이 작품은 부분적으로 JSPS 과학 연구를위한 원조에 의해 지원된다 (KAKENHI) (C) (번호 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. 사사키). 노기 테루카즈 박사와 네야자키 마키코(요코하마시 립대학)에게 생물학적 LRRTM2 단백질을 친절하게 공급해 주신 것에 감사드립니다. 또한 기술 지원을 해주신 우에치 호나미와 이시이 리에 대해서도 감사드립니다.

이 원고에 기술된 실험은 요코하마시 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 설명된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 매달려 드롭 문화로 뉴런 볼의 준비 (시험관 내 일 (DIV) 0-3)
참고: 뉴런 볼 배양의 제조를 위해 여기에 기술된 절차는 사사키 그룹이 이전에 보고한 방법에 기초하여일부수정9,10. 우리는 ?...

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	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

우리는 뉴런 볼 배양을 사용하여 LRRTM2-비드로 자극된 시냅스 형성을 검사하는 새로운 방법을 개발했습니다. 현재, 대부분의 시냅스 형성 분석은 폴리-D-리신(PDL) 코팅된 비드 및 해리된 배양/미세유체챔버(20,21,22)를포함한다. 이 방법의 장점 중 하나는 LRRTM2 비드입니다. LRRTM2는 neurexin과 상호 작용하여 특히11,<s...

시냅스 형성은 신경 회로 1,2,3의발달 중에 중요한 단계 중 하나입니다. 시냅스 전후로 구성된 전문 구획의 형성은 축삭과 모수석의 적절한 인식, 활성 영역 및 후발성 밀도의 형성, 그리고 적절한 정렬을 포함하는 복잡하고 다단계 과정입니다. 이온 채널 및 신경전달 물질 수용체 1,2. 각 과정에서, 시 냅 스 단백질의 많은 종류는 세포 체에서 시 냅 스 단백질을 수송 하 여 적절 한 타이밍에 이러한 전문 된 구획에 축적 및/또는 구획에 로컬 번역에 의해. 이러한 시 냅 스 단백질 기능 시 냅 스를 형성 하기 위해 조직 된 방식으로 배열 될 것으로 간주 됩니다. 시 냅 스 형성을 포함 하는 일부 시 냅스 단백질의 기능 장애 는 신경 질환 결과 4,5. 그러나, 그것은 불분명 한 방법 시 냅 스 단백질 적절 한 타이밍에 축적.
시 냅 스 단백질 조직 된 방식으로 축적 하는 방법을 조사 하기 위해, 연대순으로 시 냅 스 단백질의 축적을 검사 하는 데 필요한. 일부 보고서는 뉴런의 해리 된 문화에서 시냅스 형성을관찰하기 위해 라이브 이미징을 입증 6,7. 그러나, 그것은 단지 현미경 검사법에서 시 냅 스 형성을 시작 하는 신경 세포를 찾는 시간이 많이 걸립니다. 시 냅 스 단백질의 축적을 효율적으로 관찰 하기 위해, 시 냅 스 형성 연구원이 형성을 유도 하 고 싶은 시간에 시작 해야 합니다. 두 번째 과제는 세포체로부터의 수송 또는 시냅스의 국소 번역으로 인한 시냅스 단백질의 축적을 구별하는 것입니다. 그 목적을 위해, 번역 수준은 세포체에서 시냅스 단백질의 수송을 허용하지 않는 조건하에서 측정될 필요가 있습니다.
뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 새로운 프리시냅스 형성 분석방법을 개발하여 프리시냅스 형성을 유도한다8. 뉴런 볼 배양은 세포체9,10을둘러싼 축색 시트의 형성으로 인해 축색 표현형을 검사하기 위해 개발된다. 우리는 흥분성 presynapssss를 유도하는 시냅스 조이커인 류신 풍부 한 반복 막 간 뉴런 2 (LRRTM2)와 결합 된 자기 구슬을 사용 (그림1A)11,12,13. LRRTM2 비드를 사용하여, 구슬이 적용되는 시점에서 presynapse 형성이 시작됩니다. 즉, presynapse 형성 은 동시에 뉴런 볼의 축축의 수천에서 시작, 따라서 그것은 시 냅 스 단백질의 축적의 정확한 시간 과정을 효율적으로 검사 할 수 있습니다. 또한, 뉴런 볼 배양은 세포체를 제거함으로써 소마로부터 시냅스 단백질을수송하는 것을 차단하기 쉽다(도1B)8. 우리는 이미 세포체가 없는 축세포가 생존할 수 있고 세포체 제거 후 적어도 4시간 동안 건강하다는 것을 확인했습니다. 따라서, 이 프로토콜은 시냅스 단백질이 유래되는 곳(세포체 또는 축색)과 시냅스 단백질이 조직화된 방식으로 어떻게 축적되는지 를 조사하는 데 적합합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

