Detta arbete stöds delvis av JSPS Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning (KAKENHI) (C) (nr 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Vi tackar Dr terukazu Nogi och MS Makiko neyazaki (Yokohama City University) för vänligt tillhandahållande en LRRTM2 protein. Vi tackar även Honami Uechi och Rie Ishii för teknisk assistans.

De experiment som beskrivs i detta manuskript utfördes enligt de riktlinjer som beskrivs i den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Yokohama City University.
1. beredning av neuron bollar som hängande Drop kultur (Days in vitro (DIV) 0-3)
Anmärkningar: de förfaranden som beskrivs här för beredning av neuron boll kultur är baserade på den metod som tidigare rapporterats av Sasaki gruppen med några ändringar9</s...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

Vi utvecklade ny metod för att undersöka presynapse formation stimuleras med LRRTM2-pärlor med hjälp av neuron boll kultur. För närvarande, de flesta av presynapse formation assay innehåller Poly-D-lysin (PDL)-belagda pärlor och dissocierade kultur/microfluidic kammare20,21,22. En av fördelarna med denna metod är LRRTM2-pärlor. Medan LRRTM2 interagerar med neurexin att bilda excitatoriska presynapser specifikt<sup cla...

Synapsebildande är ett av kritiskt kliver under utveckling av neural går runt1,2,3. Bildandet av synapser som är specialiserade avdelningar består av pre-och post-synapser är en komplex och flerstegs process som inbegriper lämpligt erkännande av axoner och dendriter, bildandet av aktiv zon och postsynaptisk densitet, och korrekt anpassning av jonkanaler och signalsubstans receptorer1,2. I varje process, många typer av synaptiska proteiner ackumuleras till dessa specialiserade fack i rätt timing genom att transportera synaptiska proteiner från cell kroppar och/eller lokal översättning i avdelningarna. Dessa synaptiska proteiner är ansedda att vara ordnade i organiserat sätt för att bilda funktionella synapses. Dysfunktion av vissa synaptiska proteiner som involverar synapsen bildas resulterar i neurologiska sjukdomar4,5. Emellertid, det är fortfarande oklart hur synaptiska proteiner ackumuleras i rätt timing.
För att undersöka hur synaptiska proteiner ackumuleras i organiserat sätt, är det nödvändigt att undersöka ackumulering av synaptiska proteiner i kronologisk ordning. Vissa rapporter visade Live Imaging att observera synapsen bildas i dissocierad kultur av nervceller6,7. Emellertid, det är tidskrävande att hitta nervceller som bara startar synapsen bildas under mikroskopi. Att observera ackumulering av synaptiska proteiner effektivt, synapsen bildas måste starta vid den tidpunkt då forskare vill inducera bildandet. Den andra utmaningen är att skilja ackumulering av synaptiska proteiner på grund av transport från cell kroppar eller lokal översättning i synapser. För detta ändamål är översättnings nivån nödvändig för att mätas under det tillstånd som inte tillåter transport av synaptiska proteiner från cell kroppar.
