Dette arbeidet støttes delvis av JSP Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Vi takker Dr. Terukazu Nogi og MS Hyunmin Neyazaki (Yokohama City University) for vennlig gi biotinylated LRRTM2 protein. Vi takker også Honami Uechi og Rite Ishii for teknisk assistanse.

Eksperimentene beskrevet i dette manuskriptet ble utført i henhold til retningslinjene skissert i den institusjonelle Animal Care og use Committee of the Yokohama City University.
1. utarbeidelse av Nevron baller som henger drop kultur (Days in vitro (DIV) 0-3)
Merk: prosedyrene som er beskrevet her for utarbeidelse av Nevron ball kultur er basert på metoden tidligere rapportert av Sasaki gruppe med noen modifikasjoner9,<s...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

Vi utviklet romanen metode for å undersøke presynapse formasjon stimulert med LRRTM2-perler bruker Nevron ball kultur. Tiden, de fleste av presynapse formasjon analysen inkluderer Poly-D-lysin (PDL)-belagte perler og dissosiert kultur/mikrovæskebasert kammer20,21,22. En av fordelene med denne metoden er LRRTM2-perler. Mens LRRTM2 samhandler med neurexin å danne eksitatoriske presynapses spesifikt11<su...

Synapse formasjon er en av kritiske skritt under utviklingen av Neural kretser1,2,3. Dannelse av synapser som er spesialiserte rom sammensatt av pre-og post-synapser er en kompleks og flertrinnsprosess som involverer hensiktsmessig anerkjennelse av axons og dendrites, dannelse av aktiv sone og postsynaptic tetthet, og riktig justering av ion-kanaler og signal-reseptorer1,2. I hver prosess, mange typer Synaptic proteiner akkumuleres til disse spesialiserte rom i riktig timing ved å transportere Synaptic proteiner fra celle organer og/eller av lokal oversettelse i avdelingene. Disse Synaptic proteinene anses å være arrangert på organisert måte for å danne funksjonelle synapser. Dysfunksjon av noen Synaptic proteiner som involverer synapse formasjon resulterer i nevrologiske sykdommer4,5. Men det er fortsatt uklart hvordan Synaptic proteiner akkumuleres i riktig timing.
For å undersøke hvordan Synaptic proteiner akkumuleres på organisert måte, er det nødvendig å undersøke akkumulering av Synaptic proteiner i kronologisk rekkefølge. Noen rapporter demonstrerte Live Imaging å observere synapse formasjon i dissosiert kultur av neurons6,7. Det er imidlertid tidkrevende å finne neurons som bare begynner synapse formasjon under mikroskopi. For å observere akkumulering av Synaptic proteiner effektivt, må synapse formasjon starte på den tiden da forskerne ønsker å indusere dannelsen. Den andre utfordringen er å skille akkumulering av Synaptic proteiner på grunn av transport fra celle organer eller lokal oversettelse i synapser. For dette formålet, er oversettelse nivå nødvendig for å bli målt under forutsetning som ikke tillater transport av Synaptic proteiner fra celle organer.
