ويدعم هذا العمل جزئيا ً منحة المساعدة المقدمة للبحوث العلمية (KaKENHI) (C) (رقم 22500336، 25430068، 16K07061) (Y. Sasaki). نشكر الدكتور تيروكوزو نوجي والسيدة ماكيكو نيازاكي (جامعة مدينة يوكوهاما) على تقديم بروتين LRRTM2 البيوتيني. ونشكر أيضا هونامي أوتشي وري إيشي على المساعدة التقنية.

أجريت التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة وفقاً للمبادئ التوجيهية المبينة في اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة مدينة يوكوهاما.
1. إعداد كرات الخلايا العصبية كما شنقا انخفاض الثقافة (أيام في المختبر (DIV) 0-3)
ملاحظة: تستند الإجراءات ال...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

قمنا بتطوير طريقة جديدة لدراسة تشكيل presynapse حفز مع LRRTM2-الخرز باستخدام ثقافة الكرة العصبية. حاليا، معظم اختبار تشكيل presynapse يشمل بولي-D-يسين (PDL) الخرز المغلفة والثقافة المنفصلة / غرفة microfluidic20،21،22. واحدة من مزايا هذه الطريقة هو LRRTM2 الخرز. في ح?...

تشكيل متشابك هو واحد من الخطوات الحاسمة أثناء تطوير الدوائر العصبية1،2،3. تشكيل نقاط الاشتباك العصبي التي هي مقصورات متخصصة تتكون من ما قبل وبعد نقاط الاشتباك العصبي هو عملية معقدة ومتعددة الخطوات تنطوي على الاعتراف المناسب للمحاور وdendrites، وتشكيل المنطقة النشطة وكثافة postynaptic، والمحاذاة المناسبة لل قنوات أيون ومستقبلات الناقل العصبي1,2. في كل عملية، تتراكم أنواع كثيرة من البروتينات متشابك إلى هذه المقصورات المتخصصة في توقيت مناسب عن طريق نقل البروتينات متشابك من أجسام الخلايا و / أو عن طريق الترجمة المحلية في المقصورات. وتعتبر هذه البروتينات متشابك ليتم ترتيبها بطريقة منظمة لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية. خلل في بعض البروتينات متشابك التي تنطوي على تكوين متشابك يؤدي إلى الأمراض العصبية4,5. ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح كيف تتراكم البروتينات متشابك في التوقيت المناسب.
للتحقيق في كيفية تراكم البروتينات متشابك بطريقة منظمة، فمن الضروري لدراسة تراكم البروتينات متشابك في الترتيب الزمني. وأظهرت بعض التقارير التصوير الحي لمراقبة تشكيل متشابك في ثقافة منفصلة من الخلايا العصبية6،7. ومع ذلك، فإنه من يستغرق وقتا طويلا للعثور على الخلايا العصبية التي تبدأ للتو تشكيل متشابك تحت الفحص المجهري. لمراقبة تراكم البروتينات متشابك بكفاءة، يجب أن يبدأ تشكيل متشابك في الوقت الذي يريد الباحثون للحث على تشكيل. والتحدي الثاني هو التمييز بين تراكم البروتينات المتشابكة بسبب النقل من أجسام الخلايا أو الترجمة المحلية في نقاط الاشتباك العصبي. ولهذا الغرض، من الضروري قياس مستوى الترجمة في ظل شرط لا يسمح بنقل البروتينات المتشابكة من أجسام الخلايا.
قمنا بتطوير رواية presynapse تشكيل التبيّن باستخدام مزيج منثقافة الكرة العصبية مع الخرز للحث على تشكيل presynapse 8. تم تطوير ثقافة الكرة العصبية لفحص النمط الظاهري المحاور، وذلك بسبب تشكيل أوراق axonal المحيطة الهيئات الخلية9،10. استخدمنا الخرز المغناطيسي المترافق مع اللوشأنهين الغنية تكرار الخلايا العصبية عبر الغشاء 2 (LRRTM2) وهذا هو منظم presynaptic للحث على presynapses الإثارة (الشكل1A)11،12،13. باستخدام الخرز LRRTM2، يبدأ تشكيل presynapse في الوقت الذي يتم فيه تطبيق الخرز. وهذا يعني أن تشكيل presynapse يبدأ في الآلاف من محاور الكرة العصبية في نفس الوقت، وبالتالي فإنه يسمح لدراسة مسار زمني دقيق من تراكم البروتينات متشابك بكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ثقافة الكرة العصبية من السهل منع نقل البروتينات متشابك من سوما عن طريق إزالة الهيئات الخلية (الشكل1B)8. وقد أكدنا بالفعل أن المحاور التي لا تحتوي على أجسام خلوية يمكن أن تبقى على قيد الحياة وأنها صحية على الأقل 4 ساعة بعد إزالة أجسام الخلايا. وهكذا، فإن هذا البروتوكول مناسب للتحقيق من حيث يتم اشتقاق البروتينات متشابك (جسم الخلية أو محور عصبي)، وكيف تتراكم البروتينات متشابك بطريقة منظمة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