Vi utvecklade nya presynapse formation assay med kombinationen av neuron Ball kultur med pärlor för att inducera presynapse formation8. Neuron Ball kultur är utvecklad för att undersöka axonal fenotyp, på grund av bildandet av axonala ark omgivande cell kroppar9,10. Vi använde magnetiska pärlor konjugerat med leucin-Rich REPEAT transmembranneuronal 2 (LRRTM2) som är en presynaptisk arrangör att framkalla excitatoriska presynapser (figur 1a)11,12,13. Genom att använda LRRTM2 pärlor, presynapse formation börjar vid den tidpunkt då pärlorna appliceras. Detta innebär att presynapse formation börjar i tusentals axoner av en neuron boll vid samma tider, vilket gör det möjligt att undersöka exakt tid kurs av ackumulering av synaptiska proteiner effektivt. Dessutom är neuron boll kultur lätt att blockera transport synaptiska proteiner från Soma genom att ta bort cell kroppar (figur 1b)8. Vi har redan bekräftat att axoner utan cell kroppar kan överleva och är friska minst 4 h efter avlägsnande av cell kroppar. Sålunda, detta protokoll är lämpligt att undersöka varifrån synaptiska proteiner härleds (cellkroppen eller Axon), och hur synaptiska proteiner ackumuleras i organiserat sätt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Under neuronala utveckling, synapsen bildas är ett viktigt steg för att etablera neurala kretsar. För att bilda synapser måste Synaptic proteiner levereras i anslå beställer vid transport från cell förkroppsligar och/eller lokal översättning i omogna synapses. Emellertid, det är inte helt förstått hur synaptiska proteiner ackumuleras i synapser i rätt ordning. Här presenterar vi en ny metod för att analysera presynaptisk formation genom att använda kombinationen av neuron boll kultur med pärlor för att inducera presynapse formation. Neuron bollar som är neuronala cell aggregat ger axonala ark långt från cell kroppar och dendriter, så att svaga fluorescerande signaler av presynapser kan upptäckas genom att undvika överväldigande signaler av cell kroppar. Som pärlor för att utlösa presynapse formation, använder vi pärlor konjugerat med leucin-Rich REPEAT transmembranneuronal 2 (LRRTM2), en excitatoriska presynaptiska arrangör. Med denna metod, vi visade att vesikulär glutamat transporter 1 (vGlut1), ett synaptiskt vesikelprotein, ackumuleras i presynapser snabbare än Munc18-1, en aktiv zon protein. Munc18-1 ackumulerad översättning-beroende i presynapse även efter att ha avlägsnat cellen förkroppsligar. Detta fynd indikerar den Munc18-1 ackumulationen vid lokal översättning i axons, inte transport från cell förkroppsligar. Sammanfattningsvis, denna metod är lämplig för att analysera ackumulering av synaptiska proteiner i presynapser och källa av synaptiska proteiner. Som neuron boll kulturen är enkel och det är inte nödvändigt att använda särskilda apparater, denna metod kan tillämpas på andra experimentella plattformar.

