Dette arbejde støttes delvis af JSPS-tilskuddet til videnskabelig forskning (KAKENHI) (C) (nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Vi takker Dr. Terukazu Nogi og MS. Makiko Neyazaki (Yokohama City University) for venligt at give biotinylated LRRTM2 protein. Vi takker også Honami Uechi og Rie Ishii for teknisk assistance.

De eksperimenter, der er beskrevet i dette manuskript, blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er skitseret i det institutionelle dyrepleje-og anvendelses udvalg for Yokohama City University.
1. forberedelse af neuron bolde som hængende drop kultur (dage in vitro (DIV) 0-3)
Bemærk: de procedurer, der er beskrevet her til fremstilling af neuron Ball kultur er baseret på den metode, der tidligere er rapporteret af Sasaki gruppen med nogle ...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

Vi udviklede nye metode til at undersøge presynapse dannelse stimuleret med LRRTM2-perler ved hjælp af neuron kugle kultur. I øjeblikket er de fleste af presynapse formation assay omfatter poly-D-lysin (PDL)-belagte perler og dissocieret kultur/microfluidic kammer20,21,22. En af fordelene ved denne metode er LRRTM2-perler. Mens LRRTM2 interagerer med neurexin at danne excitatoriske presynapser specifikt11</s...

Synapse dannelse er en af kritiske trin under udvikling af neurale kredsløb1,2,3. Dannelse af synapser, der er specialiserede rum bestående af præ-og post-synapser er en kompleks og flertrinsproces involverer passende anerkendelse af axoner og dendritter, dannelse af aktiv zone og postsynaptisk tæthed, og korrekt tilpasning af Ionkanaler og neurotransmitter receptorer1,2. I hver proces akkumuleres mange former for synaptiske proteiner til disse specialiserede segmenter i korrekt timing ved at transportere synaptiske proteiner fra celle organer og/eller ved lokal oversættelse i afdelingerne. Disse synaptisk proteiner anses for at være arrangeret i organiseret måde at danne funktionelle synapser. Dysfunktion af nogle synaptiske proteiner, der involverer synapse dannelse resultater i neurologiske sygdomme4,5. Men, det er stadig uklart, hvordan synaptiske proteiner ophobes i ordentlig timing.
At undersøge, hvordan synaptisk proteiner ophobes i organiseret måde, er det nødvendigt at undersøge ophobning af synaptiske proteiner i kronologisk rækkefølge. Nogle rapporter viste levende billeddannelse for at observere synapse dannelse i dissocieret kultur af neuroner6,7. Men, det er tidskrævende at finde neuroner, som bare starte synapse dannelse under mikroskopi. For at observere ophobning af synaptiske proteiner effektivt, skal synapse dannelse starte på det tidspunkt, hvor forskerne ønsker at inducere dannelsen. Den anden udfordring er at skelne ophobning af synaptiske proteiner på grund af transport fra celle organer eller lokal oversættelse i synapser. Til dette formål er oversættelses niveauet nødvendigt at blive målt under den betingelse, der ikke tillader transport af synaptiske proteiner fra celle organer.
