עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי JSPS גרנט-in-סיוע עבור מחקר מדעי (KAKENHI) (C) (מס ' 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). אנו מודים לד ר טרוקקאזא נוג'י ולגב מקקיקו ניוזאקי (אונ' יוקוהמה סיטי) באדיבות LRRTM2 חלבון biotinylated. אנו מודים גם לחונלי וואיצ'י ולרי אישיי לקבלת סיוע טכני.

הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו על פי ההנחיות המפורטות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ובוועדת השימוש של האוניברסיטה העירונית של יוקוהמה.
1. הכנת כדורי תא העצב כתרבות תלייה תלויה (ימים במבחנה (DIV) 0-3)
הערה: ההליכים המתוארים כאן להכנת התרבות כדור העצב מבוססים ע?...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

פיתחנו שיטה הרומן לבחון היווצרות preסינפסה מגורה עם LRRTM2-חרוזים באמצעות תרבות כדור העצב. כיום, רוב שיטת היווצרות טרום-סינפסה כוללת מחרוזות מצופות פולי-ליזין (PDL) והתרבות המונתק/חדר מיקרופלואידיג20,21,22. אחד היתרונות של שיטה זו הוא LRRTM2 חרוזים. ב...

היווצרות סינפסה הוא אחד מהצעדים הקריטיים במהלך פיתוח מעגלים עצביים1,2,3. היווצרות של הסינפסות כי הם תאים מיוחדים מורכב pre-לאחר הסינפסות הוא תהליך מורכב רב מעורבים הכרה מתאימה של אקסונים ו דנדריטים, היווצרות אזור פעיל צפיפות פוסט סינפטית, ויישור נאות של ערוצי יון וקולטני נוירוטרנסמיטר1,2. בכל תהליך, סוגים רבים של חלבונים סינפטית להצטבר אלה תאים מיוחדים בעיתוי הנכון על ידי הובלת חלבונים סינפטית מגופי התא ו/או על ידי תרגום מקומי בתאים. חלבונים סינפטית אלה נחשבים מסודרים באופן מאורגן כדי ליצור סינפסות תפקודית. תפקוד של כמה חלבונים סינפטיות מעורבים היווצרות סינפסה תוצאות מחלות נוירולוגיות4,5. עם זאת, זה עדיין לא ברור איך חלבונים סינפטית מצטברים בעיתוי הנכון.
כדי לחקור כיצד מצטברים חלבונים סינפטיים באופן מאורגן, יש צורך לבחון את הצטברות החלבונים הסינפטית בסדר כרונולוגי. דיווחים מסוימים הפגינו הדמיה חיה כדי לבחון את היווצרות סינפסה בתרבות המונתק של נוירונים6,7. עם זאת, זה זמן רב למצוא נוירונים אשר רק להתחיל היווצרות סינפסה תחת מיקרוסקופ. כדי להתבונן הצטברות של חלבונים סינפטית ביעילות, היווצרות סינפסה חייב להתחיל בזמן שבו החוקרים רוצים לגרום להיווצרות. האתגר השני הוא להבחין הצטברות של חלבונים סינפטית עקב הובלה של גופי תאים או תרגום מקומי בסינפסות. לצורך זה, רמת התרגום הכרחית למדידה במצב שאינו מאפשר העברה של חלבונים סינפטית מגופי התא.
פיתחנו הרומן טרום הסינפסה היווצרות באמצעות שילוב של תרבות כדור העצב עם חרוזים כדי לגרום preסינפסה היווצרות8. כדור תא העצב תרבות מפותח כדי לבחון האקסון האקאליות, בשל היווצרות של גיליונות סיבי המקיפים גופים תא9,10. השתמשנו חרוזים מגנטיים מצועם עם לוקיצין עשיר לחזור על הקרום העצבי 2 (LRRTM2) כי הוא מארגן טרום סינפטיות כדי לגרום הפרסינפסות מרגש (איור 1a)11,12,13. באמצעות חרוזי LRRTM2, היווצרות preסינפסה להתחיל בזמן כאשר החרוזים מוחלים. משמעות הדבר היא כי היווצרות preסינפסה מתחיל באלפי אקסונים של כדור עצב באותו זמן, ובכך הוא מאפשר לבחון את הזמן המדויק של הצטברות של חלבונים סינפטית ביעילות. בנוסף, התרבות כדור העצב הוא קל לחסום התחבורה חלבונים סינפטית מ סומה על ידי הסרת גופי תא (איור 1B)8. כבר אישרו כי אקסונים ללא גופים תא יכול לשרוד הם בריאים לפחות 4 h לאחר ההסרה של גופות תאים. כך, פרוטוקול זה מתאים לחקור מאיפה חלבונים סינפטיות נגזרות (גוף תא או axon), וכיצד חלבונים סינפטית להצטבר באופן מאורגן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

