この研究の一部は、JSPS科学研究助成金(KAKENHI)(第2250036号、25430068、16K07061)(佐々木Y.生体化LRRTM2タンパク質を提供してくださった野木輝和先生と寝屋崎真紀子さん(横浜市立大学)に感謝申し上げます。また、上地穂波さんと石井理恵さんの技術支援にも感謝します。

本原稿に記載された実験は、横浜市立大学動物管理利用委員会に概説されたガイドラインに従って行われました。
1. ぶら下がりドロップ培養としてのニューロンボールの調製(インビトロ(DIV)0-3)
注:ニューロンボール培養の調製のためにここに説明する手順は、以前に佐々木群によって報告された方法に基づいており、いくつか...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

ニューロンボール培養を用いてLRRTM2ビーズで刺激されたシナプス前形成を調べる新しい方法を開発した。現在、シナプス前形成アッセイのほとんどは、ポリD-リジン(PDL)コーティングビーズおよび解離培養/マイクロ流体室20、21、22を含む。この方法の利点の1つはLRRTM2ビーズです。LRRTM2は、特異的に11、12、13、PDLビーズを形...

シナプス形成は、神経回路1、2、3の発達中の重要なステップの1つである。シナプス前およびポストシナプスで構成される特殊なコンパートメントであるシナプスの形成は、軸線とデンドライトの適切な認識、活性ゾーンおよびポストシナプス密度の形成、および適切なアライメントを伴う複雑で多段階のプロセスである。イオンチャネルおよび神経伝達物質受容体1、2.各プロセスでは、多くの種類のシナプスタンパク質が、細胞体からシナプスタンパク質を輸送したり、コンパートメント内の局所翻訳によって適切なタイミングでこれらの特殊なコンパートメントに蓄積します。これらのシナプスタンパク質は、機能性シナプスを形成するために組織的に配置されていると考えられる。シナプス形成を伴ういくつかのシナプスタンパク質の機能不全は、神経疾患4,5をもたらす。しかし、シナプスタンパク質が適切なタイミングでどのように蓄積するかは不明です。
シナプスタンパク質がどのように組織的に蓄積するかを調べるには、シナプスタンパク質の蓄積を時系列順に調べる必要があります。いくつかの報告は、ニューロン6、7の解離培養におけるシナプス形成を観察するライブイメージングを実証した。しかし、顕微鏡検査の下でシナプス形成を開始するニューロンを見つけるのは時間がかかります。シナプスタンパク質の蓄積を効率的に観察するには、研究者が形成を誘導したい時にシナプス形成を開始する必要があります。第2の課題は、細胞体からの輸送またはシナプス中の局所翻訳によるシナプスタンパク質の蓄積を区別することです。そのためには、細胞体からのシナプスタンパク質の輸送を許可しない条件下で翻訳レベルを測定する必要があります。
ニューロンボール培養とビーズの組み合わせを用いて、シナプス前形成を誘導する新規のシナプス形成アッセイを開発した。ニューロン球培養は、細胞体9、10を取り巻く軸シートの形成に起因する軸次表現型を調べるために開発される。興奮前シナプスを誘導する前シナプスオーガナイザーであるロイシンリッチリピート膜神経神経2(LRRTM2)と共役した磁気ビーズ(図1A)11、12、13を用いた。LRRTM2ビーズを用いることで、ビーズが塗布された時点でシナプス形成が開始される。これは、シナプス前形成がニューロンボールの数千の軸で同時に始まることを意味し、したがって、シナプスタンパク質の蓄積の正確な時間経過を効率的に調べることができる。また、ニューロンボール培養は、細胞体を除去することにより、ソマからのシナプスタンパク質の輸送をブロックすることが容易である(図1B)8.我々はすでに、細胞体のない軸ソンが生き残ることができ、細胞体を除去した後、少なくとも4時間は健康であることを確認しました。したがって、このプロトコルは、シナプスタンパク質がどこから(細胞体または軸)由来し、シナプスタンパク質が組織的に蓄積するかを調するのに適しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

