Diese Arbeit wird teilweise von JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (Nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) unterstützt. Wir danken Dr. Terukazu Nogi und Frau Makiko Neyazaki (Yokohama City University) für die freundliche Bereitstellung von biotinyliertem LRRTM2-Protein. Wir danken auch Honami Uechi und Rie Ishii für die technische Unterstützung.

Die in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden gemäß den Richtlinien durchgeführt, die im Institutional Animal Care and Use Committee der Yokohama City University beschrieben wurden.
1. Vorbereitung von Neuronenkugeln als hängende Tropfenkultur (Tage in vitro (DIV) 0-3)
HINWEIS: Die hier beschriebenen Verfahren zur Vorbereitung der Neuronenkugelkultur basieren auf der Methode, die zuvor von der Sasaki-Gruppe mit einigen Modifikationen<sup class...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Untersuchung der Präsynapse-Bildung, die mit LRRTM2-Perlen mit Neuronenballkultur stimuliert wurde. Derzeit umfasst der größte Teil des Präsynapse-Formations-Assays Poly-D-Lysin (PDL)-beschichtete Perlen und dissoziierte Kultur/Mikrofluidische Kammer20,21,22. Einer der Vorteile dieser Methode ist LRRTM2-Perlen. Während LRRTM2 interagiert mit Neurexin, um exzitatorische Präsynapse...

Synapse-Bildung ist einer der kritischen Schritte bei der Entwicklung von neuronalen Schaltkreisen1,2,3. Die Bildung von Synapsen, die spezialisierte Kompartimente sind, die aus Prä- und Post-Synapsen bestehen, ist ein komplexer und mehrstufiger Prozess, der eine angemessene Erkennung von Axonen und Dendriten, die Bildung von aktiver Zone und postsynaptischen Dichte und die richtige Ausrichtung der Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren1,2. In jedem Prozess akkumulieren viele Arten von synaptischen Proteinen in diesen speziellen Fächern im richtigen Timing, indem sie synaptische Proteine aus Zellkörpern und/oder durch lokale Übersetzung in den Kompartimenten transportieren. Diese synaptischen Proteine gelten als organisiert angeordnet, um funktionelle Synapsen zu bilden. Dysfunktion einiger synaptischer Proteine mit Synapsenbildung führt zu neurologischen Erkrankungen4,5. Es bleibt jedoch unklar, wie sich synaptische Proteine im richtigen Timing ansammeln.
Um zu untersuchen, wie sich synaptische Proteine in organisierter Weise ansammeln, ist es notwendig, die Ansammlung synaptischer Proteine in chronologischer Reihenfolge zu untersuchen. Einige Berichte zeigten Live-Bildgebung, um synapsische Bildung in dissoziierten Kultur der Neuronen zu beobachten6,7. Es ist jedoch zeitaufwändig, Neuronen zu finden, die gerade die Synapsenbildung unter der Mikroskopie beginnen. Um die Ansammlung synaptischer Proteine effizient zu beobachten, muss die Synapsenbildung zu dem Zeitpunkt beginnen, zu dem Forscher die Bildung induzieren wollen. Die zweite Herausforderung besteht darin, die Ansammlung synaptischer Proteine durch den Transport von Zellkörpern oder die lokale Übersetzung in Synapsen zu unterscheiden. Zu diesem Zweck ist die Translationsebene unter der Bedingung zu messen, dass der Transport von synaptischen Proteinen aus Zellkörpern nicht erlaubt ist.