במהלך פיתוח עצבי, היווצרות סינפסה. הוא צעד חשוב להקמת מעגלים עצביים כדי ליצור סינפסות, חלבונים סינפטית חייבים להיות מסופקים בסדר המתאים על ידי הובלה של גופי תא ו/או תרגום מקומי בסינפסות בלתי ילדותית. עם זאת, זה לא באופן מלא להבין איך חלבונים סינפטית להצטבר הסינפסות בסדר הנכון. כאן, אנו מציגים שיטה הרומן לנתח היווצרות טרום סינפטיות באמצעות שילוב של תרבות כדור העצב עם חרוזים כדי לגרום להיווצרות preסינפסה. כדורי תא העצב כי הוא אגרגטים עצביים התא לספק גיליונות סיבי הרחק גופי התא ו דנדריטים, כך אותות פלורסנט חלשה של טרום הסינפסות ניתן לזהות על ידי הימנעות אותות מכריע של גופי תא. כמו חרוזים כדי להפעיל את היווצרות preסינפסה, אנו משתמשים חרוזים מצועם עם לוקיצין עשיר לחזור על הקרום העצבי 2 (LRRTM2), מארגן presynapse מדומה. באמצעות שיטה זו, הדגמנו כי מנשא גלוטמט vesicular 1 (vGlut1), חלבון שלפוחית סינפטית, שנצבר מראש מהיר יותר מאשר Munc18-1, חלבון אזור פעיל. Munc18-1 מצטבר תרגום-בהתלהבות בקדם-סינפסה גם לאחר הסרת גופי תאים. ממצא זה מצביע על הצטברות Munc18-1 על-ידי תרגום מקומי באקסונים, לא הובלה מגופי תאים. לסיכום, שיטה זו מתאימה לנתח הצטברות של חלבונים סינפטית בטרום הסינפסות ומקור של חלבונים סינפטית. כמו תרבות כדור העצב היא פשוטה ואין צורך להשתמש מכשירים מיוחדים, שיטה זו יכולה להיות ישימה פלטפורמות ניסיוני אחרים.

כאן, אנו מראים את התוצאות הנציגים של הצטברות של חלבונים טרום סינפטיות בLRRTM2 המושרה של גיליונות סיבי של תרבות כדור העצב. כמו חלבונים טרום סינפטיות, ניתחנו את הסינפטיות שלפוחית החלבונים vGlut1 חלבון האזור הפעיל Munc18-1. כמו כן בחנו את קורס הזמן של הצטברות של vGlut1 ו-Munc18-1 ב טרום הסינפסות, והשיגה תוצאות...

Watch this Scientific Journal Video about Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and Ã¢â‚¬Å“Neuron BallÃ¢â‚¬Â Culture at JoVE.com

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

היווצרות preסינפסה הוא תהליך דינמי כולל הצטברות של חלבונים סינפטית בסדר הנכון. בשיטה זו, היווצרות preסינפסה מופעלות על ידי חרוזים מצועם עם חלבון preסינפא מארגן על גיליונות סיבי של "כדור תא העצב" התרבות, כך הצטברות של חלבונים סינפטית קל להיות מנותח במהלך היווצרות preסינפסה.

שיטת היווצרות טרום-סינפסה באמצעות חרוזי סדרן ותרבות "תא כדור"