신경 발달 도중, 시냅스 대형은 신경 회로를 설치하는 중요한 단계입니다. 시 냅 스를 형성 하기 위해, 시 냅 스 단백질 은 미성숙 시 냅 스에서 세포 체 및/또는 로컬 번역에서 전송 하 여 적절 한 순서로 공급 해야 합니다. 그러나, 그것은 완전히 이해 되지 않습니다 어떻게 시 냅 스 단백질 적절 한 순서로 시 냅 스에 축적. 여기서, 우리는 뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 시냅스 전 형성을 분석하여 시냅스 전 형성을 유도하는 새로운 방법을 제시한다. 신경 세포 응집체인 뉴런 볼은 세포체와 모수석에서 멀리 떨어진 축축한 시트를 제공하므로 세포체의 압도적인 신호를 피함으로써 약한 형광 신호가 검출될 수 있습니다. 구슬은 presynapse 대형을 트리거하기 때문에, 우리는 류신이 풍부한 반복 막 간 신경 2 (LRRTM2), 흥분성 presynaptic 주최자와 결합된 구슬을 사용합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 소포성 소포 단백질인 소포성 단백질인 소포성 단백질인 소포체 1(vGlut1)이 활성 영역 단백질인 Munc18-1보다 더 빨리 시냅스로 축적된다는 것을 입증했습니다. Munc18-1 세포 체를 제거 한 후에도 presynapse에 의존적으로 축적 된 번역. 이 발견은 세포체에서 수송되지 않는 축색에 있는 현지 번역에 의하여 Munc18-1 축적을 나타냅니다. 결론적으로,이 방법은 시 냅 스 및 시 냅 스 단백질의 소스에 시 냅 스 단백질의 축적을 분석 하는 데 적합 하다. 뉴런 볼 배양이 간단하고 특수 장치를 사용할 필요가 않기 때문에이 방법은 다른 실험 플랫폼에 적용 될 수 있습니다.

여기서, 우리는 신경 볼 배양액의 축사 시트의 LRRTM2 유도 전시냅스에서 시냅스 전 단백질의 축적의 대표적인 결과를 보여준다. 시냅스 전 단백질로서, 우리는 흥분성 시냅스 소포 단백질 vGlut1 및 활성 영역 단백질 Munc18-1을 분석했다. 우리는 또한 presynapses에 있는 vGlut1와 Munc18-1의 축적의 시간 과정을 검토하고, 세포 바디및 단백질 합성 억제기를 제거하는 축세포를 사용하여 presynapses에 있는 Munc18-1...

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Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse 형성은 적절한 순서로 시 냅 스 단백질의 축적을 포함 하 여 동적 과정. 이 방법에서, presynapse 형성은 "뉴런 볼" 배양물의 축축한 시트에 presynapse 조직 단백질과 공액된 구슬에 의해 유발되므로 시냅스 단백질의 축적은 presynapse 형성 동안 분석되기 쉽습니다.