Vi utviklet romanen presynapse formasjon analysen ved hjelp av kombinasjon av Nevron ball kultur med perler å indusere presynapse formasjon8. Nevron ball kultur er utviklet for å undersøke axonal fenotype, på grunn av dannelsen av axonal ark rundt celle organer9,10. Vi brukte magnetiske perler bøyd med leucine-rik gjenta transmembrane neuronal 2 (LRRTM2) som er en presynaptiske nerve arrangør for å indusere eksitatoriske presynapses (figur 1a)11,12,13. Ved å bruke LRRTM2 perler, presynapse formasjon starter på den tiden da perlene påføres. Dette betyr at presynapse formasjon starter i tusenvis av axons av en Nevron ball på samme tid, og dermed gjør det mulig å undersøke presis tid løpet av opphopning av Synaptic proteiner effektivt. I tillegg er Nevron ball kultur lett å blokkere transport Synaptic proteiner fra Soma ved å fjerne celle organer (figur 1B)8. Vi har allerede bekreftet at axons uten celle organer kan overleve og er friske minst 4 h etter fjerning av celle organer. Dermed er denne protokollen egnet til å undersøke hvor Synaptic proteiner er avledet (celle kroppen eller axon), og hvordan Synaptic proteiner akkumuleres på organisert måte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Under neuronal utvikling, er synapse formasjon et viktig skritt for å etablere nevrale kretser. For å danne synapser, må Synaptic proteiner leveres i riktig rekkefølge ved transport fra celle organer og/eller lokal oversettelse i umodne synapser. Det er imidlertid ikke fullt ut forstått hvordan Synaptic proteiner akkumuleres i synapser i riktig rekkefølge. Her presenterer vi en ny metode for å analysere presynaptiske nerve formasjon ved hjelp av kombinasjonen av Nevron ball kultur med perler å indusere presynapse formasjon. Nevron baller som er neuronal celle aggregater gir axonal ark langt fra celle organer og dendrites, slik at svake fluorescerende signaler av presynapses kan oppdages ved å unngå overveldende signaler av celle organer. Som perler å utløse presynapse formasjon, bruker vi perler bøyd med leucine-rik gjenta transmembrane neuronal 2 (LRRTM2), en eksitatoriske presynaptiske nerve arrangør. Ved hjelp av denne metoden viste vi at flytande glutamat transporter 1 (vGlut1), en Synaptic vesicle protein, akkumulert i presynapses raskere enn Munc18-1, et aktivt sone protein. Munc18-1 akkumulert oversettelse-sortert i presynapse selv etter fjerning av celle organer. Dette funnet indikerer Munc18-1 akkumulering av lokal oversettelse i axons, ikke transport fra celle organer. Som konklusjon, denne metoden er egnet til å analysere opphopning av Synaptic proteiner i presynapses og kilde til Synaptic proteiner. Som Nevron ball kulturen er enkel og det er ikke nødvendig å bruke spesielle apparater, kan denne metoden være gjeldende for andre eksperimentelle plattformer.