Här visar vi representativa resultat av ackumulering av presynaptiska proteiner i LRRTM2-inducerad presynapser av axonala ark av neuron boll kultur. Som presynaptiska proteiner, analyserade vi excitatoriska Synaptic vesikler protein vGlut1 och Active Zone protein Munc18-1. Vi undersökte också tidsförlopp för ackumulering av vGlut1 och Munc18-1 i presynapser, och erhållna resultat visar källan till Munc18-1 i presynapser med axoner att ta bort cell kroppar och en proteinsyntes hämmare. Nyligen har vi undersökt en...

Watch this Scientific Journal Video about Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and Ã¢â‚¬Å“Neuron BallÃ¢â‚¬Â Culture at JoVE.com

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse formation är en dynamisk process inklusive ackumulering av synaptiska proteiner i rätt ordning. I denna metod, presynapse bildandet utlöses av pärlor konjugerat med en presynapse arrangör protein på axonal ark av "neuron Ball" kultur, så att ackumulering av synaptiska proteiner är lätt att analyseras under presynapse formation.

Presynapse formation assay med Presynapse arrangör pärlor och "neuron Ball" kultur

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Detta protokoll är lämpligt att undersöka var presynaptiska proteiner har sitt ursprung:cellkroppar eller axoner. Och hur presynaptiska proteiner ackumuleras i presynapser på ett organiserat sätt under synapsbildningen. Denna teknik kan framkalla tusentals presynapser samtidigt, och använder inte någon speciell apparat för att upprätthålla axoner i kultur möjliggör effektiv analys av bildandet av många presynapser i axoner.Tillsammans med doktorand, Honami, visar detta förfarande kommer att Rie Ishii, en grundutbildning student i mitt laboratorium. Inled den här proceduren med mus dödshjälp enligt beskrivningen i textprotokollet. Dissekera buken för att erhålla E16 embryon.Ta bort hjärnan från embryon försiktigt med hjälp av finspetsade tlyck, och överföra dem till 60-millimeters cellodlingsrätter som innehåller fyra milliliter HEPES buffrad saltlösning eller HBSS. Ta bort hjärnhinnorna och skär luktbulben. Separera cortices från varje cerebrala halvklotet med hjälp av fina spetsar av tärna under stereomikroskopet och överföra till en annan 60-millimeters maträtt som innehåller färska HBSS.Använd minst tre till fem embryon för varje separat neuron boll kultur. Skär cortices i små bitar med microdissecting våren sax i en laminär flöde cell kultur huva. Nu, överför malet cortices till en 15-milliliter rör.Trypsinize de malet cortices i fyra milliliter av 0.125%trypsin i HBSS för 4.5 noterar i ett bevattna badar på 37 grader celsiust. Överför cellaggregaten till ett nytt 15-milliliterrör som innehåller 10 milliliter HBSS genom en steril överföringspipett. Inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter innan du upprepar detta steg en gång till.Överför sedan cellaggregaten till ett nytt 15-milliliterrör som innehåller två milliliter NGB-medium, 0,01%DNase I och 10%hästserum. Triturate trypsinized cortices genom att upprepade gånger pipettering dem upp och ner tre till fem gånger med hjälp av en brand-polerad fint glas Pasteur pipett. För att förbereda neuron bollar, justera celltätheten i cellen suspensionen till en miljon celler per milliliter med hjälp av NGB medium.Tillsätt sju milliliter PBS till den nedre delen av kulturrätter. Kultur kortikala nervceller som 10 microliter hängande droppar som innehåller 10, 000 celler per droppe inuti de övre locken av 10-centimeters kultur rätter. Håll disken i en inkubator i tre dagar vid 37 grader Celsius med 5%CO2 under befuktat förhållanden för att möjliggöra neuron bollbildning.Coat poly-L-lysin eller PLL på paraffin-pärlstav glaslock glider i 60-millimeters rätter med en 15 mikrogram per milliliter PLL-lösning i borate buffert. Håll dem i minst en timme i en CO2 inkubator vid 37 grader Celsius. Efter tvättning fyra gånger med PBS, överför PLL-belagda täckslilen till en fyr-brunnsplatta som innehåller 350 mikroliter av NGB-medium med tre mikromolar AraC i varje brunn.AraC läggs till media för att döda dela celler. Inkubera de fyra brunnsplattor som innehåller PLL-belagd täckslilen i CO2-inkubatorn i minst 20 minuter för att säkerställa att mediets temperatur når 37 grader Celsius innan neuronbollarna överförs. Vid DIV 3 när neuron bollar bildas mycket väl, överföra dem på PLL-belagda täcka glider.Inuti fyra-väl plattan, tillsätt fem neuron bollar per brunn. Vid DIV 11 överföra 20 mikroliter från suspension av streptavidin-belagda magnetiska partiklar till en microcentrifug röret. Immobilisera pärlorna till en handgjord apparat som är fäst med neodym permanenta magneter och tvätta tre gånger med 100 mikroliter PBS-MCBC i 1,5-milliliter mikrocentrifugrör.Efter att ha helt tagit bort PBS-MCBC från pärlorna, lägg till en förutbestämd