Эта работа частично поддерживается JSPS Грант-в-помощь для научных исследований (KAKENHI) (C) (No 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Сасаки). Мы благодарим д-ра Терукадзу Ноги и г-жу Макико Неязазаки (Городской университет Иокогамы) за любезное предоставление биотинилапопротого белка LRRTM2. Мы также благодарим Хонами Уэчи и Ри Исии за техническую помощь.

Эксперименты, описанные в этой рукописи, были проведены в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Институциональном комитете по уходу за животными и использованию Иокогамского городского университета.
1. Подготовка нейронных шаров как висячая культура пад...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

Мы разработали новый метод для изучения образования пресинапсов, стимулируемых LRRTM2-шариками с использованием культуры нейронного шара. В настоящее время большая часть пресинапсового образования асса включает в себя поли-D-лизин (PDL)покрытием бисера и диссоциированной культуры / микро?...

Формирование синапса является одним из важнейшихшагов при развитии нейронных цепей 1,2,3. Формирование синапсов, которые являются специализированными отсеками, состоящими из до- и пост-синапсов, представляет собой сложный и многоступенчатый процесс, включающий соответствующее распознавание аксонов и дендритов, формирование активной зоны и постсинаптической плотности, а также правильное выравнивание ионных каналов и нейромедиаторов рецепторов1,2. В каждом процессе, много видов синаптических протеинов аккумулируют к этим специализированным отсекам в правильном времени путем транспортировать синаптические протеины от тел клетки and/or местным переводом в отсеках. Эти синаптические белки считаются организованными, чтобы сформировать функциональные синапсы. Дисфункция некоторых синаптических белков, связанных собразованием синапсов, приводит к неврологическим заболеваниям 4,5. Тем не менее, остается неясным, как синаптические белки накапливаются в надлежащее время.
Чтобы исследовать, как синаптические белки накапливаются организованно, необходимо изучить накопление синаптических белков в хронологическом порядке. Некоторые доклады продемонстрировали живой визуализации наблюдать образование синапсов в разрозненных культуры нейронов6,7. Тем не менее, это отнимает много времени, чтобы найти нейроны, которые только начинают образование синапсов под микроскопией. Чтобы эффективно наблюдать накопление синаптических белков, образование синапса должно начинаться в то время, когда исследователи хотят вызвать образование. Вторая задача состоит в том, чтобы различать накопление синаптических белков из-за переноса из клеточных тел или локального перевода в синапсы. Для этого уровень перевода необходимо измерять при условии, что не допускается перенос синаптических белков из клеточных органов.
Мы разработали новый анализ формирования пресинапсов с использованием сочетания культуры нейронного шара с бисером, чтобы вызвать формирование пресинапсов8. Нейрон мяч культуры разработан для изучения аксонального фенотипа, в связи с образованием аксональных листов окружающих клеточных органов9,10. Мы использовали магнитные бусы, спряженые с леуцином богатых повторить трансмембранных нейронов 2 (LRRTM2), который является пресинаптическим организатором, чтобы вызвать возбуждающие presynapses (Рисунок 1A)11,12,13. С помощью бисера LRRTM2, образование presynapse начинается в то время, когда бусы применяются. Это означает, что формирование пресинапсов начинается в тысячах аксонов нейронного шара в одно и то же время, что позволяет эффективно изучить точный временной ход накопления синаптических белков. Кроме того, культуры нейронов мяч легко блокировать транспортные синаптические белки от сомы, удалив клеточные тела(Рисунок 1B)8. Мы уже подтвердили, что аксоны без клеточных тел могут выжить и здоровы по крайней мере 4 ч после удаления клеточных тел. Таким образом, этот протокол подходит для исследования, откуда получаются синаптические белки (клеточная часть тела или аксон) и как синаптические белки аккумулируются организованно.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Во время развития нейронов, формирование синапса является важным шагом для создания нейронных цепей. Для формирования синапсов синаптические белки должны поставляться в надлежащем порядке путем транспортировки из клеточных органов и/или локального перевода в незрелые синапсы. Тем не менее, не до конца понял, как синаптические белки накапливаются в синапсах в надлежащем порядке. Здесь мы представляем новый метод анализа пресинаптического образования с помощью сочетания культуры нейронного шара с бисером, чтобы вызвать формирование пресинапсов. Нейронные шары, которые нейронных клеточных агрегатов обеспечивают аксональные листы вдали от клеточных тел и дендритов, так что слабые флуоресцентные сигналы пресинапсов могут быть обнаружены, избегая подавляющих сигналов клеточных тел. В качестве бисера, чтобы вызвать образование пресинапсов, мы используем бисер, спряженый с леуцином богатых повторить трансмембранных нейронов 2 (LRRTM2), возбуждающие пресинаптический организатор. Используя этот метод, мы продемонстрировали, что везикулярный глутаматный транспортер 1 (vGlut1), синаптический протеин везикл, накопленный в пресинапсах быстрее, чем Munc18-1, активный белок зоны. Munc18-1 накопился перевод-зависимо в presynapse даже после удаления клеточных органов. Этот вывод указывает на накопление Munc18-1 путем локального перевода в аксоны, а не транспорт из клеточных тел. В заключение, этот метод подходит для анализа накопления синаптических белков в пресинапсах и источнике синаптических белков. Поскольку культура нейронного шара проста и не обязательно использовать специальный аппарат, этот метод может быть применим к другим экспериментальным платформам.