خلال تطوير الخلايا العصبية، تشكيل المشبك هو خطوة هامة لإنشاء الدوائر العصبية. لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي، يجب توفير البروتينات متشابك في الترتيب المناسب عن طريق النقل من الهيئات الخلية و / أو الترجمة المحلية في نقاط الاشتباك العصبي غير ناضجة. ومع ذلك، فإنه ليس من المفهوم تماما كيف تتراكم البروتينات متشابك في نقاط الاشتباك العصبي في الترتيب السليم. هنا، نقدم طريقة جديدة لتحليل تشكيل presynaptic باستخدام مزيج من ثقافة الكرة العصبية مع الخرز للحث على تشكيل presynapse. كرات الخلايا العصبية التي هي المجاميع الخلايا العصبية توفر أوراق axonal بعيدا عن أجسام الخلايا وdendrites، بحيث يمكن الكشف عن إشارات الفلورسنت ضعيفة من presynapses عن طريق تجنب إشارات ساحقة من أجسام الخلايا. كما الخرز لتحريك تشكيل presynapse، ونحن نستخدم الخرز المترافق مع اللوين الغنية تكرار الخلايا العصبية عبر الغشاء 2 (LRRTM2)، وهو منظم presynaptic مثير. باستخدام هذه الطريقة، أظهرنا أن الغلوتامات الحويصلي الناقل 1 (vGlut1)، وهو بروتين الحويصلة متشابك، المتراكمة في presynapses أسرع من Munc18-1، وهو بروتين منطقة نشطة. Munc18-1 المتراكمة الترجمة تعتمد في presynapse حتى بعد إزالة الهيئات الخلية. وتشير هذه النتيجة إلى تراكم Munc18-1 عن طريق الترجمة المحلية في المحاور، وليس النقل من أجسام الخلايا. في الختام، هذه الطريقة مناسبة لتحليل تراكم البروتينات متشابك في presynapses ومصدر البروتينات متشابك. كما ثقافة الكرة العصبية بسيطة وليس من الضروري استخدام جهاز خاص، يمكن أن تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق على منصات تجريبية أخرى.

هنا، نعرض النتائج التمثيلية لتراكم البروتينات presynaptic في presynapses التي يسببها LRRTM2 من أوراق axonal من ثقافة الكرة العصبية. كبروتينات presynaptic، قمنا بتحليل البروتين الحويصلة المتشابكة المحفزة vGlut1 وبروتين المنطقة النشطة Munc18-1. كما درسنا مسار الوقت من تراكم vGlut1 و Munc18-1 في presynapses، والحصول على نتائج تشير...

Watch this Scientific Journal Video about Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and Ã¢â‚¬Å“Neuron BallÃ¢â‚¬Â Culture at JoVE.com

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

تشكيل Presynapse هو عملية ديناميكية بما في ذلك تراكم البروتينات متشابك في الترتيب السليم. في هذه الطريقة، يتم تشغيل تشكيل presynapse بواسطة الخرز المترافق مع بروتين منظم presynapse على أوراق axonal من ثقافة "الكرة العصبية"، بحيث تراكم البروتينات متشابك من السهل تحليلها خلال تشكيل presynapse.

Presynapse تشكيل التبيّن باستخدام الخرز المنظم Presynapse و "الكرة العصبية" الثقافة