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

פרוטוקול זה מתאים לחקור היכן נובעים חלבונים קדם-סינפטיים:גופי תאים או אקסונים. וכיצד חלבונים פרה-סינפטיים מצטברים ב presynapses באופן מאורגן במהלך היווצרות הסינפסה. טכניקה זו יכולה לגרום לאלפי presynapses בו זמנית, ואינו משתמש בכל מנגנון מיוחד כדי לשמור על אקסונים בתרבות המאפשר ניתוח יעיל של היווצרות של presynapses רבים אקסונים.יחד עם סטודנט לתואר שני, הונאמי, המדגים הליך זה יהיה רי אישיאי, סטודנט לתואר ראשון במעבדה שלי. התחל הליך זה עם המתת חסד של העכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לנתח את הבטן כדי להשיג עוברים E16.הסר את המוחות מעוברים בזהירות בעזרת ממטרים עדינים, ולהעביר אותם לתוך 60 מילימטר תאים תכלית מנות המכילות ארבעה מיליליטר של תווי מלח מאגר HEPES או HBSS. הסר את קרום ההת קרום והלב וחותך את נורת הריח. יש להפריד את הקורטיקס מכל חצי כדור מוחי באמצעות קצות מלקחיים עדיפים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו ולהעביר לצלחת נוספת של 60 מ"מ המכילה HBSS טרי.השתמש לפחות בשלושה עד חמישה עוברים עבור כל תרבות כדור נוירון נפרדת. חותכים את קליפות המוח לחתיכות קטנות עם מספריים האביב microdissecting במכסה המנוע של תא זרימה למינארית. עכשיו, להעביר קליפות טחון לצינור 15 מיליליטר.טריפסין קליפת המוח טחון בארבעה מיליליטר של 0.125% טריפסין ב HBSS במשך 4.5 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. העבר את צבירות התא לצינור חדש של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של HBSS על ידי פיפטה העברה סטרילית. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני לחזור על שלב זה עוד פעם אחת.לאחר מכן העבר את צבירות התאים לצינור חדש של 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של NGB בינוני, 0.01%DNase I ו- 10% סרום סוסים. Triturate קליפות טריפסיה על ידי צינורות שוב ושוב אותם למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים באמצעות פיפטה פסטור זכוכית מלוטש אש. להכנת כדורי נוירון, להתאים את צפיפות התא בהשעיית התא למיליון תאים למיליליטר באמצעות מדיום NGB.הוסף שבעה מיליליטר של PBS לחלק התחתון של מנות התרבות. תרבות הנוירונים קליפת המוח כמו 10 טיפות תלויות microliter המכיל 10, 000 תאים לכל טיפה בתוך המכסים העליונים של מנות תרבות 10 ס"מ. שמור את הכלים באינקובטור במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 בתנאים לחים כדי לאפשר היווצרות כדור נוירון.מעיל פולי-L-ליסין או PLL על כיסוי זכוכית חרוזים פרפין מחליק במנות 60 מילימטר באמצעות תווי PLL 15 מיקרוגרם למיליליטר במאגר borate. שמור אותם לפחות שעה אחת באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה ארבע פעמים עם PBS, להעביר את החלקות כיסוי מצופה PLL לצלחת ארבע באר המכיל 350 microliters של מדיום NGB עם שלושה micromolar AraC בכל באר.AraC מתווסף לתקשורת כדי להרוג תאים מתחלקים. הדגירה של ארבע צלחות היטב המכילות את החלקות כיסוי מצופה PLL באינקובטור CO2 לפחות 20 דקות כדי להבטיח את הטמפרטורה של המדיום מגיע 37 מעלות צלזיוס לפני העברת כדורי הנוירון. ב DIV 3 כאשר כדורי נוירון נוצרים היטב, להעביר אותם על תלושי כיסוי מצופה PLL.בתוך צלחת ארבע באר, להוסיף חמישה כדורי נוירון לכל באר. ב DIV 11 להעביר 20 microliters מן ההשעיה של חלקיקים מגנטיים מצופים סטרפטבידין לצינור מיקרוצנטריפוגה. לשתק את חרוזים מכשיר בעבודת יד מחובר עם מגנטים קבועים ניאודימיום ולשטוף שלוש פעמים עם 100 microliters של PBS-MCBC ב 1.5 מיליליטר מיקרוצנטריפוגה צינורות.לאחר הסרה מוחלטת של PBS-MCBC מהחרוזים, הוסף נפח קבוע מראש של מניית LRRTM2 לקדימות השטופות. דגירה את התערובת באמצעות מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה עד שעתיים. לאחר הדגירה, לשטוף את חרוזים פעמיים עם 100 microliters של PBS-MCBC.לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 100 microliters של בינוני NGB. תן שימוש חוזר ב-LRRTM2 ב-50 מיקרוליטרים של מדיום NGB ליישום לתרבות כדור הנוירונים. עכשיו לחתוך את הקצה של קצה צהוב בזווית של 45 מעלות עם סכין גילוח מתחת למיקרוסקופ סטריאו.שים את קצה הקצה הצהוב על אזור גוף התא של כדור נוירון ולהסיר את גופי התא על ידי יניקה. החל את LRRTM2 ולשלוט חרוזים על תרבות כדור נוירון. ואז להטביע את חרוזים לתחתית הצלחות של תרבות כדור נוירון במשך דקה אחת באמצעות מגנטים פריט להתחיל היווצרות טרום סינפסה.הליך זה מבטיח טאצ'דאון כל חרוזים בו זמנית. לתקן ולהכתים את הנוירונים בתרבות כדור הנוירון לאחר היווצרות טרום סינפסה עם חרוזים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לכוד ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות ותמונות immunofluorescence תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מצלמת CCD מקורר באמצעות עדשת טבילת שמן 60X.למדוד את עוצמת שפעת האימונו ב pre-סינפסות באקסון. השתמש התעצמויות immunofluorescence של האזור של עניין על חרוזים. מינוס עוצמת אזור חרוזים כבוי מחולק בעוצמה האקסונאלית, לאורך 20 מיקרון מהחרוזים.מינוס עוצמת רקע. עוצמת יחס זו מספקת את מדד הצטברות החלבון. כדי לכמת את רמת ההצטברות של חלבון מסוים ב presynapse המושרה עם חרוזי LRRTM2, תמיד לבחור את האזור כי הוא שני שדות תצוגה או יותר מלבד גוף התא.למדידה מדויקת, בחרו חמישה שדות אקסונאליים שונים לכיסוי. מוצג כאן הוא היישום של חרוזים LRRTM2 לתוך תרבות כדור נוירון ב DIV 11 הצטברות המושרה של Munc18-1 ב presynapses של אקסונים של כדורי נוירון. חרוזים על אקסונים של כדורי נוירון גלויים בתמונות מיקרוסקופיה שלב.והצטברות של חלבונים presynaptic נצפו על ידי תמונות immunofluorescence. אפילו אקסונים אשר מוסרים גופי תא, הצטברות של Munc18-1 נצפתה מתחת לחרוזים, בדומה אקסונים של כדורי נוירון עם גופי תא. כאשר האזור ההיקפי של גיליון האקסונאלי נותח על ידי עדשה אובייקטיבית הגדלה גבוהה, vGlut1 ו Munc18-1 הצטברו בבירור presynapses של אקסונים מתחת חרוזים עם וללא גופי תא.ניסויים בקורס זמן הראו כי הצטברות vGlut1 ב presynapses גדל באופן משמעותי ב 30 דקות. מצד שני, הצטברות מונק18-1 החלה לגדול באופן משמעותי בשעה שעתיים והגיעה לרמה של ארבע שעות. נתונים אלה מצביעים על כך חלבון קדחת סינפטית vGlut1 מצטבר presynapses מוקדם יותר מאשר חלבון האזור הפעיל Munc18-1.הצטברות Munc18-1 ב presynapses של נוירונים Fmr1-KO גדל פי 1.5 יותר מאשר אלה בסוג הבר, המציין מעורבות של FMRP ב Munc18-1 הצטברות. מעכב סינתזת חלבונים, אניסומיצין, דיכא את הצטברות Munc18-1 באופן משמעותי באקסונים עם ובלי גופי תאים. הדבר מצביע על כך שההצטברות תלויה בסינתזת חלבונים.צינורות קליפת המוח טריפסינית באמצעות פיפטה פסטור זכוכית מלוטש אש היא צעד חשוב. ניסויים מכינים את הפיפסות המלוטשים באש בקוטר של שניים עד שלושה קטרים שונים, ובחרו פיפטה בקוטר מתאים. באמצעות הליך זה, שחרור סינפטי מ presynapses המושרה על ידי קדימות LRRTM2 נמדד על ידי הדמיה חיה.שיטה נוספת זו תענה אם סינתזת חלבונים באקסונים מעורבת ברגולציה של שחרור סינפטי. בשיטה זו, החוקרים בוחנים כיצד חלבונים פרזינאפטיים מצטברים ב presynapses בצורה מאורגנת, כמו גם את המיקום של המקור של חלבונים presynaptic.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

הכנה והתרבות של שמיעתית פרוסות עוף גזע המוח

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבת האדם multiforme Glioblastoma גידול תאים שימוש Assay Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA<sub&gt;</sub&gt; רצפטורים

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...