Здесь мы показываем репрезентативные результаты накопления пресинапических белков в LRRTM2-индуцированных пресинапсах аксональных листов культуры нейронного шара. Как пресинаптические белки, мы проанализировали возбуждая синаптический протеин везикл vGlut1 и активный белок зоны Munc18-1. М?...

Watch this Scientific Journal Video about Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and Ã¢â‚¬Å“Neuron BallÃ¢â‚¬Â Culture at JoVE.com

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Формирование пресинапсов является динамичным процессом, включая накопление синаптических белков в надлежащем порядке. В этом методе, presynapse образование вызвано бисером конъюгированный с протеином presynapse протеин на аксональных листах культуры «нейронного шара», так что накопление синаптических белков легко быть проанализированным во время образования presynapse.

Presynapse Формирование Ассас использованием Presynapse Организатор бисера и "Нейрон мяч" Культура

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Этот протокол подходит для исследования того, где происходят пресинаптические белки: клеточные тела или аксоны. И как пресинаптические белки накапливаются в пресинапсах организованным образом во время формирования синапса. Этот метод может вызвать тысячи пресинапсов в то же время, и не использует какой-либо специальный аппарат для поддержания аксонов в культуре позволяет эффективный анализ формирования многих презинапсов в аксоны.Вместе с аспирантом Хонами, демонстрируя эту процедуру, будет Рие Исии, студент моей лаборатории. Начните эту процедуру с эвтаназии мыши, как описано в текстовом протоколе. Рассекаете живот, чтобы получить эмбрионы E16.Удалите мозг из эмбрионов тщательно с помощью тонкой наконечником типсов, и передать их в 60-миллиметровой клеточной культуры блюда, содержащие четыре миллилитров HEPES буферного раствора соли или HBSS. Снимите околис и вырежьте обонятельную луковицу. Отдельные кортисы из каждого полушария головного мозга с использованием тонких кончиков типсов под стерео микроскопом и передачи на другой 60-миллиметровый блюдо, содержащее свежие HBSS.Используйте по крайней мере три-пять эмбрионов для каждой отдельной культуры нейронного шара. Разрежьте кортис на мелкие кусочки с микродиссекцией весенних ножниц в ламинарном капюшоне культуры потока. Теперь перенесите рубленые кортисы в 15-миллилитровую трубку.Трипсинизировать фарш кортис в четырех миллилитров 0,125%трипсина в HBSS в течение 4,5 минут в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Перенесите агрегаты клеток в новую 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров HBSS стерильной трубой передачи. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем повторить этот шаг еще раз.Затем перенесите агрегаты клеток в новую 15-миллилитровую трубку, содержащую два миллилитров NGB среднего, 0,01% DNase I и 10%лошадиную сыворотку. Тритурат трипсинизированных кортишей, неоднократно трубы их вверх и вниз три-пять раз с помощью огнеполированной тонкой стеклянной пипетки Пастера. Для подготовки нейронных шаров, настроить плотность клеток в клеточной подвески до одного миллиона клеток на миллилитр с помощью NGB среды.Добавьте семь миллилитров PBS в нижнюю часть культурных блюд. Культура корковых нейронов, как 10 микролитер висячие капли, содержащие 10000 клеток на каплю внутри верхних крышек 10-сантиметровой культуры блюд. Держите блюда в инкубаторе в течение трех дней при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в увлажненных условиях, чтобы обеспечить образование нейронного шара.Пальто поли-L-лизин или PLL на парафин бисером стеклянная крышка скользит в 60-миллиметровых блюд с использованием 15 микрограмм на миллилитр PLL раствор в буфере бората. Держите их в течение по крайней мере одного часа в инкубаторе CO2 при 37 градусах по Цельсию. После мытья четыре раза с PBS, передача PLL покрытием крышки скользит на четыре хорошо пластины, содержащие 350 микролитров NGB среды с тремя микромолярной AraC в каждой хорошо.AraC добавляется в средства массовой информации, чтобы убить разделительные ячейки. Инкубировать четыре хорошо пластин, содержащих PLL покрытие скользит в инкубаторе CO2, по крайней мере 20 минут, чтобы обеспечить температуру среды достигает 37 градусов по Цельсию перед передачей нейрон шаров. На DIV 3, когда нейрон шары образуются очень хорошо, передать их на PLL покрытием крышки скользит.Внутри четырех-хорошо пластины, добавить пять нейронов шары на колодец. При DIV 11 передают 20 микролитров из подвески магнитных частиц со стрептавидином в микроцентрифугную трубку. Обездвижить бисер к аппарату ручной работы, прикрепленного с постоянными магнитами неодимия, и трижды промыть 100 микролитров PBS-MCBC в 1,5-миллилитровых микроцентрифуговых трубках.После полного удаления PBS-MCBC из бисера, добавить предопределенный объем запасов LRRTM2 в вымытые бусы. Инкубировать смесь с помощью ротатора при четырех градусах по Цельсию в течение одного-двух часов. После инкубации, мыть бисер дважды с 100 микролитров PBS-MCBC.