Bu çalışma, bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-ın-Aid (KAKENHI) (C) (No. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz Dr terukazu Nogi ve Bayan makiko neyazaki (Yokohama City Üniversitesi) nazik biyotinlenmiş LRRTM2 protein sağlamak için teşekkür ederiz. Teknik yardım için Honami Uechi ve Rie Ishii 'ye de teşekkür ederiz.

Bu yazıda açıklanan deneyler Yokohama City Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nde belirtilen yönergelere göre yapılmıştır.
1. asılı bırakma kültürü olarak nöron topları hazırlanması (gün içinde vitro (dıv) 0-3)
Not: nöron Ball kültürünün hazırlanması için burada anlatılan prosedürler, daha önce Sasaki grubu tarafından bazı değişikliklere İstinaden bildirilen yönteme dayanmaktadır<sup class="xr...

<ol>
	<li>Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Vertebrate+Synaptogenesis.">Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).</li><li>Ziv, N. E., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+presynaptic+assembly.">Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).</li><li>Chia, P. H., Li, P., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+underlying+presynapse+formation.">Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation.</a> Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Saitsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CASK+aberrations+in+male+patients+with+Ohtahara+syndrome+and+cerebellar+hypoplasia.">CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.</a> Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).</li><li>Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+New+Individual+Excitatory+Synapses.">Assembly of New Individual Excitatory Synapses.</a> Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).</li><li>Bresler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+density+assembly+is+fundamentally+different+from+presynaptic+active+zone+assembly.">Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).</li><li>Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+accumulation+of+the+active+zone+protein+Munc18-1+in+presynapses+via+local+translation+in+axons+during+synaptogenesis.">Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis.</a> Neuroscience Research. , (2018).</li><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Zipcode+Binding+Protein+1+Is+Required+for+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling+of+Local+&#946;-Actin+Synthesis+and+Growth+Cone+Turning.">Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local &#946;-Actin Synthesis and Growth Cone Turning.</a> Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).</li><li>Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+axon-enriched+microRNAs+localized+to+growth+cones+of+cortical+neurons.">Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons.</a> Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+capture+and+release+by+the+endocytic+receptor+ApoER2.">Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2.</a> EMBO reports. , (2017).</li><li>Yasui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Importance+of+Covalent+Homodimer+of+Reelin+Protein+Linked+via+Its+Central+Region.">Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).</li><li>Bassell, G. J., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome:+Loss+of+Local+mRNA+Regulation+Alters+Synaptic+Development+and+Function.">Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function.</a> Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).</li><li>Darnell, J. C., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+translational+control+by+FMRP:+therapeutic+targets+for+FXS.">The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS.</a> Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).</li><li>Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+and+restoration+of+translational+homeostasis+in+fragile+X+syndrome.">Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Assembly+of+Functional+Presynaptic+Boutons+Triggered+by+Adhesive+Contacts.">Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts.</a> Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Translation+of+&#946;-Catenin+Regulates+Synaptic+Vesicle+Dynamics.">Axonal Translation of &#946;-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li></ol>

LRRTM2-boncuk ile nöron topu kültürünü kullanarak uyarılan presynapse oluşumunu incelemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Şu anda, presynapse oluşumu tahlil çoğu Poly-D-Lysine içerir (PDL)-kaplamalı boncuk ve Disosiye kültür/microfluidic odası20,21,22. Bu yöntemin avantajlarından biri LRRTM2-Beads. LRRTM2, özellikle11,12,<sup class="xre...