Her viser vi representative resultater av akkumulering av presynaptiske nerve proteiner i LRRTM2-indusert presynapses av axonal ark av Nevron ball kultur. Som presynaptiske nerve proteiner, analyserte vi eksitatoriske Synaptic vesicle protein vGlut1 og den aktive sonen protein Munc18-1. Vi har også undersøkt tid løpet av akkumulering av vGlut1 og Munc18-1 i presynapses, og oppnådde resultater som indikerer kilden til Munc18-1 i presynapses bruker axons fjerne celle organer og en protein syntese inhibitor. Nylig har v...

Watch this Scientific Journal Video about Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and Ã¢â‚¬Å“Neuron BallÃ¢â‚¬Â Culture at JoVE.com

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse formasjon er en dynamisk prosess inkludert akkumulering av Synaptic proteiner i riktig rekkefølge. I denne metoden, presynapse formasjon utløses av perler bøyd med en presynapse arrangør protein på axonal ark av "Nevron ball" kultur, slik at opphopning av Synaptic proteiner er lett å bli analysert under presynapse formasjon.

Presynapse formasjon analysen bruke Presynapse Organizer perler og "Nevron ball" kultur

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Denne protokollen er egnet til å undersøke hvor presynaptiske proteiner stammer fra:cellelegemer eller aksoner. Og hvordan presynaptiske proteiner akkumuleres i presynapser på en organisert måte under synapseformasjonen. Denne teknikken kan indusere tusenvis av presynapser samtidig, og bruker ikke noe spesielt apparat for å opprettholde aksoner i kulturen som tillater effektiv analyse av dannelsen av mange presynapser i aksoner.Sammen med graduate student, Honami, demonstrere denne prosedyren vil være Rie Ishii, en lavere student i laboratoriet mitt. Begynn denne prosedyren med musen eutanasi som beskrevet i tekstprotokollen. Dissekere magen for å få E16 embryoer.Fjern hjernen fra embryoer nøye ved hjelp av fin-tipped tang, og overføre dem til 60-millimeter celle kultur retter som inneholder fire milliliter hepes bufret saltløsning eller HBSS. Fjern meninges og kutt olfaktorisk pære. Skill korttices fra hver cerebral halvkule ved hjelp av de fine spissene av tang under stereomikroskopet og overfør til en annen 60-millimeters tallerken som inneholder fersk HBSS.Bruk minst tre til fem embryoer for hver egen nevronballkultur. Skjær kortiklene i små biter med mikrodissecting vårsaks i en laminær strømningscellekulturhette. Nå overføre hakket kortika til en 15-milliliter tube.Trypsinize hakket kortika i fire milliliter på 0,125% trypsin i HBSS i 4,5 minutter i et vannbad på 37 grader Celsius. Overfør celleaggregatene til et nytt 15-milliliter rør som inneholder 10 milliliter HBSS med en steril overføringspipette. Inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter før du gjentar dette trinnet en gang til.Deretter overfører cellen aggregater til et nytt 15-milliliter rør som inneholder to milliliter NGB-medium, 0,01% DNase I og 10% hesteserum. Triturate trypsinized kortika ved gjentatte ganger pipettering dem opp og ned tre til fem ganger ved hjelp av en brannpolert fint glass Pasteur pipette. For å forberede nevron baller, justere celle tetthet i celle suspensjon til en million celler per milliliter ved hjelp av NGB medium.Legg til syv milliliter PBS til den nederste delen av kulturrettene. Kultur de kortikale nevronene som 10 mikroliter hengende dråper som inneholder 10.000 celler per dråpe inne i de øvre lokkene på 10-centimeter kulturretter. Hold oppvasken i en inkubator i tre dager ved 37 grader Celsius med 5% CO2 under fuktige forhold for å tillate nevronballdannelse.Coat poly-L-lysin eller PLL på parafin-beaded glass dekselet glir i 60-millimeter retter ved hjelp av en 15 mikrogram per milliliter PLL løsning i borate buffer. Hold dem i minst en time i en CO2 inkubator ved 37 grader Celsius. Etter vask fire ganger med PBS, overfør det PLL-belagte dekselet til en firebrønns plate som inneholder 350 mikroliter NGB-medium med tre mikromolar AraC i hver brønn.AraC legges til i media for å drepe skilleceller. Inkuber de firebrønnsplatene som inneholder PLL-belagte dekselslipp i CO2-inkubatoren i minst 20 minutter for å sikre at temperaturen på mediet når 37 grader Celsius før de overfører nevronballene. Ved DIV 3 når nevronballer dannes veldig bra, overfører du dem til PLL-belagte dekselslips.Inne i fire-brønnsplaten, legg til fem nevronballer per brønn. Ved DIV 11 overføre 20 mikroliter fra suspensjon av streptavidin-belagte magnetiske partikler til et mikrocentrifuge rør. Immobiliser perlene til et håndlaget apparat festet med neodymium permanente magneter og vask tre ganger med 100 mikroliter PBS-MCBC i 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør.Etter fullstendig