Dit werk wordt deels ondersteund door JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). We danken Dr. terukazu Nogi en MS. Makiko neyazaki (Yokohama City University) voor de vriendelijke verstrekking van biotinyleerd LRRTM2 eiwitten. We bedanken ook Honami Uechi en Rie Ishii voor technische assistentie.

De in dit manuscript beschreven experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn uiteengezet in het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Yokohama City University.
1. bereiding van neuron ballen als hangende druppel cultuur (dagen in vitro (DIV) 0-3)
Opmerking: de hier beschreven procedures voor de bereiding van neuron bal cultuur zijn gebaseerd op de methode eerder gerapporteerd door de Sasaki groep met enkele wijzigingen<sup cla...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

We ontwikkelden een nieuwe methode om presynapse vorming te onderzoeken gestimuleerd met LRRTM2-kralen met behulp van neuron bal cultuur. Momenteel omvat de meeste presynapse formatie assay poly-D-Lysine (PDL)-gecoate kralen en gezien Culture/microfluïdische kamer20,21,22. Een van de voordelen van deze methode is LRRTM2-Beads. Terwijl LRRTM2 samenwerkt met neurexin te vormen excitatory presynapses specifiek11<...

Synapse vorming is een van de kritische stappen tijdens de ontwikkeling van neurale circuits1,2,3. Vorming van synapsen die gespecialiseerde compartimenten zijn samengesteld uit pre-en post synapsen is een complex en meerstaps proces waarbij de juiste herkenning van axonen en dendrites, vorming van actieve zone en postsynaptisch dichtheid, en juiste uitlijning van ion kanalen en neurotransmitter receptoren1,2. In elk proces, vele soorten synaptische eiwitten accumuleren tot deze gespecialiseerde compartimenten in de juiste timing door het vervoeren van synaptische eiwitten uit cellichamen en/of door lokale vertaling in de compartimenten. Deze synaptische eiwitten worden beschouwd als georganiseerd op georganiseerde wijze te vormen functionele synapsen. Dysfunctie van sommige synaptische eiwitten met betrekking tot Synapse vorming resulteert in neurologische aandoeningen4,5. Echter, het blijft onduidelijk hoe synaptische eiwitten accumuleren in de juiste timing.
Om te onderzoeken hoe synaptische eiwitten zich op georganiseerde wijze ophopen, is het noodzakelijk om accumulatie van synaptische eiwitten in chronologische volgorde te onderzoeken. Sommige rapporten toonden Live beeldvorming aan Synapse vorming in de gezien cultuur van neuronen6,7observeren. Het is echter tijdrovend om neuronen te vinden die net Synapse vorming onder microscopie starten. Om accumulatie van synaptische eiwitten efficiënt observeren, Synapse vorming moet beginnen op het moment dat de onderzoekers willen de vorming te induceren. De tweede uitdaging is het onderscheiden van de accumulatie van synaptische eiwitten als gevolg van het transport van cellichamen of lokale vertaling in synapsen. Daartoe moet het Vertaal niveau worden gemeten onder de voorwaarde dat het transport van synaptische eiwitten uit cellichamen niet mogelijk is.
