Questo lavoro è in parte supportato da JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (n. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Ringraziamo il Dr. Terukazu Nogi e la signora Makiko Neyazaki (Yokohama City University) per aver gentilmente fornito proteine LRRTM2 biotinylate. Ringraziamo anche Honami Uechi e Rie Ishii per l'assistenza tecnica.

Gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti secondo le linee guida delineate nel Comitato di cura e uso degli animali istituzionali della Yokohama City University.
1. Preparazione delle sfere di neurone come coltura goccia appesa (Giorni in vitro (DIV) 0-3)
NOTA: Le procedure qui descritte per la preparazione della coltura della palla neuronale si basano sul metodo precedentemente riportato dal gruppo Sasaki con alcune modifiche<sup cl...

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	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per esaminare la formazione di presynapsi stimolata con l'uso di perle l'RRTM2 utilizzando la coltura della palla neuronale. Attualmente, la maggior parte del test di formazione presilnapse include perline rivestite poli-D-lysina (PDL) e coltura dissociata/camera microfluidica20,21,22. Uno dei vantaggi di questo metodo è LRRTM2-perline. Mentre LRRTM2 interagisce con neurexin per formare presyn...

La formazione di sinapsi è uno dei passaggi critici durante lo sviluppo dei circuiti neurali1,2,3. La formazione di sinapsi specializzate composti da post-sinapsi è un processo complesso e multifase che prevede un adeguato riconoscimento di assoni e dendriti, formazione di zona attiva e densità post-sinaptica e un corretto allineamento canali ionici e recettori del neurotrasmettitore1,2. In ogni processo, molti tipi di proteine sinaptiche si accumulano in questi compartimenti specializzati in tempi adeguati trasportando proteine sinaptiche da corpi cellulari e/o mediante traduzione locale nei compartimenti. Queste proteine sinaptiche sono considerate organizzate in modo organizzato per formare sinapsi funzionali. La disfunzione di alcune proteine sinaptiche che coinvolgono la formazione di sinapsi provoca malattie neurologiche4,5. Tuttavia, non è chiaro come le proteine sinaptiche si accumulino in tempi adeguati.
Per studiare come le proteine sinaptiche si accumulano in modo organizzato, è necessario esaminare l'accumulo di proteine sinaptiche in ordine cronologico. Alcuni rapporti hanno dimostrato l'imaging dal vivo per osservare la formazione di sinapsi nella coltura dissociata dei neuroni6,7. Tuttavia, è necessario molto tempo per trovare neuroni che iniziano solo la formazione di sinapsi sotto microscopia. Per osservare l'accumulo di proteine sinaptiche in modo efficiente, la formazione delle sinapsi deve iniziare nel momento in cui i ricercatori vogliono indurre la formazione. La seconda sfida consiste nel distinguere l'accumulo di proteine sinaptiche dovuto al trasporto da corpi cellulari o alla traduzione locale nelle sinapsi. A tal fine, il livello di traduzione deve essere misurato nella condizione che non consente il trasporto di proteine sinaptiche da corpi cellulari.
