleyerek in vitro karakterize edilmiştir.Venüs ve Nluc ekspresyonu sadece BIRFLU tarafından enfekte edilen hücrelerde tespit edilirken, NP hem yabani tip PR8 hem de BIRFLU enfekte hücrelerde ifade edilir. Sahte enfekte hücrelerde ifade gözlenmez. Ayrıca, Nluc aktivitesi doku kültürü supernatants ölçüldü 24, 48, 72, ve 96 saat post-enfeksiyon.Enfeksiyon sonrası 24 saat erken saptanır ve ifade düzeyleri 96 saat artar. Ayrıca BIRFLU çoğaltma kinetik vahşi tip PR8 virüsü ile karşılaştırılabilir olduğu gösterilebilir. BIRFLU hem floresan hem de biyolüminesans muhabir genlerini ifade etme yeteneğine sahiptir ve ikisi arasındaki korelasyon fare akciğerinin in vivo ve ex vivo görüntülemesi kullanılarak değerlendirilebilir.BIRFLU ile enfekte farelerin akciğerleri vivo ve floresan ex vivo yüksek biyolüminesans görüntülenir. Birflu in vivo'nun viral titreleri ve genetik stabilitesi de belirlenmiştir. Fare akciğerlerinden gelen virüsler üzerinde yapılan plak tahlilleri virüsün plaklar oluşturabildiği ve her iki muhabir genini de ifade edebildiği ortaya çıktı.BIRFLU ayrıca antiviral etkinliğini değerlendirmek ve grip karşı antikorları nötralize etmek için kullanılabilir. Bu tahlillerden elde edilen çıktılar birbiriyle ilişkiliydi ve hızlı ve kolay bir şekilde yapıldı.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...