यह काम आंशिक रूप से जेपीएस अनुदान-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (KAKENHI) (C) (संख्या 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) द्वारा समर्थित है। हम कृपया biotinylated LRRTM2 प्रोटीन प्रदान करने के लिए डॉ Terukazu Nogi और सुश्री Makiko Neyazaki (योकोहामा सिटी विश्वविद्यालय) धन्यवाद. हम भी तकनीकी सहायता के लिए Honami Uechi और री Ishii धन्यवाद.

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगों को योकोहामा सिटी विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति में उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया।
1. फांसी ड्रॉप संस्कृति के रूप में न्यू...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

हम न्यूरॉन गेंद संस्कृति का उपयोग कर LRRTM2-beads के साथ प्रेरित presynapse गठन की जांच करने के लिए उपन्यास विधि विकसित की है। वर्तमान में, अधिकांश presynapse गठन परख में पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल)-कोटित मोती और<sup clas...

सिनप्स गठन तंत्रिका परिपथ1,2,3के विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है . सिनैप्स का गठन जो पूर्व और बाद के सिनाप्स से बने विशेष डिब्बों के होते हैं, एक जटिल और बहुचरणी प्रक्रिया है जिसमें एक्सॉन और डेन्ड्राइट की उचित मान्यता, सक्रिय क्षेत्र और पोस्टीनैप्टिक घनत्व का गठन, और उचित संरेखण शामिल है। आयन चैनलों और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स1,2. प्रत्येक प्रक्रिया में, synaptic प्रोटीन के कई प्रकार के सेल निकायों से synaptic प्रोटीन परिवहन द्वारा उचित समय में इन विशेष डिब्बों में जमा और / इन synaptic प्रोटीन कार्यात्मक synapses फार्म करने के लिए संगठित तरीके से व्यवस्थित किया जा करने के लिए माना जाता है. सिनेप्स गठन से जुड़े कुछ सिनाप्टिक प्रोटीनों के रोग मस्तिष्क संबंधी रोगों में परिणाम4,5. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे synaptic प्रोटीन उचित समय में जमा.
कैसे synaptic प्रोटीन संगठित तरीके से जमा की जांच करने के लिए, यह कालानुक्रमिक क्रम में synaptic प्रोटीन के संचय की जांच करने के लिए आवश्यक है. कुछ रिपोर्टों में न्यूरॉन्स6,7की असंबद्ध संस्कृति में synapse गठन का निरीक्षण करने के लिए लाइव इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया . हालांकि, यह सिर्फ माइक्रोस्कोपी के तहत synapse गठन शुरू न्यूरॉन्स खोजने के लिए समय लेने वाली है. synaptic प्रोटीन के संचय को कुशलता से निरीक्षण करने के लिए, synapse गठन समय पर शुरू करना चाहिए जब शोधकर्ताओं के गठन के लिए प्रेरित करना चाहते हैं. दूसरी चुनौती कोशिका निकायों या synapses में स्थानीय अनुवाद से परिवहन के कारण synaptic प्रोटीन के संचय भेद करने के लिए है. उस उद्देश्य के लिए, अनुवाद स्तर शर्त है कि कोशिका निकायों से synaptic प्रोटीन के परिवहन की अनुमति नहीं है के तहत मापा जा करने के लिए आवश्यक है.
हमने न्यूरॉन बॉल कल्चर के संयोजन का उपयोग करते हुए न्यूरॉन बॉल कल्चर के संयोजन का उपयोग करते हुए उपन्यास प्रेसिनेप्स गठन परख विकसित की ताकि प्रेसिनाप्स गठन 8 को प्रेरित कियाजासके . कोशिका पिंडोंकेचारों ओर के एक्सोनल शीटों के निर्माण के कारण नौनबाल-संलक्षणी की जांच करने के लिए तंत्रिका बाल संवर्धन विकसित किया गयाहै। हम ल्यूकोइन समृद्ध दोहराने ट्रांसमेम्ब्रेन न्यूरोनल 2 (LRRTM2) के साथ संयुग्मी चुंबकीय मोती का उपयोग किया है कि उत्तेजक presynapses प्रेरित करने के लिए एक presynaptic आयोजक है (चित्र 1A)11,12,13. LRRTM2 मोती का उपयोग करके, presynapse गठन समय पर शुरू जब मोती लागू कर रहे हैं. इसका मतलब यह है कि presynapse गठन एक ही समय में एक न्यूरॉन गेंद के axons के हजारों में शुरू होता है, इस प्रकार यह synaptic प्रोटीन के संचय के सटीक समय पाठ्यक्रम कुशलता से जांच करने के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन बॉल कल्चर कोशिका निकायों को हटाकर सोमा से परिवहन synaptic प्रोटीन को अवरोधित करना आसान है (चित्र 1B)8. हम पहले से ही पुष्टि की है कि सेल निकायों के बिना axons जीवित रह सकते हैं और सेल निकायों को हटाने के बाद कम से कम 4 एच स्वस्थ हैं. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल जहां synaptic प्रोटीन प्राप्त कर रहे हैं से जांच करने के लिए उपयुक्त है (सेल शरीर या एक्सॉन), और कैसे synaptic प्रोटीन संगठित तरीके से जमा.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