volym LRRTM2 lager till de tvättade pärlorna. Inkubera blandningen med hjälp av en rotator vid fyra grader Celsius i en till två timmar. Efter inkubation, tvätta pärlorna två gånger med 100 mikroliter av PBS-MCBC.Sedan, tvätta pärlorna med 100 mikroliter av NGB medium. Resuspend LRRTM2 pärlor i 50 microliters av NGB medium för tillämpning på neuron bollkultur. Skär nu änden av en gul spets i 45-graders vinkel med ett rakblad under stereomikroskopet.Sätt den gula spetsen slutet på cellkroppen området av en neuron boll och ta bort cellkropparna genom att suga. Applicera LRRTM2 och kontrollera pärlor på neuron bollkultur. Sedan dränka pärlorna till botten av plattorna i neuron bollen kultur för en minut med ferrit magneter för att starta pre-synapsbildning.Detta förfarande säkerställer att touchdown alla pärlor samtidigt. Fix och fläcka nervceller i neuron boll kultur efter pre-synapsbildning med pärlor som beskrivs i textprotokollet. Fånga differentialinterferens kontrast och immunofluorescensbilder under ett inverterat fluorescerande mikroskop med en kyld CCD-kamera med hjälp av en 60X oljebadslins.Mät immunofluorescensintensiteten i pre-synapser i axonen. Använd immunofluorescensintensiteter i regionen av intresse på pärlor. Minus off pärlor region intensitet dividerat med axonal intensitet, längs 20 mikrometer från pärlorna.Minus bakgrundsintensitet. Denna kvotintensitet ger proteinackumuleringsindexet. För att kvantifiera ackumuleringsnivån för ett visst protein i en presynaps som induceras med LRRTM2-pärlor, välj alltid det område som är två synfält eller mer bortsett från cellkroppen.För exakt mätning, välj fem olika axonalfält per täckbom. Visas här är tillämpningen av LRRTM2 pärlor i neuron boll kultur vid DIV 11 inducerad ackumulering av Munc18-1 i presynapser av axoner av neuron bollar. Pärlorna på axons av neuron bollar är synliga i fas mikroskopi bilder.Och ackumuleringen av presynaptiska proteiner observeras av immunofluorescensbilderna. Även i axoner som tas bort cellkroppar, ansamling av Munc18-1 observerades under pärlorna, liknande axoner av neuron bollar med cellkroppar. När den perifera regionen av axonal arket analyserades av hög förstoring objektivet, vGlut1 och Munc18-1 ackumuleras klart i presynapses av axoner under pärlorna med och utan cell organ.Tidskursexperiment visade att ackumulering av vGlut1 i presynapser ökade betydligt vid 30 minuter. Å andra sidan började Munc18-1 ackumulering att öka betydligt vid två timmar och nådde en platå vid fyra timmar. Dessa data indikerar att det synaptiska vesikelproteinet vGlut1 ackumuleras i presynapser tidigare än det aktiva zonproteinet Munc18- 1.Den Munc18-1 ackumulering i presynapses av Fmr1-KO nervceller ökade 1,5 gånger mer än de i vild typ, vilket indikerar inblandning av FMRP i Munc18-1 ackumulering. Proteinsynteshämmare, anisomycin, undertryckta Munc18-1-ansamlingen signifikant i axoner med och utan cellkroppar. Detta indikerar att ackumulationen är proteinsyntesanhängande.Pipettering trypsinized cortices med hjälp av en brand-polerad fina glas Pasteur pipett är ett viktigt steg. Experimentörer förbereder de brandpolerade pipetterna med två till tre olika diametrar, och valde en pipett med lämplig diameter. Med hjälp av detta förfarande, synaptisk frisättning från presynapses inducerad av LRRTM2 pärlor mäts genom levande bildbehandling.Denna ytterligare metod skulle svara på om proteinsyntesen i axoner är involverad i regleringen av synaptisk frisättning. Med denna metod undersöker forskarna hur presynaptiska proteiner ackumuleras i presynapser på ett organiserat sätt, liksom platsen för källan till presynaptiska proteiner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Etablera Embryonala Mus Neurala Kultur Stem Cell Använda Neurosphere analys

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Upprättande och kultur i hjärnstammen Kyckling Auditiv Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utbyggnad av tumour glioblastoma multiforme celler med Neurosphere analys

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analys DNA-skador i hippocampus neuroner Använda Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolering och odling av Mus Kortikala Astrocyter

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Hämmande Synapse Formation i en Co-kultur Modell Införliva GABAergiska Medium Spiny neuron och HEK293 celler som stabilt uttrycker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analys av Utveckling Tooth Germ Innervation Använda mikroflödes Co-kultur-enheter

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-cell mätning av luktämnet Receptor aktiveringen med en realtid cAMP-analys

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live avbildning av primära hjärnbarken celler använder ett 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...