Este trabajo está respaldado en parte por JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (No 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Agradecemos al Dr. Terukazu Nogi y a la Sra. Makiko Neyazaki (Universidad de la Ciudad de Yokohama) por proporcionar amablemente proteína lRRTM2 biotinilada. También damos las gracias a Honami Uechi y Rie Ishii por su asistencia técnica.

Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las directrices descritas en el Comité Institucional de Cuidado y Uso De Animales de la Universidad de la Ciudad de Yokohama.
1. Preparación de bolas de neuronas como cultivo de gota colgante (Días in vitro (DIV) 0-3)
NOTA: Los procedimientos descritos aquí para la preparación del cultivo de bolas de neuronas se basan en el método previamente reportado por el grupo Sasaki con alg...

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	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

Desarrollamos un método novedoso para examinar la formación de presinapnasa estimulada con LRRTM2-perlas utilizando el cultivo de bolas de neuronas. Actualmente, la mayor parte del ensayo de formación de presinapestos incluye cuentas recubiertas de poli-D-lisina (PDL) y cultivo disociado/cámara microfluídica20,21,22. Una de las ventajas de este método es LRRTM2-beads. Mientras que LRRTM2 interactúa con la neurexina para f...

La formación de sinapsis es uno de los pasos críticos durante el desarrollo de los circuitos neuronales1,2,3. La formación de sinapsis especializadas compuestas por pre y post-sinapsis es un proceso complejo y multipaso que implica el reconocimiento adecuado de los axónes y dendritas, la formación de la zona activa y la densidad postsináptica, y la alineación adecuada de canales ióniónicos y receptores de neurotransmisores1,2. En cada proceso, muchos tipos de proteínas sinápticas se acumulan en estos compartimentos especializados en el momento adecuado mediante el transporte de proteínas sinápticas de los cuerpos celulares y / o por traducción local en los compartimentos. Estas proteínas sinápticas se consideran dispuestas de manera organizada para formar sinapsis funcionales. La disfunción de algunas proteínas sinápticas que implican la formación de sinapsis da como resultado enfermedades neurológicas4,5. Sin embargo, sigue sin estar claro cómo se acumulan las proteínas sinápticas en el momento adecuado.
Para investigar cómo se acumulan las proteínas sinápticas de forma organizada, es necesario examinar la acumulación de proteínas sinápticas en orden cronológico. Algunos informes demostraron imágenes en vivo para observar la formación de sinapsis en el cultivo disociado de las neuronas6,7. Sin embargo, es lento encontrar neuronas que simplemente comienzan la formación de sinapsis bajo microscopía. Para observar la acumulación de proteínas sinápticas eficientemente, la formación de sinapsis debe comenzar en el momento en que los investigadores quieren inducir la formación. El segundo desafío es distinguir la acumulación de proteínas sinápticas debido al transporte de los cuerpos celulares o la traducción local en sinapsis. Para ello, es necesario medir el nivel de traducción bajo la condición que no permite el transporte de proteínas sinápticas de los cuerpos celulares.