Затем вымойте бисер 100 микролитров ngB среды. Resuspend шарики LRRTM2 в 50 микролитров среды NGB для применения к культуре шарика нейрона. Теперь вырежьте конец желтого кончика под углом 45 градусов лезвием бритвы под стерео микроскопом.Положите желтый конец кончика на клеточной области тела нейрона мяч и удалить тела клеток путем всасывания. Применить LRRTM2 и контролировать бисер на нейронов мяч культуры. Затем погрузите шарики в нижней части пластин нейрона мяч культуры в течение одной минуты с помощью ферритовых магнитов, чтобы начать предварительное образование синапса.Эта процедура обеспечивает приземление всех бусин одновременно. Исправить и пятно нейронов в нейроне мяч культуры после предварительного формирования синапса с бисером, как описано в текстовом протоколе. Захват дифференциального интерференционного контраста и иммунофлуоресценции изображений под перевернутым флуоресцентным микроскопом с помощью охлажденой камеры CCD с помощью объектива погружения масла 60X.Измерьте интенсивность иммунофторесценции в предсинапсах в аксоне. Используйте иммунофлуоресценции интенсивности области интереса на бисер. Минус интенсивность области бусин, разделенных на аксональной интенсивности, вдоль 20 микрон из бисера.Минус фоновая интенсивность. Эта интенсивность соотношения обеспечивает индекс накопления белка. Для количественной оценки уровня накопления определенного белка в пресинапсе, индуцированном бисером LRRTM2, всегда выберите область, которая является двумя полями зрения или более отдельно от клеточного тела.Для точного измерения выберите пять различных аксональных полей на крышку. Здесь показано применение LRRTM2 шариков в культуру нейронного шара на DIV 11 индуцированного накопления Munc18-1 в presynapses аксонов нейронных шаров. Бусы на аксонах нейронных шаров видны на изображениях фазовой микроскопии.А накопление пресинаптических белков наблюдается по изображениям иммунофлюоресценции. Даже в аксонах, которые удаляются клеточные тела, накопление Munc18-1 наблюдалось под бисером, похожим на аксоны нейронных шаров с клеточными телами. Когда периферическая область аксонального листа была проанализирована высоким увеличением объективной линзы, vGlut1 и Munc18-1 накопились четко в пресинапсах аксонов под бисером с и без клеточных тел.Эксперименты курса времени показали, что накопление vGlut1 в пресинапсах значительно увеличилось на 30 минут. С другой стороны, накопление Munc18-1 начало значительно увеличиваться в два часа и достигло плато в четыре часа. Эти данные свидетельствуют о том, что синаптический везикулярный белок vGlut1 накапливается в пресинапсах раньше, чем активный белок зоны Munc18-1.Накопление Munc18-1 в пресинапсах нейронов Fmr1-KO увеличилось в 1,5 раза больше, чем в диком типе, что свидетельствует об участии FMRP в накоплении Munc18-1. Ингибитор синтеза белка, анисомицин, значительно подавлял накопление Munc18-1 в аксонах с телами клеток и без них. Это указывает на то, что накопление зависит от синтеза белка.Трубопровод трипсинизированных корти с использованием огнеполированной тонкой стеклянной пипетки Pasteur является важным шагом. Экспериментаторы готовят огнеуемые пипетки двух-трех разных диаметров и выбирают пипетки соответствующего диаметра. Используя эту процедуру, синаптический релиз от пресинапсов, индуцированных бусинками LRRTM2, измеряется живой визуализацией.Этот дополнительный метод даст ответ на вопрос, участвует ли синтез белка в аксоне в регуляции синаптической высвобождения. Используя этот метод, исследователи изучают, как пресинаптические белки накапливаются в пресинапсах организованным образом, а также расположение источника пресинаптических белков.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Подготовка и культуры Куриные ломтики Слуховые мозга

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширения человеческих клеток глиобластомы мозга Опухоль Использование Neurosphere Пробирной

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Пробирного повреждений ДНК в нейронах гиппокампа с помощью комет

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Формирование в совместной культуре модель, включающая ГАМКергические средний Колючие нейронов и клеток НЕК293, стабильно экспрессирующих GABA<sub&gt;</sub&gt; Рецепторы

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Анализ Разработка зуб Микроб иннервации Использование Микрожидкостных Сотрудничество культуры устройств

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Жить клеточной измерение одоранта рецептор активации с помощью реального времени лагеря Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Живой изображений клеток первичной коры головного мозга, с использованием системы 2D культуры

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...