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق حيث البروتينات presynaptic تنشأ: خلايا الأجسام أو محاور. وكيف تتراكم البروتينات presynaptic في presynapses بطريقة منظمة خلال تشكيل المشبك. يمكن أن تحفز هذه التقنية الآلاف من presynapses في نفس الوقت ، ولا تستخدم أي جهاز خاص للحفاظ على محاور في الثقافة مما يسمح بتحليل فعال لتشكيل العديد من presynapses في محاور عصبية.جنبا إلى جنب مع طالب الدراسات العليا، هونامي، مما يدل على هذا الإجراء سيكون ري إيشي، وهو طالب جامعي في مختبري. ابدأ هذا الإجراء باستخدام القتل الرحيم للماوس كما هو موضح في بروتوكول النص. تشريح البطن للحصول على الأجنة E16.إزالة العقول من الأجنة بعناية مع مساعدة من ملقط غرامة يميل، ونقلها إلى أطباق ثقافة الخلايا 60 ملليمتر تحتوي على أربعة ملليلتر من محلول الملح الاحتياطي HEPES أو HBSS. إزالة السحايات وقطع لمبة الشم. الكورتيص منفصلة عن كل نصف الكرة الدماغية باستخدام نصائح غرامة من ملقط تحت المجهر ستيريو ونقلها إلى طبق آخر 60 ملليمتر تحتوي على HBSS الطازجة.استخدام ما لا يقل عن ثلاثة إلى خمسة أجنة لكل ثقافة كرة الخلايا العصبية منفصلة. قطع الكورتيصات إلى قطع صغيرة مع مقص الربيع microdissecting في غطاء ثقافة خلية تدفق لارينار. الآن، نقل الكورنيش المفروم إلى أنبوب 15 ملليلتر.Trypsinize الكورتيز المفروم في أربعة ملليلتر من 0.125٪ التربسين في HBSS لمدة 4.5 دقائق في حمام مائي في 37 درجة مئوية. نقل مجاميع الخلية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من HBSS عن طريق ماصة نقل معقمة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل تكرار هذه الخطوة مرة أخرى.ثم نقل مجاميع الخلية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر تحتوي على مليلترين من متوسطة NGB، 0.01٪ DNase I، ومصل الحصان 10٪. Triturate الكورتيص التربسينيد عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا لهم صعودا وهبوطا من ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماصة الزجاج الناعم المصقول النار. لتحضير كرات الخلايا العصبية، قم بضبط كثافة الخلايا في تعليق الخلايا إلى مليون خلية لكل ملليلتر باستخدام وسيط NGB.إضافة سبعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى الجزء السفلي من الأطباق الثقافة. ثقافة الخلايا العصبية القشرية كما 10 قطرات microliter شنقا تحتوي على 10،000 خلية لكل قطرة داخل الأغطية العليا من أطباق الثقافة 10 سنتيمترات. الحفاظ على الأطباق في حاضنة لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في ظل ظروف مرطبة للسماح لتشكيل الكرة العصبية.معطف بولي-L-ليسين أو PLL على غطاء الزجاج البارافين مطرز ينزلق في أطباق 60 ملليمتر باستخدام 15 ميكروغرام لكل ملليلتر PLL الحل في المخزن المؤقت بورات. احتفظ بها لمدة ساعة واحدة على الأقل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. بعد الغسيل أربع مرات مع برنامج تلفزيوني، ونقل زلات غطاء PLL المغلفة إلى لوحة أربعة بئر تحتوي على 350 ميكرولترات من متوسطة NGB مع ثلاثة AraC micromolar في كل بئر.تتم إضافة AraC إلى وسائل الإعلام لقتل الخلايا المنقسمة. احتضان لوحات أربعة آبار تحتوي على غطاء PLL المغلفة زلات في حاضنة CO2 لمدة 20 دقيقة على الأقل لضمان درجة حرارة المتوسطة تصل إلى 37 درجة مئوية قبل نقل كرات الخلايا العصبية. في DIV 3 عندما يتم تشكيل كرات الخلايا العصبية بشكل جيد للغاية، ونقلها على زلات غطاء مغلفة PLL.داخل لوحة أربعة جيدا، إضافة خمس كرات الخلايا العصبية في بئر. في DIV 11 نقل 20 ميكرولترات من تعليق الجسيمات المغناطيسية المغلفة streptavidin إلى أنبوب microcentrifuge. قم بشل تثبيت الخرز إلى جهاز مصنوع يدويًا مرفقًا بمغناطيسات النيوديميوم الدائمة ويغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر من PBS-MCBC في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر.بعد إزالة تماما PBS-MCBC من الخرز، إضافة حجم محدد سلفا من مخزون LRRTM2 إلى الخرز غسلها. احتضان الخليط باستخدام دوار في أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد الحضانة، وغسل الخرز مرتين مع 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني MCBC.