Abbiamo sviluppato un nuovo saggio di formazione presynapse utilizzando la combinazione di coltura della palla neurone con perline per indurre la formazione di presynapsi8. La coltura della palla del neurone è sviluppata per esaminare il fenotipo assonale, a causa della formazione di fogli assonali che circondano i corpi cellulari9,10. Abbiamo usato perline magnetiche coniugate con transmembrane transmembrane a ecricca di leucina neuronale 2 (LRRTM2) che è un organizzatore presilnaptico per indurre presynapsi eccitatori (Figura 1A)11,12,13. Utilizzando le perline LRRTM2, la formazione di presynapsi inizia nel momento in cui vengono applicate le perline. Ciò significa che la formazione di presilnapsi inizia in migliaia di assoni di una palla neuronale allo stesso tempo, quindi permette di esaminare in modo preciso il percorso temporale dell'accumulo di proteine sinaptiche in modo efficiente. Inoltre, la coltura della palla neuronale è facile da bloccare il trasporto di proteine sinaptiche dal soma rimuovendo i corpi cellulari (Figura 1B)8. Abbiamo già confermato che gli assoni senza corpi cellulari possono sopravvivere e sono sani almeno 4 h dopo la rimozione dei corpi cellulari. Pertanto, questo protocollo è adatto per studiare da dove derivano le proteine sinaptiche (corpo cellulare o assone) e come le proteine sinaptiche si accumulano in modo organizzato.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Durante lo sviluppo neuronale, la formazione di sinapsi è un passo importante per stabilire circuiti neurali. Per formare le sinapsi, le proteine sinaptiche devono essere fornite in ordine appropriato mediante il trasporto da corpi cellulari e/o traduzioni locali in sinapsi immature. Tuttavia, non è completamente compreso come le proteine sinaptiche si accumulano nelle sinapsi in ordine corretto. Qui, presentiamo un nuovo metodo per analizzare la formazione presinaptica utilizzando la combinazione della coltura della palla del neurone con perline per indurre la formazione di presynapsi. Le sfere di neuroni che sono aggregati di cellule neuronali forniscono fogli assonali lontani dai corpi cellulari e dai dendriti, in modo che i deboli segnali fluorescenti di presynapsi possano essere rilevati evitando segnali schiaccianti di corpi cellulari. Come perline per innescare la formazione di presynapsi, usiamo perline coniugate con transmembrana ripetuta ricca di leucina neurone 2 (LRRTM2), un organizzatore pressinaptico eccitatorio. Utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato che il trasportatore di glutammato vescicolare 1 (vGlut1), una proteina vescica sinaptica, si è accumulata nei presilnapsi più velocemente di Munc18-1, una proteina della zona attiva. Munc18-1 ha accumulato la traduzione in modo dipendente nella pressinapse anche dopo la rimozione dei corpi cellulari. Questo risultato indica l'accumulo di Munc18-1 per traduzione locale negli assoni, non il trasporto da corpi cellulari. In conclusione, questo metodo è adatto per analizzare l'accumulo di proteine sinaptiche nei presilnapsi e la fonte di proteine sinaptiche. Poiché la cultura della palla neuronale è semplice e non è necessario utilizzare un apparato speciale, questo metodo potrebbe essere applicabile ad altre piattaforme sperimentali.