Desarrollamos un nuevo ensayo de formación de presinapsis utilizando la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis8. El cultivo de la bola de neuronas se desarrolla para examinar el fenotipoaxonal, debido a la formación de láminas axonales que rodean los cuerpos celulares 9,10. Utilizamos cuentas magnéticas conjugadas con la reacción transmembrana neuronal 2 (LRRTM2) rica en leucina que es un organizador presináptico para inducir presinapciones excitatorias (Figura1A)11,12,13. Mediante el uso de las perlas LRRTM2, la formación de presinapsivas comienza en el momento en que se aplican las perlas. Esto significa que la formación de presinapsis comienza en miles de axónes de una bola de neurona al mismo tiempo, por lo que permite examinar el curso preciso del tiempo de acumulación de proteínas sinápticas de manera eficiente. Además, el cultivo de bolas de neuronas es fácil de bloquear las proteínas sinápticas de transporte del soma mediante la eliminación de cuerpos celulares (Figura 1B)8. Ya hemos confirmado que los axons sin cuerpos celulares pueden sobrevivir y están sanos al menos 4 h después de la eliminación de los cuerpos celulares. Por lo tanto, este protocolo es adecuado para investigar de dónde se derivan las proteínas sinápticas (cuerpo celular o axón), y cómo se acumulan las proteínas sinápticas de manera organizada.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Durante el desarrollo neuronal, la formación de sinapsis es un paso importante para establecer circuitos neuronales. Para formar sinapsis, las proteínas sinápticas deben suministrarse en el orden adecuado mediante el transporte desde cuerpos celulares y/o la traducción local en sinapsis inmaduras. Sin embargo, no se entiende completamente cómo las proteínas sinápticas se acumulan en las sinapsis en el orden correcto. Aquí, presentamos un método novedoso para analizar la formación presináptica mediante el uso de la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis. Las bolas neuronales que son agregados de células neuronales proporcionan hojas axonales lejos de los cuerpos celulares y dendritas, de modo que las señales fluorescentes débiles de las presinapciones pueden detectarse evitando señales abrumadoras de cuerpos celulares. Como perlas para desencadenar la formación de presinapsis, utilizamos cuentas conjugadas con la repetición de leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), un organizador presináptico excitatorio. Usando este método, demostramos que el transportador de glutamato vesicular 1 (vGlut1), una proteína de vesícula sináptica, acumulada en presinapciones más rápido que Munc18-1, una proteína de zona activa. Munc18-1 acumuló la traducción dependiente en la presinapsis incluso después de eliminar los cuerpos celulares. Este hallazgo indica la acumulación munc18-1 por traducción local en axónes, no el transporte desde cuerpos celulares. En conclusión, este método es adecuado para analizar la acumulación de proteínas sinápticas en presinapis y fuente de proteínas sinápticas. Como el cultivo de bolas de neuronas es simple y no es necesario utilizar aparatos especiales, este método podría ser aplicable a otras plataformas experimentales.