ثم، وغسل الخرز مع 100 ميكروليتر من متوسطة NGB. Resuspend الخرز LRRTM2 في 50 ميكرولترات من ني جي بي المتوسطة لتطبيقها على ثقافة الكرة العصبية. الآن قطع نهاية طرف أصفر في زاوية 45 درجة مع شفرة الحلاقة تحت المجهر ستيريو.وضع الطرف الأصفر على منطقة الجسم الخلية من الكرة العصبية وإزالة الهيئات الخلية عن طريق الشفط. تطبيق LRRTM2 والخرز التحكم على ثقافة الكرة العصبية. ثم غمر الخرز إلى الجزء السفلي من لوحات من ثقافة الكرة العصبية لمدة دقيقة واحدة باستخدام مغناطيس الفريت لبدء تشكيل ما قبل المشبك.هذا الإجراء يضمن لهبوط جميع الخرز في نفس الوقت. إصلاح وصمة عار في الخلايا العصبية في ثقافة الكرة العصبية بعد تشكيل ما قبل المشبك مع الخرز كما هو موضح في بروتوكول النص. التقط تباين التداخل التفاضلي وصور الفلوروسنس المناعي تحت مجهر فلوري مقلوب مع كاميرا CCD مبردة باستخدام عدسة غمر الزيت 60X.قياس كثافة المناعة في ما قبل نقاط الاشتباك العصبي في محور عصبي. استخدام كثافة المناعة من المنطقة ذات الاهتمام على الخرز. ناقص قبالة الخرز كثافة المنطقة مقسمة من شدة محور عصبي، على طول 20 ميكرون من الخرز.ناقص كثافة الخلفية. هذه الكثافة نسبة يوفر مؤشر تراكم البروتين. لتحديد مستوى تراكم بروتين معين في presynapse المستحثة بخرز LRRTM2 ، حدد دائمًا المنطقة التي هي حقلين من الرؤية أو أكثر بصرف النظر عن جسم الخلية.لقياس دقيق، اختر خمسة حقول مختلفة محور عصبي لكل غطاء. يظهر هنا هو تطبيق الخرز LRRTM2 في ثقافة الكرة العصبية في DIV 11 الناجمة تراكم Munc18-1 في presynapses من محاور من كرات الخلايا العصبية. الخرز على محاور من كرات الخلايا العصبية مرئية في صور المجهر المرحلة.ويلاحظ تراكم البروتينات presynaptic من خلال الصور immunofluorescence. حتى في المحاور التي يتم إزالة الأجسام الخلية، لوحظ تراكم Munc18-1 تحت الخرز، على غرار محاور من كرات الخلايا العصبية مع الهيئات الخلية. عندما تم تحليل المنطقة الطرفية من ورقة محور عصبي من قبل عدسة الهدف التكبير عالية، vGlut1 و Munc18-1 تراكمت بوضوح في presynapses من المحاور تحت الخرز مع وبدون أجسام الخلية.أثبتت تجارب الدورة الزمنية أن تراكم vGlut1 في presynapses زاد بشكل كبير في 30 دقيقة. ومن ناحية أخرى، بدأ تراكم Munc18-1 في الزيادة بشكل ملحوظ في ساعتين ووصل إلى الهضبة في أربع ساعات. وتشير هذه البيانات إلى أن بروتين الهدابيك التشابكي vGlut1 يتراكم في presynapses في وقت سابق من البروتين المنطقة النشطة Munc18-1.وKosynapses تراكم Munc18-1 من الخلايا العصبية Fmr1-KO زيادة 1.5 مرات أكثر من تلك الموجودة في نوع البرية, مما يدل على تورط FMRP في تراكم Munc18-1. مثبط تخليق البروتين, أنيسومايسين, قمعت تراكم Munc18-1 بشكل كبير في محاور عصبية مع وبدون أجسام الخلايا. وهذا يشير إلى أن تراكم البروتين هو التوليف تعتمد.الأنابيب الكورتيص التربسينized باستخدام ماصة الزجاج الناعم المصقول باستور النار هو خطوة هامة. يقوم المجربون بإعداد الماصات المصقولة بالنيران بقطرين إلى ثلاثة أقطار مختلفة، واختاروا ماصة بقطر مناسب. باستخدام هذا الإجراء، يتم قياس الافراج متشابك من presynapses الناجمة عن الخرز LRRTM2 عن طريق التصوير الحي.هذه الطريقة الإضافية من شأنها أن الإجابة ما إذا كان البروتين التوليف في محاور عصبية وتشارك في تنظيم إطلاق متشابك. باستخدام هذه الطريقة، يدرس الباحثون كيف تتراكم البروتينات presynaptic في presynapses بطريقة منظمة، فضلا عن موقع مصدر البروتينات presynaptic.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

إعداد وثقافة شرائح الدجاج الدماغ السمعية

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الإنسان خلايا الورم ورم أرومي دبقي الأشكال باستخدام الفحص Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

يعاير الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام مقايسة المذنب

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

المثبطة تشكيل المشبك في الثقافة المشارك نموذجي يتضمن المتوسطة GABAergic شائك الخلايا العصبية وخلايا HEK293 وإذ يعرب ستابلي GABA<sub&gt; و</sub&gt; المستقبلات

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...