Qui, mostriamo risultati rappresentativi dell'accumulo di proteine pressinaptiche in presynapsi indotta da LRRTM2 di fogli assonali di coltura della palla neuronale. Come proteine presinterratiche, abbiamo analizzato la proteina vesicle sinaptica eccitatoria vGlut1 e la proteina della zona attiva Munc18-1. Abbiamo anche esaminato il ciclo temporale dell'accumulo di vGlut1 e Munc18-1 nei presynapsi, e abbiamo ottenuto risultati che indicano la fonte di Munc18-1 nei presynapsi usando assoni che rimuovono i corpi cellulari ...

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Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

La formazione della presilnapsi è un processo dinamico che include l'accumulo di proteine sinaptiche nell'ordine corretto. In questo metodo, la formazione del presilnapsi è innescata da perline coniugate con una proteina organizzatore presilnapse su fogli assonali di cultura "palla di neurone", in modo che l'accumulo di proteine sinaptiche sia facile da analizzare durante la formazione del presilnapsi.

Saggio di formazione Presynapse utilizzando perline dell'organizzatore della presynapsi e cultura "Neuron Ball"

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Questo protocollo è adatto per indagare da dove provengono le proteine presnaptiche: corpi cellulari o assoni. E come le proteine presnaptiche si accumulano nelle presnapsi in modo organizzato durante la formazione della sinapsi. Questa tecnica può indurre migliaia di rapasi allo stesso tempo, e non utilizza alcun apparato speciale per mantenere gli assoni in coltura permettendo un'analisi efficiente della formazione di molte presnapsi negli assoni.Insieme alla studentessa, Honami, a dimostrare questa procedura sarà Rie Ishii, una studentessa universitaria nel mio laboratorio. Iniziare questa procedura con l'eutanasia del mouse come descritto nel protocollo di testo. Sezionare l'addome per ottenere embrioni E16.Rimuovere accuratamente il cervello dagli embrioni con l'aiuto di forcep a punta fine e trasferirli in piatti di coltura cellulare da 60 millimetri contenenti quattro millilitri di soluzione di sale tamponato HEPES o HBSS. Rimuovere le meningi e tagliare il bulbo olfattivo. Separare i cortici da ogni emisfero cerebrale utilizzando le punte fini delle forcep al microscopio stereo e trasferirli in un altro piatto da 60 millimetri contenente HBSS fresco.Utilizzare almeno da tre a cinque embrioni per ogni coltura separata di palla neuronale. Tagliare i cortici in piccoli pezzi con forbici a molla microdissettanti in un cappuccio di coltura cellulare a flusso laminare. Ora, trasferisci cortici tritati in un tubo da 15 millilitri.Tripinare i cortici tritati in quattro millilitri dello 0,125% di tripside in HBSS per 4,5 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Trasferire gli aggregati cellulari in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS da una pipetta di trasferimento sterile. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti prima di ripetere questo passaggio ancora una volta.Quindi trasferire gli aggregati cellulari in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di mezzo NGB, 0,01%DNasi I e siero del 10% di cavallo. Triturare i cortici tripsinato tubazioni ripetutamente su e giù da tre a cinque volte utilizzando una pipetta Pasteur in vetro fine lucidato dal fuoco. Per preparare le sfere neuronali, regolare la densità cellulare nella sospensione cellulare a un milione di cellule per millilitro utilizzando il mezzo NGB.Aggiungere sette millilitri di PBS alla parte inferiore dei piatti della coltura. Coltura dei neuroni corticali come 10 gocce appese di microliter contenenti 10.000 cellule per goccia all'interno dei coperchi superiori dei piatti di coltura di 10 centimetri. Conservare i piatti in un'incubatrice per tre giorni a 37 gradi Celsius con 5%CO2 in condizioni umidificate per consentire la formazione di palla neuronale.Rivestire poli-L-lisina o PLL sulla copertura in vetro con perline di paraffina in stoviglie da 60 millimetri utilizzando una soluzione PLL da 15 microgrammi per millilitro nel tampone di borato. Conservarli per almeno un'ora in un incubatore di CO2 a 37 gradi Celsius. Dopo il lavaggio quattro volte con PBS, trasferire i coperchi rivestiti in PLL su una piastra a quattro porri contenente 350 microlitri di mezzo NGB con tre AraC micromolare in ogni pozzo.AraC viene aggiunto al supporto per uccidere le cellule divisorie. Incubare le piastre a quattro pozzi contenenti la copertura rivestita in PLL scivola nell'incubatore di CO2 per almeno 20 minuti per garantire che la temperatura del mezzo raggiunga i 37 gradi Celsius prima di trasferire le sfere neuronali. A DIV 3 quando le sfere neuronali si formano molto bene, trasferiscile su scivolamenti di copertura rivestiti in PLL.All'interno