Aquí, mostramos resultados representativos de acumulación de proteínas presinápticas en presinapciones inducidas por LRRTM2 de hojas axonales del cultivo de bolas de neuronas. Como proteínas presinápticas, analizamos la proteína de vesícula sináptica excitatoria vGlut1 y la proteína de zona activa Munc18-1. También examinamos el curso de tiempo de acumulación de vGlut1 y Munc18-1 en presinapciones, y obtuvimos resultados que indican la fuente de Munc18-1 en presinapciones utilizando axones eliminando cuerpos ...

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Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

La formación de presinapsis es un proceso dinámico que incluye la acumulación de proteínas sinápticas en el orden correcto. En este método, la formación de presináptica se desencadena por perlas conjugadas con una proteína organizadora de la presinapsis en láminas axonales del cultivo de "bola de neurona", por lo que la acumulación de proteínas sinápticas es fácil de analizar durante la formación de la presinapsis.

Ensayo de formación de presinapse utilizando cuentas organizadoras de presinapsiona y cultura de "Bola de neurona"

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Este protocolo es adecuado para investigar dónde se originan las proteínas presinápticas: cuerpos celulares o axones. Y cómo las proteínas presinápticas se acumulan en las presinapipsas de una manera organizada durante la formación de la sinapsis. Esta técnica puede inducir miles de presinápsias al mismo tiempo, y no utiliza ningún aparato especial para mantener los axones en el cultivo permitiendo un análisis eficiente de la formación de muchas presinepsas en axones.Junto con el estudiante de posgrado, Honami, demostrando este procedimiento estará Rie Ishii, un estudiante de pregrado en mi laboratorio. Comience este procedimiento con la eutanasia del ratón como se describe en el protocolo de texto. Disecciona el abdomen para obtener embriones E16.Retire los cerebros de los embriones cuidadosamente con la ayuda de fórceps de punta fina, y transfieralos a platos de cultivo celular de 60 milímetros que contengan cuatro mililitros de solución de sal tamponada HEPES o HBSS. Retire las meninges y corte la bombilla olfativa. Separe los cortices de cada hemisferio cerebral utilizando las puntas finas de los fórceps bajo el microscopio estéreo y transfiera a otro plato de 60 milímetros que contenga HBSS fresco.Utilice al menos de tres a cinco embriones para cada cultivo de bola de neurona separado. Corte los cortices en trozos pequeños con tijeras de resorte microdisección en una capucha de cultivo de células de flujo laminar. Ahora, transfiera los cortices picados a un tubo de 15 mililitros.Trypsinize los cortices picados en cuatro mililitros de 0.125%trypsin en HBSS durante 4.5 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Transfiera los agregados celulares a un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS mediante una pipeta de transferencia estéril. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos antes de repetir este paso una vez más.Luego transfiera los agregados celulares a un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de medio NGB, 0.01%DNase I, y 10%caballos de suero. Triturar los cortices tripsias pipetándolos repetidamente hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces usando una pipeta Pasteur de vidrio fino pulido al fuego. Para preparar bolas de neurona, ajuste la densidad celular en la suspensión celular a un millón de células por mililitro utilizando el medio NGB.Añadir siete mililitros de PBS a la parte inferior de los platos de cultivo. Cultiva las neuronas corticales como 10 gotas colgantes de microlitro que contienen 10.000 células por gota dentro de los párpados superiores de los platos de cultivo de 10 centímetros. Mantener los platos en una incubadora durante tres días a 37 grados Celsius con 5%CO2 en condiciones humidificadas para permitir la formación de bolas de neuronas.Recubrir poli-L-lisina o PLL en la cubierta de vidrio con cuentas de parafina se desliza en platos de 60 milímetros utilizando una solución PLL de 15 microgramos por mililitro en tampón de borato. Guárdalos durante al menos una hora en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados. Después de lavar cuatro veces con PBS, transfiera los resbalones de la cubierta recubiertos de PLL a una placa de cuatro pozos que contenga 350 microlitros de medio NGB con tres AraC micromolares en cada pozo.AraC se agrega a los medios para matar las células divisorias. Incubar las placas de cuatro pozos que contienen los resbalones de cubierta recubiertos de PLL en la incubadora de CO2 durante al menos 20 minutos para asegurar que la temperatura del medio alcance los 37 grados centígrados antes de transferir las bolas de la neurona. En el DIV 3 cuando las bolas de neurona se forman muy bien, transfiéralas a los resbalones de la cubierta recubiertos de PLL.Dentro de la placa de cuatro pozos, añadir cinco bolas de neuronas por pozo. En DIV 11 transfiera 20 microlitros de la suspensión de partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina a un tubo de microcentrífuga. Inmovilice las perlas a un aparato hecho a