न्यूरोनल विकास के दौरान, synapse गठन तंत्रिका सर्किट स्थापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. synapses बनाने के लिए, synaptic प्रोटीन सेल निकायों से परिवहन द्वारा उचित क्रम में आपूर्ति की जानी चाहिए और / हालांकि, यह पूरी तरह से समझ में नहीं आता है कि कैसे synaptic प्रोटीन उचित क्रम में synapses में जमा. यहाँ, हम मोती के साथ न्यूरॉन गेंद संस्कृति के संयोजन का उपयोग करके presynaptic गठन का विश्लेषण करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत presynapse गठन प्रेरित करने के लिए. न्यूरॉन गेंदों कि न्यूरॉन सेल समुच्चय है सेल निकायों और dendrites से दूर axonal चादरें प्रदान करते हैं, ताकि presynapses के कमजोर फ्लोरोसेंट संकेतों सेल निकायों के भारी संकेतों से बचने के द्वारा पता लगाया जा सकता है. presynapse गठन को गति प्रदान करने के लिए मोती के रूप में, हम ल्यूकोइन समृद्ध दोहराने ट्रांसमेम्ब्रेन न्यूरोनल 2 (LRRTM2), एक उत्तेजक presynaptic आयोजक के साथ संयुग्मी मोती का उपयोग करें। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने दिखा दिया कि vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (vGlut1), एक synaptic vesicle प्रोटीन, munc18-1, एक सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन की तुलना में तेजी से presynapses में जमा. Munc18-1 संचित अनुवाद-निर्भर रूप से presynapse में भी कोशिका निकायों को हटाने के बाद. यह निष्कर्ष एक्सॉन्स में स्थानीय अनुवाद द्वारा Munc18-1 संचय को इंगित करता है, कोशिका निकायों से परिवहन नहीं। अंत में, इस विधि presynapses और synaptic प्रोटीन के स्रोत में synaptic प्रोटीन के संचय का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है. न्यूरॉन गेंद संस्कृति सरल है और यह विशेष उपकरण का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है के रूप में, इस विधि अन्य प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों के लिए लागू हो सकता है.

यहाँ, हम LRRTM2 में presynaptic प्रोटीन के संचय के प्रतिनिधि परिणाम दिखाने न्यूरॉन गेंद संस्कृति के axonal शीट के presynapses प्रेरित. presynaptic प्रोटीन के रूप में, हम उत्तेजक synaptic vesicle प्रोटीन vGlut1 और सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन Munc18-1 का विश्...

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Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse गठन उचित क्रम में synaptic प्रोटीन के संचय सहित एक गतिशील प्रक्रिया है. इस विधि में, presynapse गठन मोती द्वारा शुरू होता है "न्यूरॉन गेंद" संस्कृति के axonal शीट पर एक presynapse आयोजक प्रोटीन के साथ संयुग्मी, ताकि synaptic प्रोटीन का संचय presynapse गठन के दौरान विश्लेषण किया जा करने के लिए आसान है.