Vi udviklede Novel presynapse formation assay ved hjælp af en kombination af neuron kugle kultur med perler til at inducere presynapse dannelse8. Neuron Ball kultur er udviklet til at undersøge axonal fænotype, på grund af dannelsen af axonal ark omgivende celle organer9,10. Vi brugte magnetiske perler konjugeret med leucin-rige gentage transmembran neuronal 2 (LRRTM2), der er en præsynaptisk organisator til at fremkalde excitatoriske presynapses (figur 1a)11,12,13. Ved hjælp af LRRTM2 perler starter presynapse dannelse på det tidspunkt, hvor perlerne påføres. Det betyder, at presynapse dannelse starter i tusindvis af axoner af en neuron kugle på samme tid, således at det gør det muligt at undersøge præcis tidsforløbet af ophobning af synaptiske proteiner effektivt. Desuden, neuron kugle kultur er let at blokere transport synaptisk proteiner fra Soma ved at fjerne celle legemer (figur 1b)8. Vi har allerede bekræftet, at axoner uden celle organer kan overleve og er sunde mindst 4 h efter fjernelse af celle organer. Således er denne protokol er egnet til at undersøge fra hvor synaptisk proteiner er afledt (celle legeme eller Axon), og hvordan synaptiske proteiner ophobes i organiseret måde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Under neuronal udvikling, synapse dannelse er et vigtigt skridt til at etablere neurale kredsløb. For at danne synapser skal synaptiske proteiner leveres i passende orden ved transport fra celle organer og/eller lokal oversættelse i umodne synapser. Men, det er ikke helt forstået, hvordan synaptisk proteiner ophobes i synapser i ordentlig rækkefølge. Her præsenterer vi en ny metode til at analysere præsynaptisk dannelse ved at bruge kombinationen af neuron kugle kultur med perler til at fremkalde presynapse dannelse. Neuron bolde, der er neuronal celle aggregater giver axonal ark langt fra celle legemer og dendritter, således at svage fluorescerende signaler af præsynapser kan påvises ved at undgå overvældende signaler af celle organer. Som perler til at udløse presynapse dannelse, vi bruger perler konjugeret med leucin-rige gentage transmembran neuronal 2 (LRRTM2), en excitatoriske præsynaptic organisator. Ved hjælp af denne metode, vi viste, at vesikulær glutamat transporter 1 (vGlut1), en synaptisk vesikel protein, akkumuleret i præsynapser hurtigere end Munc18-1, en aktiv zone protein. Munc18-1 akkumuleret oversættelse-afhængigt af presynapse selv efter fjernelse af celle legemer. Dette fund indikerer Munc18-1 akkumulering ved lokal oversættelse i axons, ikke transport fra celle organer. Afslutningsvis, denne metode er egnet til at analysere ophobning af synaptiske proteiner i præsynapser og kilde til synaptisk proteiner. Som neuron Ball kultur er enkel, og det er ikke nødvendigt at bruge særlige apparat, denne metode kan anvendes til andre eksperimentelle platforme.