Presynapse 형성 분석 전시 냅 스 주최자 구슬과 "뉴런 공" 문화를 사용 하 여

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

이 프로토콜은 전신 단백질이 어디에서 유래하는지 조사하기에 적합합니다: 세포 체 또는 축축. 그리고 시냅스 형성 중에 사전 시냅스 형태로 사전 합성 단백질이 축적되는 방법. 이 기술은 동시에 수천 개의 presynapses를 유도할 수 있으며, 축산기내의 많은 프리시냅스의 형성을 효율적으로 분석할 수 있도록 배양에서 축축을 유지하기 위해 특별한 장치를 사용하지 않는다.대학원생호나미와 함께 이 과정을 시연하는 것은 내 실험실에서 학부생인 리 이시이(Rie Ishii)가 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 안락사로 이 절차를 시작합니다. 복부를 해부하여 E16 배아를 얻습니다.미세 한 양포의 도움으로 배아에서 뇌를 조심스럽게 제거하고 HEPES 완충 염 용액 또는 HBSS의 4 밀리리터를 포함하는 60 mm 세포 배양 요리로 옮기. 수막을 제거하고 후각 전구를 잘라. 스테레오 현미경의 밑에 집게의 미세한 끝을 사용하여 각 대뇌 반구에서 각 코르티스를 분리하고 신선한 HBSS를 포함하는 또 다른 60 밀리미터 접시로 전송합니다.각 별도의 뉴런 볼 배양에 대해 적어도 3~5개의 배아를 사용하십시오. 라미나르 플로우 세포 배양 후드에 미세 한 초세 스프링 가위를 가진 작은 조각으로 코르티코를 잘라. 이제 다진 코르티체를 15밀리리터 튜브로 옮기게 합니다.섭씨 37도의 수조에서 4.5분 동안 HBSS에서 0.125%의 트립신4밀리리터로 다진 코르티스를 트립시비티. 멸균 전달 파이펫에 의해 HBSS의 10 밀리리터를 포함하는 새로운 15 밀리리터 튜브로 세포 응집체를 전송합니다. 이 단계를 한 번 더 반복하기 전에 섭씨 37도에서 5분간 배양하십시오.그런 다음 NGB 배지 2밀리리터, 0.01%DNase I 및 10%의 말 혈청을 포함하는 새로운 15밀리리터 튜브로 셀 응집체를 전송합니다. 시험화 된 코르티체를 반복적으로 피펫으로 세팅하여 불을 닦은 미세 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 3 ~ 5 번 피펫을 피우십시오. 뉴런 볼을 준비하기 위해, NGB 배지를 사용하여 밀리리터 당 백만 세포로 세포 현탁액의 세포 밀도를 조정합니다.문화 요리의 하단 부분에 PBS의 일곱 밀리리터를 추가합니다. 10센티미터 배양 접시의 상부 뚜껑 안쪽에 10, 000 세포를 포함하는 10 마이크로리터 매달려 방울로 피질 뉴런을 배양합니다. 뉴런 볼 형성을 허용하기 위해 가습 된 조건에서 5 %의 CO2와 3 7섭씨 37도에서 3 일 동안 인큐베이터에 요리를 보관하십시오.폴리-L-리신 또는 PLL을 파라핀 구슬 유리 커버에 60mm 접시에 코팅하여 산염 버퍼에서 밀리리터 PLL 용액당 15마이크로그램을 사용합니다. 섭씨 37도에서 CO2 인큐베이터에서 최소 한 시간 동안 보관하십시오. PBS로 4회 세척한 후, PLL 코팅 커버 슬립을 NGB 배지 350마이크로리터가 들어 있는 4웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 3개의 마이크로몰러 AraC를 장착합니다.아라C는 분할 세포를 죽일 미디어에 추가됩니다. CO2 인큐베이터에서 PLL 코팅 커버 슬립을 포함하는 4웰 플레이트를 적어도 20분 동안 배양하여 중간 크기의 온도가 섭씨 37도에 도달하도록 한 후 뉴런 볼을 이송합니다. DIV 3에서는 뉴런 볼이 잘 형성되면 PLL 코팅 커버 슬립으로 옮긴다.4웰 플레이트 안에는 웰당 5개의 뉴런 볼을 추가합니다. DIV 11에서 20 마이크로리터를 스트렙타비딘 코팅 자기 입자의 현탁액에서 마이크로센트심리후지 튜브로 이송한다. 비드를 네오디뮴 영구 자석으로 부착한 수제 장치에 고정하고 1.5밀리리터 마이크로센트심분리기 튜브에 PBS-MCBC 100마이크로리터로 세 번 세척한다.구슬에서 PBS-MCBC를 완전히 제거한 후, 세척된 구슬에 미리 정해진 볼륨의 LRRTM2 스톡을 추가합니다. 