We ontwikkelden nieuwe presynapse formatie assay met behulp van een combinatie van neuron bal cultuur met kralen voor het opwekken van presynapse vorming8. Neuron Ball Culture is ontwikkeld om axonale fenotype te onderzoeken, als gevolg van de vorming van axonale vellen rondom cellichamen9,10. We gebruikten magnetische kralen geconjugeerd met Leucine-rijke herhaalde transmembraan neuronale 2 (LRRTM2) dat is een presynaptische organisator voor het opwekken van excitatory presynapses (Figuur 1a)11,12,13. Door gebruik te maken van de LRRTM2 Beads beginnen presynapse formatie op het moment dat de kralen worden aangebracht. Dit betekent dat presynapse vorming begint in duizenden axonen van een neuron bal op dezelfde tijden, dus het maakt het mogelijk om te onderzoeken precieze tijdsverloop van accumulatie van synaptische eiwitten efficiënt. Bovendien, neuron bal cultuur is gemakkelijk te blokkeren transport synaptische eiwitten uit Soma door het verwijderen van cellichamen (Figuur 1b)8. We hebben al bevestigd dat axonen zonder cellichamen kunnen overleven en ten minste 4 uur gezond zijn na verwijdering van cellichamen. Dus, dit protocol is geschikt om te onderzoeken van waar synaptische eiwitten zijn afgeleid (cel lichaam of Axon), en hoe synaptische eiwitten accumuleren op georganiseerde wijze.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Tijdens neuronale ontwikkeling, Synapse vorming is een belangrijke stap voor het vaststellen van neurale circuits. Om synapsen vormen, synaptische eiwitten moeten worden geleverd in de juiste volgorde door transport van cellichamen en/of lokale vertaling in onrijpe synapsen. Echter, het is niet volledig begrepen hoe synaptische eiwitten accumuleren in de synapsen in de juiste volgorde. Hier presenteren we een nieuwe methode om presynaptische vorming te analyseren door gebruik te maken van de combinatie van neuron balcultuur met kralen om presynapse vorming te induceren. Neuron ballen die neuronale celgranulaten bieden axonale vellen ver van cellichamen en dendrites, zodat zwakke fluorescerende signalen van presynapses kunnen worden gedetecteerd door het vermijden van overweldigende signalen van cellichamen. Als kralen om presynapse vorming te triggeren, gebruiken we kralen die worden geconjugeerd met Leucine-rijke herhalings transmembraan neuronale 2 (LRRTM2), een excitatory presynaptische organisator. Met deze methode hebben we aangetoond dat vesiculaire glutamaat Transporter 1 (vGlut1), een Synaptisch blaasje eiwit, dat in presynapses sneller is opgebouwd dan Munc18-1, een actief zone-eiwit. Munc18-1 geaccumuleerde vertaling-afhankelijk van presynapse zelfs na het verwijderen van cellichamen. Deze bevinding geeft de Munc18-1 accumulatie door lokale vertaling in axonen, niet transport van cellichamen. Concluderend, deze methode is geschikt voor het analyseren van accumulatie van synaptische eiwitten in presynapses en de bron van synaptische eiwitten. Als neuron bal cultuur is eenvoudig en het is niet nodig om speciale apparatuur te gebruiken, deze methode kan worden toegepast op andere experimentele platforms.