Presynapse गठन परख का उपयोग Presynapse आयोजक मोती और "न्यूरॉन बॉल" संस्कृति

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

यह प्रोटोकॉल यह जांचने के लिए उपयुक्त है कि प्रेसिनैप्टिक प्रोटीन कहां से उत्पन्न होते हैं: सेल निकाय या अक्षतंप। और कैसे प्रेसिनैप्टिक प्रोटीन सिनेप्स गठन के दौरान एक संगठित तरीके से प्रेसिनैप्स में जमा होता है। यह तकनीक एक ही समय में हजारों प्रेसीनप्स को प्रेरित कर सकती है, और संस्कृति में अक्षों को बनाए रखने के लिए किसी विशेष उपकरण का उपयोग नहीं करती है जो एक्सॉन में कई प्रेसीनप्स के गठन के कुशल विश्लेषण की अनुमति देती है।स्नातक छात्र, होनामी के साथ, इस प्रक्रिया का प्रदर्शन री इशिई, मेरी प्रयोगशाला में एक स्नातक छात्र होगा । पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित माउस इच्छामृत्यु के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें। E16 भ्रूण प्राप्त करने के लिए पेट को विच्छेदन करें।ठीक इत्तला दे दी संदंश की मदद से ध्यान से भ्रूण से दिमाग निकालें, और उन्हें ६० मिलीमीटर सेल संस्कृति HEPES बफर नमक समाधान या HBSS के चार मिलीलीटर युक्त व्यंजन में स्थानांतरित । मेनिंग्स निकालें और घ्राण बल्ब काट लें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत संदंश के ठीक सुझावों का उपयोग करके प्रत्येक मस्तिष्क गोलार्द्ध से अलग कॉर्टिस और ताजा एचबीबीएस युक्त एक और 60 मिलीमीटर पकवान में स्थानांतरित करें।प्रत्येक अलग न्यूरॉन गेंद संस्कृति के लिए कम से कम तीन से पांच भ्रूण का उपयोग करें। एक लेमिनार प्रवाह सेल संस्कृति हुड में माइक्रोडिसेक्टिंग स्प्रिंग कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में कॉर्टिस काटें। अब, कीमा बनाया हुआ कोर्टिस को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।एचबीएसएस में 0.125% ट्राइप्सिन के चार मिलीलीटर में कीमा बनाए रखा कॉर्टिस को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 4.5 मिनट के लिए ट्रिप्सिनाइज करें। सेल एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट द्वारा एचबीबीएस के 10 मिलीलीटर युक्त एक नए 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए समुच्चयित। इस कदम को एक बार और दोहराने से पहले पांच मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।फिर सेल को एक नए 15-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करता है जिसमें दो मिलीलीटर एनजीबी माध्यम, 0.01% DNase I, और 10% घोड़ा सीरम शामिल हैं। आग से पॉलिश किए गए ठीक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके उन्हें बार-बार पाइपिंग करके ट्राइसिनाइज्ड कॉर्टिस को तीन से पांच बार पाइपिंग करके ट्रिट करें। न्यूरॉन गेंदों को तैयार करने के लिए, एनसीबी माध्यम का उपयोग करके सेल निलंबन में कोशिका घनत्व को दस लाख कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर में समायोजित करें।संस्कृति व्यंजनों के नीचे भाग में पीबीएस के सात मिलीलीटर जोड़ें। संस्कृति 10 माइक्रोलीटर फांसी 10 सेंटीमीटर संस्कृति व्यंजनों के ऊपरी lids के अंदर प्रति बूंद 10, 000 कोशिकाओं युक्त बूंदों के रूप में कॉर्टिकल न्यूरॉन्स । न्यूरॉन गेंद के गठन के लिए अनुमति देने के लिए आर्द्रीकृत परिस्थितियों में 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिनों के लिए एक इनक्यूबेटर में व्यंजन रखें।कोट पॉली-एल-लिसिन या पीएलएल पैराफिन-मनके ग्लास कवर पर 60 मिलीमीटर व्यंजनों में बोरेट बफर में 15 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पीएलएल समाधान का उपयोग करके फिसल जाता है। उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर एक CO2 इनक्यूबेटर में कम से कम एक घंटे के लिए रखें। पीबीएस के साथ चार बार धोने के बाद, पीएलएल-कोटेड कवर स्लिप को चार-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें एनजीबी माध्यम के 350 माइक्रोलीटर होते हैं जिसमें प्रत्येक कुएं में तीन माइक्रोमोलर अरासी होते हैं।विभाजित कोशिकाओं को मारने के लिए मीडिया में AraC जोड़ा जाता है। पीएएल-लेपित कवर स्लिप युक्त चार अच्छी प्लेटों को कम से कम 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि न्यूरॉन गेंदों को स्थानांतरित करने से पहले मध्यम का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है। DIV 3 में जब न्यूरॉन बॉल्स बहुत अच्छी तरह से बनते हैं, तो उन्हें पीएलएल-लेपित कवर स्लिप पर स्थानांतरित करें।चार अच्छी तरह से थाली के अंदर, अच्छी तरह से प्रति पांच न्यूरॉन गेंदों जोड़ें । DIV 11 में स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय कणों के निलंबन से 20 माइक्रोलीटर को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। मोतियों को नियोडिमियम स्थायी मैग्नेट से जुड़े एक हस्तनिर्मित उपकरण में स्थिर करें और 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में पीबीएस-एमसीबीसी के 100 माइक्रोलीटर के साथ तीन बार धोएं।