mano unido con imanes permanentes de neodimio y lave tres veces con 100 microlitros de PBS-MCBC en tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitros.Después de eliminar completamente PBS-MCBC de las perlas, agregue un volumen predeterminado de material LRRTM2 a las perlas lavadas. Incubar la mezcla usando un rotador a cuatro grados centígrados durante una a dos horas. Después de la incubación, lave las cuentas dos veces con 100 microlitros de PBS-MCBC.A continuación, lave las perlas con 100 microlitros de medio NGB. Resuspender las perlas LRRTM2 en 50 microlitros de medio NGB para su aplicación en el cultivo de bolas de neurona. Ahora corta el extremo de una punta amarilla en ángulo de 45 grados con una cuchilla de afeitar debajo del microscopio estéreo.Coloque el extremo amarillo de la punta en el área del cuerpo celular de una bola de neurona y retire los cuerpos celulares por succión. Aplique el LRRTM2 y controle las cuentas en el cultivo de la bola de neurona. A continuación, sumerja las cuentas en la parte inferior de las placas del cultivo de la bola de neurona durante un minuto utilizando imanes de ferrita para iniciar la formación de presinapasa.Este procedimiento garantiza el retoque de todas las cuentas al mismo tiempo. Fijar y manchar las neuronas en el cultivo de la bola de neurona después de la formación de presinapasa con cuentas como se describe en el protocolo de texto. Capture imágenes de inmunofluorescencia y contraste de interferencia diferencial bajo un microscopio fluorescente invertido con una cámara CCD enfriada utilizando una lente de inmersión de aceite 60X.Mida la intensidad de la inmunofluorescencia en presinapsis en el axón. Utilice intensidades de inmunofluorescencia de la región de interés en las cuentas. Menos la intensidad de la región de las cuentas dividida por la intensidad axonal, a lo largo de 20 micras de las cuentas.Menos intensidad de fondo. Esta intensidad de relación proporciona el índice de acumulación de proteínas. Para cuantificar el nivel de acumulación de una proteína en particular en una presinapasa inducida con cuentas LRRTM2, seleccione siempre el área que es dos campos de visión o más aparte del cuerpo celular.Para una medición precisa, elija cinco campos axonales diferentes por cubreobjetos. Aquí se muestra la aplicación de cuentas LRRTM2 en el cultivo de bolas de neurona en la acumulación inducida DIV 11 de Munc18-1 en presinanapses de axones de bolas de neuronas. Las perlas en los axones de las bolas de neuronas son visibles en las imágenes de microscopía de fase.Y la acumulación de proteínas presinápticas se observa por las imágenes de inmunofluorescencia. Incluso en los axones que se eliminan los cuerpos celulares, la acumulación de Munc18-1 se observó debajo de las cuentas, similar a los axones de las bolas de neurona con cuerpos celulares. Cuando la región periférica de la hoja axonal fue analizada por lente objetivo de alto aumento, vGlut1 y Munc18-1 se acumularon claramente en presynapsas de axones debajo de las cuentas con y sin cuerpos celulares.Los experimentos de curso de tiempo demostraron que la acumulación de vGlut1 en presynapses aumentó significativamente a los 30 minutos. Por otro lado, la acumulación Munc18-1 comenzó a aumentar significativamente a las dos horas y alcanzó una meseta a las cuatro horas. Estos datos indican que la proteína de vesícula sináptica vGlut1 se acumula en presynapses antes que la proteína de zona activa Munc18-1.La acumulación Munc18-1 en presinanapses de las neuronas Fmr1-KO aumentó 1,5 veces más que las de tipo salvaje, lo que indica la implicación de FMRP en la acumulación de Munc18-1. Inhibidor de la síntesis de proteínas, anisomycin, suprimió la acumulación Munc18-1 significativamente en axones con y sin cuerpos celulares. Esto indica que la acumulación depende de la síntesis de proteínas.Pipetear los cortices tripsintanos utilizando una pipeta Pasteur de vidrio fino pulido al fuego es un paso importante. Los experimentadores preparan las pipetas pulidas por el fuego con dos o tres diámetros diferentes, y eligieron una pipeta con un diámetro adecuado. Con este procedimiento, la liberación sináptica de presinápsas inducidas por perlas LRRTM2 se mide mediante imágenes en vivo.Este método adicional respondería si la síntesis de proteínas en axones está involucrada en la regulación de la liberación sináptica. Utilizando este método, los investigadores examinan cómo las proteínas presinápticas se acumulan en las presinanaps de una manera organizada, así como la ubicación de la fuente de proteínas presinápticas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

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Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Investigación

Neurociencias

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Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

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La formación de sinapsis inhibitorias en una Co-cultura modelo que incorpora GABAérgicas Mediano espinosas neuronas y células HEK293 que expresan establemente GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptores

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