Ce travail est en partie soutenu par JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (No. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Nous remercions le Dr Terukazu Nogi et Mme Makiko Neyazaki (Yokohama City University) d'avoir gentiment fourni des protéines LRRTM2 biotinylated. Nous remercions également Honami Uechi et Rie Ishii pour leur assistance technique.

Les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées selon les lignes directrices décrites par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de la ville de Yokohama.
1. Préparation des boules de neurone comme culture de chute de pendaison (Jours in vitro (DIV) 0-3)
REMARQUE: Les procédures décrites ici pour la préparation de la culture de la balle neuronale sont basées sur la méthode précédemment rappo...

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	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

Nous avons développé la nouvelle méthode pour examiner la formation de presynapse stimulée avec des perles de LRRTM2 utilisant la culture de boule de neurone. Actuellement, la plupart des tests de formation de presynapse comprennent des perles enduites de poly-D-lysine (PDL) et une culture dissociée/chambre microfluidique20,21,22. L'un des avantages de cette méthode est l'alds LRRTM2. Tandis que LRRTM2 interagit avec la ne...

La formation de Synapse est l'une des étapes critiques pendant le développement des circuits neuronaux1,2,3. La formation de synapses qui sont des compartiments spécialisés composés de pré- et de post-synapses est un processus complexe et en plusieurs étapes impliquant la reconnaissance appropriée des axones et des dendrites, la formation de la zone active et la densité postsynaptique, et l'alignement approprié de canaux ioniques et récepteurs neurotransmetteurs1,2. Dans chaque processus, de nombreux types de protéines synaptiques s'accumulent dans ces compartiments spécialisés au bon moment en transportant des protéines synaptiques à partir de corps cellulaires et/ou par traduction locale dans les compartiments. Ces protéines synaptiques sont considérées comme organisées de manière organisée pour former des synapses fonctionnelles. Dysfonctionnement de certaines protéines synaptiques impliquant la formation de synapse entraîne des maladies neurologiques4,5. Cependant, il reste difficile de savoir comment les protéines synaptiques s'accumulent dans le bon timing.
Pour étudier comment les protéines synaptiques s'accumulent de manière organisée, il est nécessaire d'examiner l'accumulation de protéines synaptiques dans l'ordre chronologique. Quelques rapports ont démontré l'imagerie en direct pour observer la formation de synapse dans la culture dissociée des neurones6,7. Cependant, il est long de trouver des neurones qui commencent juste la formation de synapse sous microscopie. Pour observer efficacement l'accumulation de protéines synaptiques, la formation de synapse doit commencer au moment où les chercheurs veulent induire la formation. Le deuxième défi consiste à distinguer l'accumulation de protéines synaptiques due au transport des corps cellulaires ou à la traduction locale dans les synapses. À cette fin, le niveau de traduction est nécessaire pour être mesuré dans la condition qui ne permet pas le transport des protéines synaptiques à partir des corps cellulaires.
Nous avons développé le nouveau presynapse formation d'essayer utilisant la combinaison de la culture de boule de neurone avec des perles pour induire la formation de presynapse8. La culture de boule de neurone est développée pour examiner le phénotype axonal, dû à la formation des feuilles axonales entourant des corps cellulaires9,10. Nous avons utilisé des perles magnétiques conjuguées avec le neuromembrane de transmembrane répéter laleucine-riche 2 (LRRTM2) qui est un organisateur presynaptic pour induire des presynapses excitatrices (figure 1A)11,12,13. En utilisant les perles LRRTM2, la formation de présynapse commence au moment où les perles sont appliquées. Cela signifie que la formation de présynapse commence dans des milliers d'axones d'une boule de neurone en même temps, ce qui permet d'examiner le cours précis du temps de l'accumulation de protéines synaptiques efficacement. En outre, la culture de boule de neurone est facile de bloquer les protéines synaptiques de transport de soma en enlevant des corps cellulaires (figure 1B)8. Nous avons déjà confirmé que les axones sans corps cellulaires peuvent survivre et sont en bonne santé au moins 4 h après l'ablation des corps cellulaires. Ainsi, ce protocole est approprié pour étudier d'où les protéines synaptiques sont dérivées (corps cellulaire ou axone), et comment les protéines synaptiques s'accumulent de manière organisée.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Pendant le développement neuronal, la formation de synapse est une étape importante pour établir des circuits neuraux. Pour former des synapses, les protéines synaptiques doivent être fournies dans l'ordre approprié par transport à partir de corps cellulaires et/ou par traduction locale dans des synapses immatures. Cependant, il n'est pas entièrement compris comment les protéines synaptiques s'accumulent dans les synapses dans l'ordre approprié. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour analyser la formation presynaptique en utilisant la combinaison de la culture de boule de neurone avec des perles pour induire la formation de presynapse. Les boules de neurones qui sont des agrégats cellulaires neuronaux fournissent des feuilles axonales loin des corps cellulaires et des dendrites, de sorte que les signaux fluorescents faibles des presynapses peuvent être détectés en évitant les signaux accablants des corps cellulaires. Comme perles pour déclencher la formation de presynapse, nous utilisons des perles conjuguées avec le neuromembrane de transmembrane de répétition leucine-riche 2 (LRRTM2), un organisateur presynaptic excitateur. En utilisant cette méthode, nous avons démontré que le transporteur vésiculaire de glutamate 1 (vGlut1), une protéine synaptique de vésicule, s'est accumulé dans les presynapses plus rapidement que Munc18-1, une protéine active de zone. Munc18-1 a accumulé la traduction-dépendant dans la presynapse même après avoir enlevé des corps cellulaires. Cette constatation indique l'accumulation de Munc18-1 par traduction locale dans les axones, et non par le transport des corps cellulaires. En conclusion, cette méthode convient pour analyser l'accumulation de protéines synaptiques dans les presynapses et la source de protéines synaptiques. Comme la culture neuronale est simple et qu'il n'est pas nécessaire d'utiliser un appareil spécial, cette méthode pourrait s'appliquer à d'autres plates-formes expérimentales.