Hier tonen we representatieve resultaten van accumulatie van presynaptische eiwitten in LRRTM2-geïnduceerde presynapses van axonale vellen van neuron balcultuur. Als presynaptische eiwitten analyseerden we de excitatory synaptische blaasje Protein vGlut1 en de Active zone Protein Munc18-1. We onderzochten ook de tijdsduur van accumulatie van vGlut1 en Munc18-1 in presynapses, en verkregen resultaten die de bron van Munc18-1 in presynapses met behulp van axonen verwijderen van cellichamen en een eiwitsynthese remmer. Onl...

Watch this Scientific Journal Video about Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and Ã¢â‚¬Å“Neuron BallÃ¢â‚¬Â Culture at JoVE.com

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse vorming is een dynamisch proces, met inbegrip van accumulatie van synaptische eiwitten in de juiste volgorde. Bij deze methode wordt presynapse vorming geactiveerd door kralen geconjugeerd met een presynapse Organizer eiwit op axonale vellen van "neuron Ball" cultuur, zodat accumulatie van synaptische eiwitten gemakkelijk kan worden geanalyseerd tijdens presynapse vorming.

Presynapse vorming assay met Presynapse Organizer kralen en "neuron Ball" cultuur

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Dit protocol is geschikt om te onderzoeken waar presynaptische eiwitten vandaan komen: cellichamen of axonen. En hoe presynaptische eiwitten zich ophopen in presynapses op een georganiseerde manier tijdens de synapsvorming. Deze techniek kan duizenden presynapses tegelijkertijd veroorzaken, en gebruikt geen speciaal apparaat om axonen in cultuur te handhaven toestaand efficiënte analyse van de vorming van vele presynapses in axonen.Samen met afgestudeerde student, Honami, het aantonen van deze procedure zal Rie Ishii, een student in mijn laboratorium. Begin deze procedure met muis euthanasie zoals beschreven in het tekstprotocol. Ontleed de buik om E16 embryo's te verkrijgen.Verwijder de hersenen voorzichtig uit embryo's met behulp van fijngepunte tangen en breng ze over naar 60-millimeter celkweekschotels met vier milliliter HEPES gebufferde zoutoplossing of HBSS. Verwijder de hersenvliezen en snijd de olfactorische bol. Scheid cortices van elke hersenhelft met behulp van de fijne uiteinden van tangen onder de stereomicroscoop en over te dragen aan een andere 60-millimeter schotel met verse HBSS.Gebruik ten minste drie tot vijf embryo's voor elke afzonderlijke neuron bal cultuur. Snijd de cortices in kleine stukjes met microdissecting lente schaar in een laminaire stroom cel cultuur kap. Breng gehakte cortices over naar een buis van 15 milliliter.Probeer de gehakte cortices in vier milliliter van 0,125% trypsine in HBSS gedurende 4,5 minuten in een waterbad bij 37 graden Celsius. Breng de celaggregaten over naar een nieuwe buis van 15 milliliter met 10 milliliter HBSS door een steriele transferpipet. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten voor het herhalen van deze stap nog een keer.Breng vervolgens de celaggregaten over naar een nieuwe buis van 15 milliliter met twee milliliter NGB-medium, 0,01%DNase I en 10%paardenserum. Triturate de trypsinized cortices door herhaaldelijk pipetten ze op en neer drie tot vijf keer met behulp van een brandgepolijste fijn glas Pasteur pipet. Voor de voorbereiding van neuron ballen, pas de celdichtheid in de cel suspensie tot een miljoen cellen per milliliter met behulp van NGB medium.Voeg zeven milliliter PBS toe aan het onderste deel van de kweekgerechten. Kweek de corticale neuronen als 10 microliter hangende druppels met 10.000 cellen per druppel in de bovenste deksels van 10-centimeter cultuurschotels. Bewaar de gerechten drie dagen in een couveuse bij 37 graden Celsius met 5% CO2 onder bevochtigde omstandigheden om neuronbalvorming mogelijk te maken.Coat poly-L-lysine of PLL op de paraffine-kralen glazen deksel slips in 60-millimeter schotels met behulp van een 15 microgram per milliliter PLL oplossing in borate buffer. Bewaar ze minstens een uur in een CO2-incubator op 37 graden Celsius. Breng na het wassen vier keer met PBS de PLL-gecoate afglijders over naar een vierputige plaat met 350 microliter ngb-medium met drie micromolar AraC in elke put.AraC wordt toegevoegd aan de media om delende cellen te doden. Incubeer de vier-put platen met de PLL-gecoate deksel glijdt in de CO2 incubator gedurende ten minste 20 minuten om ervoor te zorgen dat de temperatuur van het medium bereikt 37 graden Celsius voor de overdracht van de neuron ballen. Bij DIV 3 wanneer neuron ballen worden gevormd zeer goed, breng ze op PLL-gecoate cover slips.In de vier-put plaat, voeg vijf neuron ballen per goed. Bij