神経発達の間、シナプス形成は神経回路を確立するための重要なステップである。シナプスを形成するには、シナプスタンパク質は、細胞体からの輸送および/または未熟なシナプスにおける局所翻訳によって適切な順序で供給されなければならない。しかし、シナプスタンパク質がシナプスに適切な順序で蓄積する方法を完全に理解していません。ここでは、ニューロンボール培養とビーズの組み合わせを用いてシナプス前形成を誘導する新しい方法を提示する。ニューロン細胞凝集体であるニューロンボールは、細胞体やデンドライトから遠く離れた軸シートを提供するため、細胞体の圧倒的なシグナルを避けることで、シナプス前の弱い蛍光シグナルを検出することができます。シナプス前形成を引き起こすビーズとして、刺激性前シナプスオーガナイザーであるロイシンリッチリピート膜神経神経2(LRRTM2)と共役のビーズを使用します。この方法を用いて、シナプス小胞タンパク質である小胞性グルタミン酸トランスポーター1(vGlut1)が、活性ゾーンタンパク質であるMunc18-1よりも早くプレシナプスに蓄積することを実証した。Munc18-1は、細胞体を除去した後も、プレシナプスに翻訳依存的に蓄積した。この知見は、細胞体からの輸送ではなく、軸ゾンにおける局所翻訳によるMunc18-1蓄積を示す。結論として、この方法は、シナプス前シナプスおよびシナプスタンパク質の供給源におけるシナプスタンパク質の蓄積を分析するのに適している。ニューロンボール培養は単純で、特別な装置を使用する必要がないため、この方法は他の実験プラットフォームにも適用可能です。

ここでは、ニューロンボール培養の軸シートのLRRTM2誘導プレシナプスにおけるシナプス前タンパク質の蓄積の代表的な結果を示す。シナプス前タンパク質として、興奮性シナプス小胞タンパク質vGlut1と活性ゾーンタンパク質Munc18-1を分析した。また、vGlut1およびMunc18-1の蓄積の時間経過を事前シナプスで調べ、細胞体を除去する軸ソンとタンパク質合成阻害剤を用いて、プレシナプス中のMunc18...

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Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

シナプス前形成は、シナプスタンパク質の蓄積を含む動的なプロセスを適切な順序で行う。この方法では、シナプス前形成は「ニューロンボール」培養物の軸シート上にプレシナプスオーガナイザータンパク質と結合したビーズによって引き起こされ、シナプス形成前にシナプスタンパク質の蓄積が解析されやすくなる。