Ici, nous montrons des résultats représentatifs de l'accumulation des protéines presynaptiques dans les presynapses LRRTM2-induites des feuilles axonales de la culture de boule de neurone. En tant que protéines presynaptiques, nous avons analysé la protéine synaptique excitatrice de vésicule vGlut1 et la protéine de zone active Munc18-1. Nous avons également examiné le cours de temps de l'accumulation de vGlut1 et de Munc18-1 dans les presynapses, et avons obtenu des résultats indiquant la source de Munc18-1 d...

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Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

La formation de presynapse est un processus dynamique comprenant l'accumulation de protéines synaptiques dans l'ordre approprié. Dans cette méthode, la formation de presynapse est déclenchée par des perles conjuguées avec une protéine d'organisateur de presynapse sur des feuilles axonales de la culture de « boule de neurone », de sorte que l'accumulation des protéines synaptiques soit facile à analyser pendant la formation de presynapse.

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and "Neuron Ball" Culture

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Ce protocole est approprié pour étudier d’où proviennent les protéines présynaptiques : corps cellulaires ou axones. Et comment les protéines présynaptiques s’accumulent dans les présynapses d’une manière organisée pendant la formation de synapse. Cette technique peut induire des milliers de présynapses en même temps, et n’utilise aucun appareil spécial pour maintenir les axones dans la culture permettant une analyse efficace de la formation de nombreuses présynapses dans les axones.Avec l’étudiant diplômé, Honami, démontrant cette procédure sera Rie Ishii, un étudiant de premier cycle dans mon laboratoire. Commencez cette procédure par l’euthanasie de souris telle que décrite dans le protocole de texte. Disséquer l’abdomen pour obtenir des embryons E16.Retirez soigneusement le cerveau des embryons à l’aide de forceps à pointe fine et transférez-les dans des plats de culture cellulaire de 60 millimètres contenant quatre millilitres de solution de sel tamponnée HEPES ou HBSS. Retirer les méninges et couper l’ampoule olfactive. Séparez les cortices de chaque hémisphère cérébral à l’aide des extrémités fines des forceps sous le microscope stéréo et transférez-les dans un autre plat de 60 millimètres contenant du HBSS frais.Utilisez au moins trois à cinq embryons pour chaque culture distincte de boule de neurone. Couper les cortices en petits morceaux avec des ciseaux à ressort microdissecting dans une hotte de culture cellulaire à écoulement laminaire. Maintenant, transférez des cortices hachés dans un tube de 15 millilitres.Essayez de trypsiniser les cortices hachés en quatre millilitres de trypsine de 0,125% dans HBSS pendant 4,5 minutes dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Transférer les agrégats cellulaires dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS par une pipette de transfert stérile. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de répéter cette étape une fois de plus.Ensuite, transférez les agrégats cellulaires dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de NGB moyen, 0,01%DNase I, et 10% sérum cheval. Triturer les cortices trypsinized en les pipetting à plusieurs reprises de haut en bas trois à cinq fois à l’aide d’une pipette pasteur en verre fin poli par le feu. Pour la préparation des boules de neurone, ajustez la densité cellulaire dans la suspension cellulaire à un million de cellules par millilitre à l’aide du milieu NGB.Ajouter sept millilitres de PBS à la partie inférieure des plats de culture. Culture des neurones corticals comme des gouttes suspendues de 10 microlitres contenant 10 000 cellules par goutte à l’intérieur des couvercles supérieurs des plats de culture de 10 centimètres. Gardez la vaisselle dans un incubateur pendant trois jours à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 dans des conditions humidifiées pour permettre la formation de boule de neurone.Enrober la poly-L-lysine ou la PLL sur le couvercle en verre perlé de paraffine glisse dans des plats de 60 millimètres à l’aide d’une solution PLL de 15 microgrammes par millilitre dans un tampon borate. Conservez-les pendant au moins une heure dans un incubateur de CO2 à 37 degrés Celsius. Après avoir été lavé quatre fois avec du PBS, transférer les feuillets de couvercle recouverts de PLL dans une plaque de quatre puits contenant 350 microlitres de milieu NGB avec trois micromolaires AraC dans chaque puits.AraC est ajouté aux médias pour tuer les cellules de division. Incuber les plaques à quatre puits contenant les glissements de couverture recouverts de PLL dans l’incubateur de CO2 pendant au moins 20 minutes pour s’assurer que la température du milieu atteint 37 degrés Celsius avant de transférer les boules de neurone. À DIV 3 lorsque les boules de neurone sont très bien formées, transférez-les sur des feuillets de couverture recouverts de PLL.