Wir entwickelten neuartigen Presynapse-Formationstest mit Kombination von Neuronenballkultur mit Perlen, um die Präsynapsebildung zu induzieren8. Neuronenkugelkultur wurde entwickelt, um axonalen Phänotyp zu untersuchen, aufgrund der Bildung von axonalen Blättern um Zellkörper9,10. Wir verwendeten magnetische Perlen konjugiert mit Leucin-reichen Wiederholungtransmembran neuronal 2 (LRRTM2), die ein präsynaptischer Organisator ist, um erregende Präsynapsen zu induzieren (Abbildung 1A)11,12,13. Durch die Verwendung der LRRTM2-Perlen beginnt die Präsynapsebildung zu dem Zeitpunkt, zu dem die Perlen aufgetragen werden. Dies bedeutet, dass die Präsynapsebildung in Tausenden von Axonen eines Neuronenballs zu gleichen Zeiten beginnt, so dass es ermöglicht, den genauen Zeitverlauf der Ansammlung synaptischer Proteine effizient zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Neuronenkugelkultur einfach, den Transport synaptischer Proteine aus dem Soma zu blockieren, indem Zellkörper entfernt werden (Abbildung 1B)8. Wir haben bereits bestätigt, dass Axone ohne Zellkörper überleben können und mindestens 4 h nach Entfernung von Zellkörpern gesund sind. Daher ist dieses Protokoll geeignet, um zu untersuchen, woher synaptische Proteine abgeleitet werden (Zellkörper oder Axon), und wie sich synaptische Proteine organisiert ansammeln.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Während der neuronalen Entwicklung ist die Synapsenbildung ein wichtiger Schritt, um neuronale Schaltkreise zu etablieren. Um Synapsen zu bilden, müssen synaptische Proteine in geeigneter Reihenfolge durch Transport von Zellkörpern und/oder lokale Übersetzung in unreife Synapsen geliefert werden. Jedoch, Es ist nicht vollständig verstanden, wie synaptische Proteine in Synapsen in der richtigen Reihenfolge ansammeln. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Analyse der präsynaptischen Bildung vor, indem wir die Kombination von Neuronenballkultur mit Perlen verwenden, um die Präsynapsebildung zu induzieren. Neuronenkugeln, die neuronale Zellaggregate sind, liefern axonale Blätter weit weg von Zellkörpern und Dendriten, so dass schwache fluoreszierende Signale von Präsynapsen erkannt werden können, indem überwältigende Signale von Zellkörpern vermieden werden. Als Perlen, um die präsynapsische Bildung auszulösen, verwenden wir Perlen, die mit Leucin-reichem Repeat-Transmembran-Neuronal 2 (LRRTM2), einem exzitatorischen präsynaptischen Organisator, konjugiert sind. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass vesikulärer Glutamattransporter 1 (vGlut1), ein synaptisches Vesikelprotein, sich in Präsynapsen schneller angesammelt hat als Munc18-1, ein Wirkstoffzonenprotein. Munc18-1 akkumulierte auch nach dem Entfernen von Zellkörpern übersetzungsabhängig in Presynapse. Dieser Befund deutet auf die Munc18-1 Akkumulation durch lokale Übersetzung in Axonen hin, nicht durch Transport von Zellkörpern. Zusammenfassend ist diese Methode geeignet, die Ansammlung von synaptischen Proteinen in Präsynapsen und quelle von synaptischen Proteinen zu analysieren. Da die Neuronenballkultur einfach ist und es nicht notwendig ist, spezielle Geräte zu verwenden, könnte diese Methode auf andere experimentelle Plattformen anwendbar sein.

Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse der Anhäufung von präsynaptischen Proteinen in LRRTM2-induzierten Präsynapsen von axonalen Blättern der Neuronenkugelkultur. Als präsynaptische Proteine analysierten wir das exzitatorische synaptische Vesikelprotein vGlut1 und das Wirkstoffzonenprotein Munc18-1. Wir untersuchten auch den Zeitlichen Verlauf der Akkumulation von vGlut1 und Munc18-1 in Presynapsen und erzielten Ergebnisse, die die Quelle von Munc18-1 in Presynapsen mit Axonen, die Zellkörper entfernen, und ei...

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Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse Bildung ist ein dynamischer Prozess einschließlich der Ansammlung von synaptischen Proteinen in der richtigen Reihenfolge. Bei dieser Methode wird die Präsynapsebildung durch Perlen ausgelöst, die mit einem präsynapsischen Organizerprotein auf axonalen Blättern der "Neuronball"-Kultur konjugiert werden, so dass die Ansammlung synaptischer Proteine während der Präsynapsebildung leicht zu analysieren ist.

Presynapse Formation Assay mit Presynapse Organizer Perlen und "Neuron Ball" Kultur

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Dieses Protokoll eignet sich, um zu untersuchen, woher präsynaptische Proteine stammen: Zellkörper oder Axone. Und wie sich präsynaptische Proteine während der Synapsenbildung in Präsynapsen organisiert ansammeln. Diese Technik kann Tausende von Präsynapsen zur gleichen Zeit induzieren, und verwendet keine speziellen Geräte, um Axone in der Kultur zu erhalten, was eine effiziente Analyse der Bildung vieler Präsynapsen in Axonen ermöglicht.Zusammen mit dem Doktoranden Honami, der dieses Verfahren demonstriert, wird Rie Ishii, ein Student in meinem Labor sein. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Euthanasie der Maus, wie im Textprotokoll beschrieben. Sezieren Sie den Bauch, um E16-Embryonen zu erhalten.Entfernen Sie die Gehirne von Embryonen vorsichtig mit Hilfe von feinspitzen Zangen, und übertragen Sie sie in 60-Millimeter-Zellkultur-Gerichte mit vier Milliliter HEPES gepufferte Salzlösung oder HBSS. Entfernen Sie die Meninges und schneiden Sie die Olfaktor-Lampe. Trennen Sie Kortiken von jeder zerebralen Hemisphäre mit den feinen Spitzen der Zange unter dem Stereomikroskop und übertragen Sie auf eine andere 60-Millimeter-Schale mit frischem HBSS.Verwenden Sie mindestens drei bis fünf Embryonen für jede einzelne Neuronenkugelkultur. Schneiden Sie die Kortiken in kleine Stücke mit mikrosezierenden Federscheren in einer laminaren Flow Cell Culture Kapuze. Nun, übertragen Gehackte Kortiken auf eine 15-Milliliter-Röhre.Versuchen Sie die gehackten Kortices in vier Milliliter von 0,125%Trypsin in HBSS für 4,5 Minuten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Zellaggregate durch eine sterile Transferpipette in ein neues 15-Milliliter-Rohr mit 10 MilliliterHBSS. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, bevor Sie diesen Schritt ein anderes Mal wiederholen.Übertragen Sie dann die Zellaggregate in ein neues 15-Milliliter-Rohr, das zwei Milliliter NGB-Medium, 0,01%DNase I und 10% Pferdeserum enthält. Trituieren Sie die trypsinisierten Kortiken, indem Sie sie mit einer feuerpolierten Pasteurpipetette aus feinem Glas immer wieder drei- bis fünfmal nach oben und unten pfeifen. Passen Sie für die Herstellung von Neuronenkugeln die Zelldichte in der Zellsuspension mit NGB-Medium auf eine Million Zellen pro Milliliter an.Fügen Sie sieben Milliliter PBS in den unteren Teil der Kulturgerichte. Kultur die kortikalen Neuronen als 10 Mikroliter hängende Tropfen mit 10.000 Zellen pro Tropfen in den oberen Deckeln von 10-Zentimeter-Kulturgerichte. Halten Sie die Gerichte in einem Brutkasten für drei Tage bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 unter befeuchteten Bedingungen, um Neuronenkugelbildung zu ermöglichen.Mantel Poly-L-Lysin oder PLL auf die Paraffin-Perlen-Glasabdeckung rutscht in 60-Millimeter-Schalen mit einer 15 Mikrogramm pro Milliliter PLL-Lösung in Boratpuffer. Halten Sie sie mindestens eine Stunde in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius auf. Nach dem viermaligen Waschen mit PBS die PLL-beschichteten Abdeckungsscheine auf eine Vier-Well-Platte mit 350 Mikroliter NGB-Medium mit jeweils drei Mikromolaren AraC in jedem Brunnen übertragen.AraC wird den Medien hinzugefügt, um teilende Zellen abzutöten. Die Vier-Brunnen-Platten mit den PLL-beschichteten Abdeckungsrutschen im CO2-Inkubator für mindestens 20 Minuten inkubieren, um sicherzustellen, dass die Temperatur des Mediums 37 Grad Celsius erreicht, bevor die Neuronenkugeln übertragen werden. Bei DIV 3, wenn Neuronkugeln sehr gut ausgebildet sind, übertragen Sie sie auf PLL-beschichtete Abdeckungsslips.Innerhalb der Vier-Well-Platte, fügen Sie fünf Neuronkugeln pro Brunnen. Bei DIV 11 20 Mikroliter von der Suspension von Streptavidin-beschichteten