fjerning av PBS-MCBC fra perlene, legg til et forhåndsbestemt volum av LRRTM2-lager til de vasket perlene. Inkuber blandingen ved hjelp av en rotator ved fire grader Celsius i en til to timer. Etter inkubasjon, vask perlene to ganger med 100 mikroliter PBS-MCBC.Vask deretter perlene med 100 mikroliter NGB-medium. Resuspend LRRTM2 perler i 50 mikroliter av NGB medium for påføring til neuron ball kultur. Klipp nå enden av en gul spiss i 45-graders vinkel med et barberblad under stereomikroskopet.Sett den gule spissen enden på cellekroppen området av en nevron ball og fjerne cellelegemer ved suging. Påfør LRRTM2 og kontroller perler på nevronballkulturen. Senk deretter perlene til bunnen av platene i nevronballkulturen i ett minutt ved hjelp av ferrittmagneter for å starte pre-synapsedannelse.Denne prosedyren sikrer å touchdown alle perler samtidig. Fiks og flekk nevronene i nevronballkulturen etter pre-synapseformasjon med perler som beskrevet i tekstprotokollen. Ta opp differensialkonferenskontrast og immunofluorescensbilder under et omvendt fluorescerende mikroskop med et avkjølt CCD-kamera ved hjelp av en 60X oljenedsenkingslinse.Mål immunofluorescence intensiteten i pre-synapser i axon. Bruk immunofluorescence intensiteter i regionen av interesse på perler. Minus av perlene regionintensitet delt på aksonær intensitet, langs 20 mikron fra perlene.Minus bakgrunnsintensitet. Denne ratiointensiteten gir proteinakkumuleringsindeksen. For å kvantifisere akkumuleringsnivået av et bestemt protein i en presynapse indusert med LRRTM2 perler, velg alltid området som er to synsfelt eller mer bortsett fra cellekroppen.For nøyaktig måling, velg fem forskjellige aksonale felt per dekkslipp. Vist her er anvendelsen av LRRTM2 perler i neuron ball kultur på DIV 11 indusert akkumulering av Munc18-1 i presynapser av aksoner av nevron baller. Perlene på aksoner av nevronballer er synlige i fasemikroskopibildene.Og akkumuleringen av presynaptiske proteiner observeres av immunofluorescence-bildene. Selv i aksoner som er fjernet cellelegemer, ble akkumulering av Munc18-1 observert under perlene, som ligner aksoner av nevronballer med cellelegemer. Når den perifere regionen av aksonalarket ble analysert av høy forstørrelsesmålslinse, akkumulerte vGlut1 og Munc18-1 tydelig i presynapser av aksoner under perlene med og uten cellelegemer.Tidsforløpseksperimenter viste at akkumulering av vGlut1 i presynapser økte betydelig ved 30 minutter. På den annen side begynte Munc18-1 akkumulering å øke betydelig på to timer og nådde et platå på fire timer. Disse dataene indikerer at det synaptiske vesikkelproteinet vGlut1 akkumuleres i presynapser tidligere enn det aktive soneproteinet Munc18-1.Munc18-1 akkumulering i presynapser av Fmr1-KO nevroner økte 1,5 ganger mer enn de i vill type, noe som indikerer involvering av FMRP i Munc18-1 akkumulering. Proteinsyntesehemmer, anisomycin, undertrykte Munc18-1 akkumulering betydelig i aksoner med og uten cellelegemer. Dette indikerer at akkumuleringen er proteinsynteseavhengig.Pipetting trypsinized kortika ved hjelp av en brannpolert fint glass Pasteur pipette er et viktig skritt. Eksperimenterere forbereder de brannpolerte pipettene med to til tre forskjellige diametere, og valgte en pipette med en passende diameter. Ved hjelp av denne prosedyren måles synaptisk frigjøring fra presynapser indusert av LRRTM2 perler ved levende bildebehandling.Denne ekstra metoden vil svare på om proteinsyntese i aksoner er involvert i reguleringen av synaptisk frigjøring. Ved hjelp av denne metoden undersøker forskerne hvordan presynaptiske proteiner akkumuleres i presynapser på en organisert måte, samt plasseringen av kilden til presynaptiske proteiner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolasjon og utvidelse av Human glioblastoma multiforme kreftceller Bruke Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analysere DNA-skader i hippocampus Neurons kometsystemet

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolasjon og kultur av mus Kortikale Astrocytes

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Hemmende Synapse Dannelse i en Co-kultur Modell innlemme gabaergic Medium Tifotkreps nevroner og HEK293 Cells stabilt uttrykker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Reseptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse av Utvikling Tooth Germ Innervasjon Bruke mikrofluid Co-kultur Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-celle måling av Odorant reseptor aktivisering benytter en sanntid leiren analysen

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live bildebehandling av primære hjernebarken celler ved hjelp av en 2D kultur-systemet

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...