मोतियों से पीबीएस-एमसीबीसी को पूरी तरह से हटाने के बाद, धोए गए मोतियों में LRRTM2 स्टॉक की एक पूर्व निर्धारित मात्रा जोड़ें। एक से दो घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर का उपयोग कर मिश्रण इनक्यूबेट । इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस-एमसीबीसी के 100 माइक्रोलीटर के साथ दो बार मोतियों को धोएं।इसके बाद मोतियों को एनजीबी मीडियम के 100 माइक्रोलीटर से धोएं। न्यूरॉन बॉल कल्चर के लिए आवेदन के लिए एनजीबी माध्यम के 50 माइक्रोलीटर में एलआरआरटीएम 2 मोतियों को फिर से खर्च करें। अब स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे रेजर ब्लेड के साथ 45 डिग्री कोण पर पीले टिप के अंत में कटौती करें।एक न्यूरॉन गेंद के सेल शरीर क्षेत्र पर पीले टिप अंत रखो और चूषण द्वारा सेल निकायों को हटा दें। एलआरआरटीएम2 लगाएं और न्यूरॉन बॉल कल्चर पर मोतियों को कंट्रोल करें। फिर पूर्व-सिनेप्स गठन शुरू करने के लिए फेराइट मैग्नेट का उपयोग करके एक मिनट के लिए न्यूरॉन बॉल संस्कृति की प्लेटों के नीचे मोती को जलमग्न करें।यह प्रक्रिया एक ही समय में सभी मोतियों को टचडाउन करना सुनिश्चित करती है। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित मोतियों के साथ पूर्व-सिनेप्स गठन के बाद न्यूरॉन बॉल संस्कृति में न्यूरॉन्स को ठीक और दाग दें। 60X तेल विसर्जन लेंस का उपयोग करके एक ठंडा सीसीडी कैमरे के साथ एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत अंतर हस्तक्षेप विपरीत और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों को कैप्चर करें।अक्षतंख में पूर्व-सिनेप्स में इम्यूनोफ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें। मोतियों पर ब्याज के क्षेत्र की इम्यूनोफ्लोरेसेंस तीव्रता का उपयोग करें। मोतियों से 20 माइक्रोन के साथ, अक्षीय तीव्रता से विभाजित बंद मोतियों क्षेत्र तीव्रता को घटा दें।माइनस बैकग्राउंड तीव्रता। यह अनुपात तीव्रता प्रोटीन संचय सूचकांक प्रदान करता है। LRRTM2 मोतियों के साथ प्रेरित एक presynapse में एक विशेष प्रोटीन के संचय स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमेशा क्षेत्र है कि देखने के दो क्षेत्रों या सेल शरीर से अधिक के अलावा है का चयन करें ।सटीक माप के लिए, प्रति कवरस्लिप पांच अलग-अलग अक्षीय फ़ील्ड चुनें। यहां दिखाया गया है कि न्यूरॉन बॉल्स के एक्सॉन के प्रेसीनप्स में Munc18-1 के DIV 11 प्रेरित संचय में न्यूरॉन बॉल संस्कृति में LRRTM2 मोती का आवेदन है। न्यूरॉन गेंदों के अक्षों पर मोती चरण माइक्रोस्कोपी छवियों में दिखाई दे रहे हैं।और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों द्वारा प्रेसिनैप्टिक प्रोटीन का संचय मनाया जाता है। यहां तक कि अक्षतंश में जो कोशिका निकायों को हटा दिया जाता है, मोतियों के नीचे Munc18-1 का संचय मनाया गया था, जो कोशिका निकायों के साथ न्यूरॉन गेंदों के अक्षों के समान था। जब अक्षीय शीट के परिधीय क्षेत्र का विश्लेषण उच्च आवर्धन उद्देश्य लेंस द्वारा किया गया था, vGlut1 और Munc18-1 के साथ और बिना सेल निकायों के मोतियों के नीचे अक्षों के presynapses में स्पष्ट रूप से संचित ।टाइम कोर्स प्रयोगों से पता चला कि प्रेस्सीनप्स में vGlut1 का संचय 30 मिनट में काफी बढ़ गया। दूसरी ओर, Munc18-1 संचय दो घंटे में काफी वृद्धि शुरू कर दिया और चार घंटे में एक पठार पर पहुंच गया । इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि सिनैप्टिक वेसिकल प्रोटीन vGlut1 सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन Munc18-1 से पहले presynapses में जमा होता है ।Fmr1-KO न्यूरॉन्स के presynapses में Munc18-1 संचय जंगली प्रकार के उन लोगों की तुलना में १.५ गुना अधिक वृद्धि हुई, Munc18-1 संचय में FMRP की भागीदारी का संकेत है । प्रोटीन संश्लेषण अवरोधक, एनिसोमाइसिन ने मुन्क18-1 संचय को कोशिका निकायों के साथ और बिना अक्षों में काफी दबा दिया। यह इंगित करता है कि संचय प्रोटीन संश्लेषण निर्भर है।आग से पॉलिश किए गए ठीक ग्लास पेस्टर पिपेट का उपयोग करके ट्राइपसिनाइज्ड कॉर्टिस को पिपेट करना एक महत्वपूर्ण कदम है। प्रयोगकर्ता दो से तीन अलग-अलग व्यास के साथ आग से पॉलिश किए गए पिपेट तैयार करते हैं, और उचित व्यास के साथ एक पिपेट चुना। इस प्रक्रिया का उपयोग करके, LRRTM2 मोतियों द्वारा प्रेरित प्रेसीनेप्स से सिनैप्टिक रिलीज लाइव इमेजिंग द्वारा मापा जाता है।यह अतिरिक्त विधि इस बात का जवाब देगी कि एक्सॉन में प्रोटीन संश्लेषण सिनैप्टिक रिलीज के नियमन में शामिल है या नहीं। इस विधि का उपयोग करके, शोधकर्ता इस बात की जांच करते हैं कि प्रेसिनैप्टिक प्रोटीन एक संगठित तरीके से प्रेसिनैप्स में कैसे जमा होता है, साथ ही प्रेसिनैप्टिक प्रोटीन के स्रोत का स्थान भी।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