À l’intérieur de la plaque de quatre puits, ajouter cinq boules de neurone par puits. Au DIV 11 transférer 20 microlitres de la suspension des particules magnétiques enduites de streptavidine à un tube de microcentrifugeuse. Immobiliser les perles à un appareil fait main attaché avec des aimants permanents au néodymium et laver trois fois avec 100 microlitres de PBS-MCBC dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Après avoir complètement retiré PBS-MCBC des perles, ajouter un volume prédéterminé de bouillon LRRTM2 aux perles lavées. Incuber le mélange à l’aide d’un rotateur à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures. Après l’incubation, laver les perles deux fois avec 100 microlitres de PBS-MCBC.Ensuite, laver les perles avec 100 microlitres de NGB moyen. Resuspendez les perles LRRTM2 dans 50 microlitres de milieu NGB pour application à la culture de boule de neurone. Maintenant, coupez l’extrémité d’une pointe jaune à angle de 45 degrés avec une lame de rasoir sous le microscope stéréo.Mettez l’extrémité jaune sur la zone du corps cellulaire d’une boule de neurone et retirez les corps cellulaires par aspiration. Appliquez le LRRTM2 et contrôlez les perles sur la culture de boule de neurone. Puis submergez les perles au fond des plaques de la culture de boule de neurone pendant une minute utilisant des aimants de ferrite pour commencer la formation de pré-synapse.Cette procédure garantit de toucher toutes les perles en même temps. Fixer et tacher les neurones dans la culture de boule de neurone après formation de pré-synapse avec des perles comme décrit dans le protocole de texte. Capturez des images différentielle de contraste d’interférence et d’immunofluorescence sous un microscope fluorescent inversé à l’aide d’une caméra CCD refroidie à l’aide d’une lentille d’immersion d’huile 60X.Mesurer l’intensité de l’immunofluorescence dans les pré-synapses de l’axon. Utiliser des intensités d’immunofluorescence de la région d’intérêt sur les perles. Moins l’intensité de la région des perles coupées divisée par l’intensité axonale, le long de 20 microns des perles.Moins l’intensité de fond. Cette intensité de ratio fournit l’indice d’accumulation de protéines. Pour quantifier le niveau d’accumulation d’une protéine particulière dans une présynapse induite par des perles LRRTM2, sélectionnez toujours la zone qui est deux champs de vision ou plus en dehors du corps cellulaire.Pour une mesure précise, choisissez cinq champs axonals différents par coverslip. Montré ici est l’application de perles LRRTM2 dans la culture de boule de neurone à DIV 11 accumulation induite de Munc18-1 dans les présynapses d’axones de boules de neurone. Les perles sur les axones des boules de neurone sont visibles dans les images de microscopie de phase.Et l’accumulation de protéines présynaptiques sont observées par les images d’immunofluorescence. Même chez les axones qui sont enlevés corps cellulaires, l’accumulation de Munc18-1 a été observée sous les perles, semblable aux axones de boules de neurone avec des corps cellulaires. Lorsque la région périphérique de la feuille axonale a été analysée par objectif de grossissement élevé, vGlut1 et Munc18-1 se sont accumulés clairement dans les présynapses d’axones sous les perles avec et sans corps cellulaires.Les expériences de cours du temps ont démontré que l’accumulation de vGlut1 dans les présynapses a augmenté de manière significative à 30 minutes. D’autre part, munc18-1 accumulation a commencé à augmenter de façon significative à deux heures et a atteint un plateau à quatre heures. Ces données indiquent que la protéine vésicule synaptique vGlut1 s’accumule dans les présynapses plus tôt que la protéine de zone active Munc18-1.L’accumulation de Munc18-1 dans les présynapses des neurones Fmr1-KO a augmenté 1,5 fois plus que celles de type sauvage, ce qui indique la participation du FMRP à l’accumulation de Munc18-1. L’inhibiteur de synthèse de protéine, anisomycine, a supprimé l’accumulation munc18-1 de manière significative dans les axones avec et sans corps cellulaire. Cela indique que l’accumulation dépend de la synthèse des protéines.Pipetting les cortices trypsinized utilisant une pipette pasteur en verre fin poli par le feu est une étape importante. Les expérimentateurs préparent les pipettes polies au feu de deux à trois diamètres différents, et choisissent une pipette d’un diamètre approprié. À l’aide de cette procédure, la libération synaptique des présynapses induites par les perles LRRTM2 est mesurée par imagerie vivante.Cette méthode supplémentaire répondrait si la synthèse des protéines dans les axones est impliquée dans la régulation de la libération synaptique. À l’aide de cette méthode, les chercheurs examinent comment les protéines présynaptiques s’accumulent en présynapses de manière organisée, ainsi que l’emplacement de la source de protéines présynaptiques.

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