Magnetpartikeln in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Immobilisieren Sie die Perlen zu einem handgefertigten Gerät, das mit Neodym-Permanentmagneten befestigt ist, und waschen Sie dreimal mit 100 MikroliterPBS-MCBC in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren.Nachdem Sie PBS-MCBC vollständig aus den Perlen entfernt haben, fügen Sie den gewaschenen Perlen ein vorgegebenes Volumen an LRRTM2-Lager hinzu. Inkubieren Sie die Mischung mit einem Rotator bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Stunden. Waschen Sie die Perlen nach der Inkubation zweimal mit 100 MikroliterPBS-MCBC.Dann waschen Sie die Perlen mit 100 Mikroliter NGB Medium. Setzen Sie die LRRTM2 Perlen in 50 Mikroliter NGB Medium für die Anwendung auf die Neuronenballkultur. Schneiden Sie nun das Ende einer gelben Spitze im 45-Grad-Winkel mit einer Rasierklinge unter dem Stereomikroskop.Setzen Sie das gelbe Spitzenende auf den Zellkörperbereich eines Neuronenballs und entfernen Sie die Zellkörper durch Absaugen. Tragen Sie die LRRTM2 und Kontrollperlen auf die Neuronenballkultur. Dann tauchen Sie die Perlen auf den Boden der Platten der Neuronenkugelkultur für eine Minute mit Ferrit-Magneten, um die Vor-Synapse-Bildung zu starten.Dieses Verfahren sorgt dafür, dass alle Perlen gleichzeitig touchdown. Fixieren und färben Sie die Neuronen in der Neuronenballkultur nach der Präsynapsenbildung mit Perlen, wie im Textprotokoll beschrieben. Erfassen Sie Differentialinterferenzkontrast- und Immunfluoreszenzbilder unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einer gekühlten CCD-Kamera mit einer 60-fachen Öl-Tauchlinse.Messen Sie die Immunfluoreszenzintensität in Vorsynapsen im Axon. Verwenden Sie Immunfluoreszenzintensitäten der Region von Interesse auf Perlen. Minus die Off-Perlen-Region Intensität geteilt durch die axonale Intensität, entlang 20 Mikrometer von den Perlen.Minus Hintergrundintensität. Diese Verhältnisintensität liefert den Proteinakkumulationsindex. Um den Akkumulationsgrad eines bestimmten Proteins in einer mit LRRTM2-Perlen induzierten Präsynapse zu quantifizieren, wählen Sie immer den Bereich aus, der zwei Sichtfelder oder mehr apart, außer dem Zellkörper.Wählen Sie für eine genaue Messung fünf verschiedene Axonfelder pro Deckslip aus. Gezeigt wird hier die Anwendung von LRRTM2-Perlen in die Neuronenballkultur bei DIV 11 induzierte Akkumulation von Munc18-1 in Vorsynapsen von Axonen von Neuronenkugeln. Die Perlen auf Axonen von Neuronenkugeln sind in den Phasenmikroskopiebildern sichtbar.Und die Anhäufung von präsynaptischen Proteinen wird durch die Immunfluoreszenzbilder beobachtet. Selbst bei Axonen, die zellkörperentfernt sind, wurde die Ansammlung von Munc18-1 unter den Perlen beobachtet, ähnlich wie Axone von Neuronenkugeln mit Zellkörpern. Als die periphere Region des Axonalblattes mit einer objektiven Linse mit hoher Vergrößerung analysiert wurde, akkumulierten sich vGlut1 und Munc18-1 deutlich in Vorsynapen von Axonen unter den Perlen mit und ohne Zellkörper.Zeitverlaufsexperimente zeigten, dass die Ansammlung von vGlut1 in Presynapsen nach 30 Minuten signifikant zunahm. Auf der anderen Seite begann die Akkumulation von Munc18-1 nach zwei Stunden deutlich zuzunehmen und erreichte ein Plateau mit vier Stunden. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich das synaptische Vesikelprotein vGlut1 in Vorsynapsen früher als das Wirkstoffprotein Munc18-1 ansammelt.Die Munc18-1 Akkumulation in Presynapsen von Fmr1-KO Neuronen stieg 1,5 mal mehr als diejenigen in wildem Typ, was auf die Beteiligung von FMRP in Munc18-1 Akkumulation. Proteinsynthesehemmer, Anisomycin, unterdrückte die Munc18-1-Akkumulation signifikant in Axonen mit und ohne Zellkörper. Dies deutet darauf hin, dass die Akkumulation proteinsyntheseabhängig ist.Ein wichtiger Schritt ist das Pipettieren der trypsinisierten Kortiken mit einer feuerpolierten Pasteurpipetten-Pipette aus feinem Glas. Die Experimentatoren bereiten die feuerpolierten Pipetten mit zwei bis drei verschiedenen Durchmessern vor und wählen eine Pipette mit einem entsprechenden Durchmesser. Mit diesem Verfahren wird die synaptische Freisetzung von Präsynapsen, die durch LRRTM2-Perlen induziert werden, durch Live-Bildgebung gemessen.Diese zusätzliche Methode würde beantworten, ob die Proteinsynthese in Axonen an der Regulierung der synaptischen Freisetzung beteiligt ist. Mit dieser Methode untersuchen die Forscher, wie sich präsynaptische Proteine in Präsynapsen in organisierter Weise ansammeln, sowie die Lage der Quelle von präsynaptischen Proteinen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

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Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

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Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

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