シナプス前オーガナイザービーズと「ニューロンボール」培養を用いたシナプス形成アッセイ

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

このプロトコルは、シナプス前タンパク質がどこから生じたのか、すなわち細胞体または軸索を調べるのに適している。シナプス形成中にシナプス前タンパク質が組織化された方法でシナプス前に蓄積する方法。この技術は、同時に何千ものプレシナプスを誘導することができ、また、軸索中の多くの前シナプスの形成を効率的に分析することを可能にする培養中の軸索を維持するために特別な装置を使用しない。大学院生の本見と共に、この手順をデモンストレーションするのは、私の研究室の学部生石井理です。テキスト プロトコルで説明されているように、マウス安楽死でこの手順を開始します。腹部を解剖してE16胚を得る。細かい鉗子の助けを借りて慎重に胚から脳を取り除き、4ミリリットルのHEPES緩衝塩溶液またはHBSSを含む60ミリメートルの細胞培養皿に移します。髄を取り除き、嗅球を切ります。ステレオ顕微鏡下の鉗子の細かい先端を使用して各大脳半球から皮質を分離し、新鮮なHBSSを含む別の60ミリメートル皿に移す。各別個のニューロンボール培養に対して、少なくとも3~5個の胚を使用する。層流細胞培養フードにスプリングハサミをマイクロディス分けして皮質を小さく切ります。今度は、ひき皮を15ミリリットルのチューブに移します。37°Cの水浴で4.5分間HBSSで0.125%トリプシンの4ミリリットルのひき皮をトリプシン化する。細胞凝集体を、無菌移動ピペットにより10ミリリットルのHBSSを含む新しい15ミリリットルチューブに移します。このステップをもう一度繰り返す前に、摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、NGB培地、0.01%DNase I、および10%馬の血清を含む新しい15ミリリットルチューブに細胞凝集体を移します。火で磨いた細かいガラスのパスツールピペットを使用して3〜5回繰り返しピペットを作ってトリプシン化した皮質をトリチューレートします。ニューロンボールを調製するには、NGB培地を用いて細胞懸濁液中の細胞密度を1ミリリットル当たり100万個の細胞に調整します。培養皿の底部に7ミリリットルのPBSを加えます。皮質ニューロンを10センチメートル培養皿の上蓋内に1滴当たり10,000個の細胞を含む10マイクロリットルの吊り下げ滴として培養する。ニューロンボールの形成を可能にするために加湿条件下で5%CO2で摂氏37度で3日間インキュベーターに料理を保管してください。ポリL-リジンまたはPLLを、ホレートバッファーで1ミリリットルPLL溶液あたり15マイクログラムを使用して、60ミリメートルの皿のパラフィンビーズガラスカバースリップにコーティングします。CO2インキュベーターで摂氏37度で少なくとも1時間保管してください。PBSで4回洗浄した後、PLLコーティングされたカバースリップを、各ウェルに3マイクロモルAraCを含む350マイクロリットルのNGB培地を含む4ウェルプレートに移します。アラクは、分割細胞を殺すためにメディアに追加されます。PLLコーティングカバースリップを含む4ウェルプレートをCO2インキュベーターに含む4ウェルプレートを少なくとも20分間インキュベートし、ニューロンボールを転送する前に培地の温度が摂氏37度に達することを確認します。DIV 3では、ニューロンボールが非常によく形成されている場合、PLLコーティングされたカバースリップに転送します。4ウェルプレートの中に、井戸ごとに5つのニューロンボールを追加します。DIV 11では、ストレプトアビジン被覆磁性粒子の懸濁液からマイクロ遠心チューブへの20マイクロリットルの移動が行われた。ネオジム永久磁石を取り付けた手作りの装置にビーズを固定化し、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブでPBS-MCBCの100マイクロリットルで3回洗浄します。ビーズからPBS-MCBCを完全に除去した後、洗浄されたビーズにLRRTM2ストックの所定の量を加える。摂氏4度で1~2時間、混合物をインキュベートする。インキュベーションに続いて、100マイクロリットルのPBS-MCBCでビーズを2回洗います。その後、100マイクロリットルのNGB培地でビーズを洗います。ニューロンボール培養に適用するために、50マイクロリットルのNGB培地でLRRTM2ビーズを再中断します。今度は、ステレオ顕微鏡の下にカミソリの刃で45度の角度で黄色の先端の端をカットします。黄色の先端をニューロンボールの細胞体領域に置き、吸引によって細胞体を取り除きます。LRRTM2を適用し、コントロールビーズをニューロンボール培養に適用します。次に、フェライト磁石を使用してニューロンボール培養のプレートの底にビーズを1分間沈め、シナプス前形成を開始します。この手順では、すべてのビーズを同時にタッチダウンします。テキストプロトコルに記載されているようにビーズでシナプス前形成後のニューロンボール培養中のニューロンを固定および染色する。60X油浸漬レンズを使用して、冷却されたCCDカメラを使用して、反転蛍光顕微鏡で差動干渉コントラストと免疫蛍光画像をキャプチャします。軸索内のシナプス前の免疫蛍光強度を測定します。ビーズに関心領域の免疫蛍光強度を使用してください。ビーズから20ミクロンに沿って、軸索強度で割ったオフビーズ領域強度を差し引いた。背景の強度を差し引いた値。この比率強度は、タンパク質蓄積指数を提供する。LRRTM2ビーズで誘導されるプレシナプス中の特定のタンパク質の蓄積レベルを定量化するには、細胞体から離れた2つの視野以上の領域を常に選択する。正確な測定のために、カバースリップごとに5つの異なる軸索フィールドを選択してください。ここに示されているのは、ニューロンボールの軸索の前シナプスにおけるMunc18-1の蓄積を誘発したDIV 11におけるニューロンボール培養へのLRRTM2ビーズの適用である。ニューロンボールの軸索上のビーズは、位相顕微鏡画像で見えます。そして、免疫蛍光画像によってシナプス前タンパク質の蓄積が観察される。細胞体を除去した軸索においても、細胞体を持つニューロンボールの軸索と同様に、ビーズの下でMunc18-1の蓄積が観察された。軸索シートの周辺領域を高倍率対物レンズで解析した場合、vGlut1およびMunc18-1は、細胞体の有無にかかわらずビーズの下の軸索の前シナプスに明らかに蓄積した。時間経過実験は、プレシナプスにおけるvGlut1の蓄積が30分で有意に増加したことを示した。一方、Munc18-1の蓄積は2時間で大幅に増加し始め、4時間で高原に達した。これらのデータは、シナプス小胞タンパク質vGlut1が活性ゾーンタンパク質Munc18-1よりも早くプレシナプスに蓄積することを示している。Fmr1-KOニューロンのプレシナプスにおけるMunc18-1蓄積は、野生型のニューロンよりも1.5倍増加し、Munc18-1蓄積におけるFMRPの関与を示す。タンパク質合成阻害剤は、アニソマイシン、細胞体の有無にかかわらず軸索におけるMunc18-1蓄積を有意に抑制した。これは蓄積がタンパク質合成依存であることを示す。火で磨かれた細かいガラスのパスツールピペットを使用してトリプシン化皮質をピペット化することは重要なステップです。実験者は、2〜3つの異なる直径で火磨きピペットを準備し、適切な直径のピペットを選びました。この手順を用いて、LRRTM2ビーズによって誘導されるプレシナプスからのシナプス放出は、ライブイメージングによって測定される。この追加の方法は、軸索のタンパク質合成がシナプス放出の調節に関与しているかどうか答えるだろう.この方法を用いて、研究者は、シナプス前タンパク質が体系化された方法でシナプス前タンパク質に蓄積する方法と、シナプス前タンパク質の発生源の位置を調べます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

チキンの聴性脳幹スライスの準備と文化

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫の腫瘍細胞の単離と拡大

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現<sub&gt; A</sub&gt;受容体

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...