Her viser vi repræsentative resultater af ophobning af præsynaptiske proteiner i LRRTM2-induceret presynapser af axonal ark af neuron kugle kultur. Som præsynaptiske proteiner analyserede vi excitatoriske synaptiske vesikle protein vGlut1 og den aktive zone protein Munc18-1. Vi undersøgte også tidsforløbet for akkumulering af vGlut1 og Munc18-1 i præsynapser, og opnåede resultater med angivelse af kilde til Munc18-1 i præsynapser ved hjælp af axoner, der fjerner celle legemer og en proteinsyntese hæmmer. For n...

Watch this Scientific Journal Video about Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and Ã¢â‚¬Å“Neuron BallÃ¢â‚¬Â Culture at JoVE.com

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse dannelse er en dynamisk proces, herunder ophobning af synaptiske proteiner i ordentlig orden. I denne metode, presynapse dannelse udløses af perler konjugeret med en presynapse organisator protein på axonal plader af "neuron Ball" kultur, således at ophobning af synaptiske proteiner er let at blive analyseret under presynapse dannelse.

Presynapse dannelse analyse ved hjælp af Presynapse Organizer perler og "neuron Ball" kultur

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Denne protokol er egnet til at undersøge, hvor præsynaptiske proteiner stammer:celle organer eller axoner. Og hvordan præsynaptiske proteiner ophobes i præsynapser på en organiseret måde under synapseformationen. Denne teknik kan fremkalde tusindvis af forsynapser på samme tid, og bruger ikke nogen særlige apparat til at opretholde axoner i kultur giver mulighed for effektiv analyse af dannelsen af mange presynapser i axoner.Sammen med kandidatstuderende, Honami, der demonstrerer denne procedure vil være Rie Ishii, en bachelor studerende i mit laboratorium. Begynd denne procedure med mus dødshjælp som beskrevet i tekstprotokollen. Disseker maven for at få E16 embryoner.Fjern hjernen fra embryoner omhyggeligt ved hjælp af finspidsede snævler, og overfør dem til 60-millimeter cellekulturretter indeholdende fire milliliter HEPES bufferet saltopløsning eller HBSS. Fjern meninges og skær olfaktoriske pære. Adskaf cortices fra hver cerebral halvkugle ved hjælp af de fine spidser af snævler under stereomikroskopet og overfør til en anden 60-millimeter skål, der indeholder frisk HBSS.Brug mindst tre til fem embryoner for hver separat neuron boldkultur. Skær cortices i små stykker med microdissecting foråret saks i en laminar flow cellekultur hætte. Nu, overføre hakkede cortices til en 15-milliliter rør.Trypsinize hakket cortices i fire milliliter af 0,125% trypsin i HBSS i 4,5 minutter i et vandbad ved 37 grader Celsius. Celleraggregater overføres til et nyt 15-milliliterrør indeholdende 10 milliliter HBSS ved hjælp af en steril overførselspipette. Inkubere ved 37 grader Celsius i fem minutter, før du gentager dette trin endnu en gang.Overfør derefter celleaggregaterne til et nyt 15-milliliterrør indeholdende to milliliter NGB-medium, 0,01%DNase I og 10% hesteserum. Triturate trypsinized cortices ved gentagne gange pipettering dem op og ned tre til fem gange ved hjælp af en brand-poleret fint glas Pasteur pipette. Til forberedelse af neuronkugler justeres celletætheden i cellesuspensionen til en million celler pr. milliliter ved hjælp af NGB-medium.Tilsæt syv milliliter PBS til den nederste del af kulturretterne. Kultur de kortikale neuroner som 10 mikroliter hængende dråber indeholdende 10.000 celler per dråbe inde i de øverste låg på 10-centimeter kultur retter. Opbevar retterne i en kuvøse i tre dage ved 37 grader Celsius med 5% CO2 under befugtede forhold for at give mulighed for neuron kugledannelse.Coat poly-L-lysin eller PLL på paraffin-beaded glas dække glider i 60-millimeter retter ved hjælp af en 15 mikrogram pr. milliliter PLL opløsning i borat buffer. Hold dem i mindst en time i en CO2-inkubator ved 37 grader Celsius. Efter vask fire gange med PBS overføres de PLL-belagte dækselssedler til en fire-brøndplade indeholdende 350 mikroliter NGB-medium med tre mikromolar AraC i hver brønd.AraC føjes til medierne for at dræbe skillende celler. De fire brøndplader, der indeholder de PLL-belagte dækselsedler i CO2-inkubatoren, inkuberes i mindst 20 minutter for at sikre, at mediets temperatur når 37 grader Celsius, før neuronkuglerne overføres. På DIV 3, når neuron bolde er dannet meget godt, overføre dem på PLL-belagt dække glider.Inde i fire-brønd plade, tilføje fem neuron bolde per brønd. Ved DIV 11 overføres 20 mikroliter fra suspensionen af streptavidin-belagte magnetiske partikler til et mikrocentrifugerør. Immobilisere perlerne til et håndlavet apparat fastgjort med neodym permanente magneter og vask tre gange med 100 mikroliter PBS-MCBC i 