1 ~2 시간 동안 섭씨 4도에서 회전기를 사용하여 혼합물을 배양합니다. 인큐베이션에 이어 PBS-MCBC의 100마이크로리터로 구슬을 두 번 씻으실 수 있습니다.그런 다음, NGB 배지의 100 마이크로 리터로 구슬을 세척합니다. 뉴런 볼 배양에 적용하기 위해 NGB 배지 50마이크로리터로 LRRTM2 구슬을 재중단한다. 이제 스테레오 현미경 아래 면도날로 노란색 팁의 끝을 45도 각도로 잘라냅니다.뉴런 볼의 세포 체부위에 노란 팁 끝을 넣고 흡입에 의해 세포 체를 제거한다. LRRTM2를 적용하고 뉴런 볼 배양에 구슬을 제어합니다. 그런 다음 페릿 자석을 사용하여 1 분 동안 뉴런 볼 배양의 플레이트의 바닥에 구슬을 잠급하여 시냅스 형성을 시작합니다.이 절차를 통해 모든 구슬을 동시에 터치 다운할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 구슬을 가진 사전 시냅스 형성 후 뉴런 볼 배양에서 뉴런을 수정하고 얼룩지게 한다. 60X 오일 침지 렌즈를 사용하여 냉각된 CCD 카메라로 반전된 형광 현미경으로 차동 간섭 콘트라스트 및 면역 형광 이미지를 캡처합니다.축사내의 시냅스에서 면역형광 강도를 측정합니다. 구슬에 관심 영역의 면역 형광 강도를 사용합니다. 비드에서 20 미크론을 따라 축축 강도로 나누어 오프 구슬 영역 강도를 빼는.배경 강도를 뺀 값입니다. 이 비율 강도는 단백질 축적 지수를 제공합니다. LRRTM2 구슬로 유도된 프리시냅스에서 특정 단백질의 축적 수준을 정량화하려면, 항상 세포 체체와 는 별개로 두 가지 시야 이상의 영역을 선택한다.정확한 측정을 위해 커버슬립당 5개의 다른 축축필드를 선택하십시오. 여기에 비프 11뉴런 볼 배양에 LRRTM2 구슬의 적용이 뉴런 볼의 축록스의 사전 시냅스에서 문크18-1의 유도 축적이다. 뉴런 볼의 축하에 구슬은 위상 현미경 이미지에서 볼 수 있습니다.그리고 전시냅스 단백질의 축적은 면역 형광 심상에 의해 관찰된다. 세포체를 제거한 축산에서도, 문크18-1의 축적은 구슬 아래에서 관찰되었으며, 이는 세포체를 가진 뉴런 볼의 축축과 유사하게. 축산 시트의 주변 영역이 높은 배율 목표 렌즈에 의해 분석되었을 때, vGlut1 및 Munc18-1은 세포 체의 유무에 관계없이 축축의 프리시냅스에서 명확하게 축적되었다.시간 과정 실험은 프리시냅스에서 vGlut1의 축적이 30분에서 크게 증가했다는 것을 보여주었습니다. 한편, 문크18-1 누적은 2시간 만에 크게 증가하기 시작했고 4시간 만에 고원에 도달했다. 이러한 데이터는 시냅스 소포 단백질 vGlut1이 활성 영역 단백질 Munc18-1보다 일찍 프리시냅스에서 축적되었음을 나타낸다.Fmr1-KO 뉴런의 사전 시냅스에서 문크18-1 축적은 야생 형보다 1.5 배 증가하여 문크18-1 축적에서 FMRP의 참여를 나타냅니다. 단백질 합성 억제제, 애니소마이신은 세포 체의 유방부에서 문크18-1 축적을 현저히 억제하였다. 이것은 축적이 단백질 합성에 의존한다는 것을 나타냅니다.불을 연마한 미세 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 트립시화 된 코르티체를 피펫팅하는 것은 중요한 단계입니다. 실험자는 2~3개의 서로 다른 직경으로 불을 닦은 파이펫을 준비하고 적절한 직경의 파이펫을 선택했습니다. 이 절차를 사용하여 LRRTM2 구슬에 의해 유도된 프리시냅스에서 시냅스 방출을 라이브 이미징으로 측정합니다.이 추가 방법은 축산기에서 단백질 합성시 냅 스 방출의 규칙에 관련 된 여부에 대답 할 것 이다. 이 방법을 사용하여, 연구원은 사전 시냅스 단백질이 조직된 방식으로 presynapses에서 어떻게 축적되는지, 뿐만 아니라 사전 시냅스 단백질의 근원의 위치를 검사합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

치킨 청각 Brainstem 슬라이스의 준비 및 문화

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현<sub&gt;</sub&gt; 수용체

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...