DIV 11 brengen 20 microliter van de suspensie van met streptavidin gecoate magnetische deeltjes naar een microcentrifugebuis. Immobiliseer de kralen op een handgemaakt apparaat bevestigd met neodymium permanente magneten en was drie keer met 100 microliter pbs-MCBC in 1,5-milliliter microcentrifugebuizen.Na het volledig verwijderen van PBS-MCBC uit de kralen, voeg een vooraf bepaald volume van LRRTM2 voorraad aan de gewassen kralen. Incubeer het mengsel met behulp van een rotator op vier graden Celsius gedurende een tot twee uur. Na incubatie, was de kralen twee keer met 100 microliters van PBS-MCBC.Was vervolgens de kralen met 100 microliter van NGB-medium. Resuspend de LRRTM2 kralen in 50 microliters van NGB medium voor toepassing op de neuron bal cultuur. Knip nu het uiteinde van een gele punt onder een hoek van 45 graden met een scheermesje onder de stereomicroscoop.Zet de gele punt einde op de cel lichaam gebied van een neuron bal en verwijder de cel lichamen door zuigkracht. Breng de LRRTM2 en controle kralen op de neuron bal cultuur. Vervolgens dompel de kralen aan de onderkant van de platen van de neuron bal cultuur voor een minuut met behulp van ferriet magneten om pre-synaps vorming te starten.Deze procedure zorgt ervoor dat alle kralen tegelijkertijd worden ge touchdown. Fix en vlek van de neuronen in de neuron bal cultuur na pre-synaps vorming met kralen zoals beschreven in het tekstprotocol. Leg differentiële interferentiecontrast- en immunofluorescentiebeelden vast onder een omgekeerde fluorescerende microscoop met een gekoelde CCD-camera met behulp van een 60X olieonderdompelingslens.Meet de immunofluorescentieintensiteit in pre-synapsen in de axon. Gebruik immunofluorescentieintensiteiten van het interessegebied op kralen. Minus de off kralen regio intensiteit gedeeld door de axonale intensiteit, langs 20 micron van de kralen.Minus achtergrondintensiteit. Deze ratio-intensiteit zorgt voor de eiwitaccumulatie-index. Als u het accumulatieniveau van een bepaald eiwit in een presynapse wilt kwantificeren die is geïnduceerd met LRRTM2-kralen, selecteert u altijd het gebied dat twee gezichtsvelden of meer is, afgezien van het cellichaam.Kies voor nauwkeurige meting vijf verschillende axonale velden per coverslip. Hier is de toepassing van LRRTM2 kralen in neuron bal cultuur op DIV 11 geïnduceerde accumulatie van Munc18-1 in presynapses van axonen van neuron ballen. De kralen op axonen van neuron ballen zijn zichtbaar in de fase microscopie beelden.En de accumulatie van presynaptische eiwitten wordt waargenomen door de immunofluorescentiebeelden. Zelfs in axonen die worden verwijderd cellichamen, accumulatie van Munc18-1 werd waargenomen onder de kralen, vergelijkbaar met axonen van neuron ballen met cellichamen. Toen het perifere gebied van het axonale blad werd geanalyseerd door hoge vergroting objectieve lens, vGlut1 en Munc18-1 duidelijk verzameld in presynapses van axonen onder de kralen met en zonder cellichamen.Time course experimenten toonden aan dat de accumulatie van vGlut1 in presynapses aanzienlijk steeg met 30 minuten. Aan de andere kant, Munc18-1 accumulatie begon aanzienlijk te verhogen op twee uur en bereikte een plateau op vier uur. Deze gegevens geven aan dat het synaptische blaasje eiwit vGlut1 zich ophoopt in presynapses eerder dan het actieve zone-eiwit Munc18-1.De Munc18-1 accumulatie in presynapses van Fmr1-KO neuronen steeg 1,5 keer meer dan die in het wild type, wat wijst op betrokkenheid van FMRP in Munc18-1 accumulatie. Eiwitsynthese remmer, anisomycine, onderdrukt de Munc18-1 accumulatie aanzienlijk in axonen met en zonder cellichamen. Dit geeft aan dat de accumulatie eiwitsynthese afhankelijk is.Pipetten van de trypsinized cortices met behulp van een brandgepolijst fijn glas Pasteur pipet is een belangrijke stap. Experimentatoren bereiden de vuurgepolijste pipetten met twee tot drie verschillende diameters, en kozen voor een pipet met een passende diameter. Met behulp van deze procedure wordt synaptische afgifte van presynapses veroorzaakt door LRRTM2-kralen gemeten door middel van live beeldvorming.Deze aanvullende methode zou beantwoorden of eiwitsynthese in axonen betrokken is bij de regulering van synaptische afgifte. Met behulp van deze methode onderzoeken onderzoekers hoe presynaptische eiwitten zich op een georganiseerde manier ophopen in presynapses, evenals de locatie van de bron van presynaptische eiwitten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Voorbereiding en Cultuur van Chicken Auditieve Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptoren

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...