della piastra a quattro po', aggiungere cinque sfere neuronali per pozzo. Al DIV 11 trasferiscono 20 microlitri dalla sospensione di particelle magnetiche rivestite di streptavidina a un tubo di microcentrifugo. Immobilizzare le perline di un apparecchio fatto a mano attaccato con magneti permanenti al neodimio e lavare tre volte con 100 microlitri di PBS-MCBC in tubi microcentrifugo da 1,5 millilitri.Dopo aver rimosso completamente PBS-MCBC dalle perline, aggiungere un volume predeterminato di materiale LRRTM2 alle perline lavate. Incubare la miscela usando un rotatore a quattro gradi Celsius per una o due ore. Dopo l'incubazione, lavare le perline due volte con 100 microlitri di PBS-MCBC.Quindi, lavare le perline con 100 microlitri di mezzo NGB. Resuspend le perline LRRTM2 in 50 microlitri di mezzo NGB per l'applicazione alla coltura della sfera neuronale. Ora taglia l'estremità di una punta gialla con un angolo di 45 gradi con una lama di rasoio al microscopio stereo.Mettere l'estremità gialla della punta sull'area del corpo cellulare di una palla neuronale e rimuovere i corpi cellulari per aspirazione. Applicare l'LRRTM2 e controllare le perline sulla coltura della sfera neuronale. Quindi immergere le perline sul fondo delle piastre della coltura della sfera neuronale per un minuto usando magneti di ferrite per iniziare la formazione pre-sinapsi.Questa procedura assicura di touchdown di tutte le perline contemporaneamente. Fissare e macchiare i neuroni nella coltura della palla neuronale dopo la formazione pre-sinapsi con perline come descritto nel protocollo di testo. Cattura il contrasto differenziale delle interferenze e le immagini di immunofluorescenza sotto un microscopio fluorescente invertito con una telecamera CCD raffreddata che utilizza un obiettivo ad immersione dell'olio 60X.Misurare l'intensità dell'immunofluorescenza nelle pre-sinapsi nell'assone. Utilizzare intensità di immunofluorescenza della regione di interesse sulle perline. Meno l'intensità della regione delle perline off divisa per l'intensità assonale, lungo 20 micron dalle perline.Meno intensità dello sfondo. Questa intensità di rapporto fornisce l'indice di accumulo proteico. Per quantificare il livello di accumulo di una particolare proteina in una presnapsi indotta con perline LRRTM2, selezionare sempre l'area che è due campi visivo o più a parte il corpo cellulare.Per una misurazione accurata, scegliere cinque diversi campi assonali per coverlip. Qui è mostrata l'applicazione delle perline LRRTM2 nella coltura della sfera neuronale all'accumulo indotto di Munc18-1 indotto da DIV 11 nelle rapasi degli assoni delle sfere neuronali. Le perline sugli assoni delle sfere neuronali sono visibili nelle immagini della microscopia di fase.E l'accumulo di proteine presnaptiche è osservato dalle immagini di immunofluorescenza. Anche negli assoni che vengono rimossi corpi cellulari, l'accumulo di Munc18-1 è stato osservato sotto le perline, simile agli assoni di sfere neuronali con corpi cellulari. Quando la regione periferica del foglio assonale è stata analizzata da lenti oggettive ad alto ingrandimento, vGlut1 e Munc18-1 si sono accumulati chiaramente nelle rapasi degli assoni sotto le perline con e senza corpi cellulari.Gli esperimenti sui corsi di tempo hanno dimostrato che l'accumulo di vGlut1 nelle presnapsi è aumentato significativamente a 30 minuti. D'altra parte, l'accumulo di Munc18-1 ha iniziato ad aumentare significativamente a due ore e ha raggiunto un altopiano a quattro ore. Questi dati indicano che la proteina sinaptica vescicola vGlut1 si accumula nelle presnapsi prima della proteina della zona attiva Munc18-1.L'accumulo di Munc18-1 nelle presnapsi dei neuroni Fmr1-KO è aumentato 1,5 volte di più di quelli di tipo selvaggio, indicando il coinvolgimento dell'FMRP nell'accumulo di Munc18-1. L'inibitore della sintesi proteica, l'anisomicina, ha soppresso l'accumulo di Munc18-1 in modo significativo negli assoni con e senza corpi cellulari. Ciò indica che l'accumulo dipende dalla sintesi proteica.Pipettare le cortici tripsinato utilizzando una pipetta Pasteur in vetro fine lucidato dal fuoco è un passo importante. Gli sperimentatori preparano le pipette lucidate dal fuoco con due o tre diametri diversi e scelgono una pipetta con un diametro appropriato. Utilizzando questa procedura, il rilascio sinaptico da presnapsi indotte da perline LRRTM2 viene misurato mediante imaging dal vivo.Questo metodo aggiuntivo risponderebbe se la sintesi proteica negli assoni è coinvolta nella regolazione del rilascio sinaptico. Utilizzando questo metodo, i ricercatori esaminano come le proteine presnaptiche si accumulano nelle presnapsi in modo organizzato, così come la posizione della fonte di proteine presnaptiche.

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