अलगाव और वयस्क माउस तंत्रिका स्टेम सेल के विस्तार Neurosphere परख का उपयोग

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

भ्रूण माउस तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति की स्थापना Neurosphere परख का उपयोग

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

तैयारी और चिकन श्रवण brainstem स्लाइस की संस्कृति

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

अलगाव और Neurosphere परख का प्रयोग मानव Glioblastoma मल्टीफार्मी ट्यूमर कोशिकाओं का विस्तार

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Hippocampal न्यूरॉन्स में डीएनए की क्षति परख धूमकेतु परख का उपयोग

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

अलगाव और माउस Cortical Astrocytes की संस्कृति

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

एक सह संस्कृति मॉडल शामिल GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स और HEK293 कोशिकाओं में निरोधात्मक synapse गठन stably गाबा जताते<sub&gt; एक</sub&gt; रिसेप्टर्स

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Microfluidic सह संस्कृति उपकरणों का प्रयोग करना टूथ रोगाणु INNERVATION विकास का विश्लेषण

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

लाइव-एक वास्तविक समय शिविर परख का उपयोग कर गंध रिसेप्टर सक्रियण के सेल माप

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

इमेजिंग एक 2D संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर प्राथमिक मस्तिष्क प्रांतस्था की कोशिकाओं के रहते

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...