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør.Efter helt at fjerne PBS-MCBC fra perlerne, tilsæt en forudbestemt volumen af LRRTM2 lager til de vaskede perler. Inkuber blandingen ved hjælp af en rotator ved fire grader Celsius i en til to timer. Efter inkubation vaskes perlerne to gange med 100 mikroliter PBS-MCBC.Vask derefter perlerne med 100 mikroliter af NGB-medium. Resuspend lrrtm2 perler i 50 mikroliter af NGB medium til anvendelse på neuron bold kultur. Skær nu enden af en gul spids i 45 graders vinkel med et barberblad under stereomikroskopet.Sæt den gule spids ende på cellen kroppen område af en neuron bold og fjerne celle organer ved sugning. Påfør LRRTM2 og kontrol perler på neuron bold kultur. Derefter nedsænkes perlerne til bunden af pladerne af neuron bolden kultur i et minut ved hjælp af ferrit magneter til at starte pre-synapse dannelse.Denne procedure sikrer at touchdown alle perler på samme tid. Fix og plette neuroner i neuron bold kultur efter pre-synapse dannelse med perler som beskrevet i tekstprotokollen. Optag differentialinterferenskontrast og immunfluorescensbilleder under et omvendt fluorescerende mikroskop med et afkølet CCD-kamera ved hjælp af et 60X olienedsænkningslinse.Immunfluorescensintensiteten måles i præsynapser i axonen. Brug immunfluorescensintensiteten i interesseregionen på perler. Minus off perler region intensitet divideret med axonal intensitet, langs 20 mikron fra perlerne.Minus baggrundsintensitet. Denne ratio intensitet giver protein akkumulering indeks. For at kvantificere akkumuleringsniveauet for et bestemt protein i en forsynapseforledt med LRRTM2 perler skal du altid vælge det område, der er to synsfelter eller mere bortset fra cellekroppen.For nøjagtig måling skal du vælge fem forskellige axonale felter pr. dækslæd. Vist her er anvendelsen af LRRTM2 perler i neuron bold kultur på DIV 11 induceret ophobning af Munc18-1 i presynapser af axoner af neuron bolde. Perlerne på axoner af neuron bolde er synlige i fase mikroskopi billeder.Og ophobning af præsynaptiske proteiner er observeret af immunfluorescens billeder. Selv i axoner, der fjernes celle organer, ophobning af Munc18-1 blev observeret under perlerne, svarende til axoner af neuron bolde med celle organer. Når den perifere region af axonal ark blev analyseret ved høj forstørrelse objektiv linse, vGlut1 og Munc18-1 akkumuleret klart i presynapser af axoner under perlerne med og uden celle organer.Tidsforløbsforsøg viste, at akkumulering af vGlut1 i præsynapser steg betydeligt efter 30 minutter. På den anden side begyndte Munc18-1 akkumulering at stige betydeligt på to timer og nåede et plateau på fire timer. Disse data indikerer, at det synaptiske vesicle protein vGlut1 ophobes i præsynapser tidligere end det aktive zoneprotein Munc18-1.Den Munc18-1 ophobning i presynapser af Fmr1-KO neuroner steg 1,5 gange mere end dem i vilde type, hvilket indikerer inddragelse af FMRP i Munc18-1 ophobning. Proteinsyntesehæmmer, anisomycin, undertrykt Munc18-1 akkumulering betydeligt i axoner med og uden celle organer. Dette indikerer, at akkumulering er proteinsyntese afhængig.Pipettering trypsinized cortices ved hjælp af en brand-poleret fint glas Pasteur pipette er et vigtigt skridt. Eksperimentatorer forbereder de brandpolerede pipetter med to til tre forskellige diametre og valgte en pipette med en passende diameter. Ved hjælp af denne procedure måles synaptisk frigivelse fra præsynapser fremkaldt af LRRTM2 perler ved levende billeddannelse.Denne yderligere metode vil svare på, om proteinsyntese i axoner er involveret i reguleringen af synaptisk frigivelse. Ved hjælp af denne metode undersøger forskerne, hvordan præsynaptiske proteiner ophobes i præsynapser på en organiseret måde, samt placeringen af kilden til præsynaptiske proteiner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering og Udvidelse af menneskelige glioblastom multiforme tumorceller Brug af Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Undersøqelse DNA-skader i hippocampus neuroner Brug af Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolering og Kultur Mouse Cortikale Astrocytes

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitorisk synapsedannelse i en Co-kultur model, som indeholder GABAerge Medium Langustre neuroner og HEK293-celler stabilt udtrykker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse af Udvikling Tooth Kim innervation Brug Mikrofluid Co-kultur Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-celle måling af lugtstof Receptor aktivering ved hjælp af en Real-time lejr Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live Imaging af primære hjernebarken celler ved hjælp af en 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...