SYNAPSE oluşumu, nöral devrelerin geliştirilmesi sırasında kritik adımlardan biridir1,2,3. Ön ve post-sinapslardan oluşan özel bölmeler olan sinapsların oluşumu, akons ve dendritlerin uygun şekilde tanınması, aktif bölge ve postsinaptik yoğunluğun oluşması ve uygun şekilde hizalanması ile ilgili karmaşık ve çok adımlı bir süreçtir. iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörleri1,2. Her süreçte, sinaptik proteinlerin birçok tür hücre organları ve/veya bölmeler yerel çeviri tarafından sinaptik proteinleri taşıyarak uygun zamanlamaya göre bu özel bölmeleri birikir. Bu sinaptik proteinler fonksiyonel sinaps oluşturmak için organize bir şekilde düzenlenmiş olarak kabul edilir. Bazı sinaptik proteinlerin disfonksiyon nörolojik hastalıklarda sinaps oluşumu sonuçları4,5. Ancak, sinaptik proteinlerin uygun zamanlamaya göre nasıl biriktiği belirsiz kalır.
Sinaptik proteinlerin organize bir şekilde nasıl birikdiğini araştırmak için sinaptik proteinleri kronolojik sırada birikmesini incelemek gerekir. Bazı raporlar,6,7' deki nöronlar kültüründe sinaps oluşumunu gözlemlemek için canlı görüntüleme gösterdi. Ancak, sadece mikroskopide sinaps oluşumu başlatmak nöronlar bulmak için zaman alıcı. Etkili sinaptik proteinlerin birikimini gözlemlemek için, sinaps oluşumu araştırmacılar oluşumu ikna etmek istediğinizde zaman başlamalıdır. İkinci zorluk hücre organları veya sinapslar yerel çeviri taşıma nedeniyle sinaptik proteinlerin birikimini ayırt etmektir. Bu amaçla, çeviri seviyesi hücre gövdelerini sinaptik proteinlerin taşınması izin vermez koşul altında ölçülmesi gereklidir.
Biz, presynapse oluşumu8teşvik boncuk ile nöron top kültürünün kombinasyonu kullanarak roman presynapse oluşumu tahlil geliştirdi. Nöron top kültürü, hücre gövdelerini çevreleyen aksonal levhalar oluşumu nedeniyle aksonal phenoype incelemek için geliştirilmiştir9,10. Biz leucine zengin tekrarlı transmembran nöronal 2 (LRRTM2) ile konjugated manyetik boncuk kullanılan uyarıcı presynapses (Şekil 1a)11,12,13ikna etmek için bir presinaptik Organizatör. LRRTM2 boncukları kullanarak, boncuk uygulandığında zaman presynapse oluşumu başlar. Bu presynapse oluşumu aynı zamanda bir nöron topu binlerce akons başlar anlamına gelir, böylece etkili sinaptik proteinler birikiminin kesin zaman ders incelemek için izin verir. Buna ek olarak, nöron top kültürü, hücre gövdelerini kaldırarak Soma 'dan taşıma sinaptik proteinlerini engellemek için kolaydır (Şekil 1B)8. Biz zaten hücre organları olmadan akons hayatta ve en az 4 saat hücre organları kaldırıldıktan sonra sağlıklı olduğunu doğruladı. Böylece, bu protokol sinaptik proteinlerin (hücre gövdesi veya Akon) türetildiği ve nasıl sinaptik proteinler organize bir şekilde birikir araştırmak için uygundur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-585-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Munc18-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alubumin (BSA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01863-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXON3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C015001</td>
			<td>Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>11034-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease 1 (DNase I)</td>
			<td>Wako pure chemicals</td>
			<td>047-26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-element AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Image J</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorecent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-propyl gallate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29303-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Hydrobromide (MW &#62; 300,000)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28359-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked Disposable PD-10 Columns</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>41506-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>Spherotech Inc</td>
			<td>SVM-40-10</td>
			<td>diameter: 4-5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>18172-94</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

presynapse formation assay using presynapse organizer beads and &ldquo;neuron ball&rdquo; culture

Nöronal gelişim sırasında, sinaps oluşumu nöral devreler kurmak için önemli bir adımdır. Sinapslar oluşturmak için, sinaptik proteinler hücre organları ve/veya yerel çeviri olgunlaşmamış sinapsların taşıma ile uygun sırada sağlanmalıdır. Ancak, tam olarak nasıl sinaptik proteinlerin doğru sırayla sinaps birikir anlaşılmadı. Burada, presynapse oluşumunu teşvik etmek için boncuk ile nöron top kültürünün kombinasyonunu kullanarak presimtik oluşumu analiz etmek için yeni bir yöntem sunuyoruz. Nöron hücre agregaları olan nöron topları hücre organları ve dendrites uzak aksal levhalar sağlar, böylece presynaplar zayıf floresan sinyalleri hücre organları ezici sinyalleri kaçınarak tespit edilebilir. Boncuk presynapse oluşumu tetiklemek için, biz leucine zengin tekrarlama transmembran nöronal 2 (LRRTM2), bir uyarıcı presinaptik organizatör ile konjuti boncuklar kullanın. Bu yöntemi kullanarak, biz göstermiştir ki veziküler glutamat taşıyıcı 1 (vGlut1), bir sinaptik vezirik protein, Munc18-1 daha hızlı presynapses birikmiş, aktif bir bölge protein. Munc18-1 birikmiş çeviri-güvenilir presynapse bile hücre gövdeleri kaldırdıktan sonra. Bu bulgu, hücre gövdelerini taşıma değil, akons yerel çeviri tarafından Munc18-1 birikimini gösterir. Sonuç olarak, bu yöntem presynaplar ve sinaptik proteinlerin kaynağı sinaptik proteinlerin birikimi analiz etmek için uygundur. Nöron topu kültürü basittir ve özel cihaz kullanmak gerekli değildir, bu yöntem diğer deneysel platformlar için geçerli olabilir.

Burada, LRRTM2 indüklenmiş nöron top kültüründe aksonal yaprak presynaptlarda presynaptik proteinlerin birikiminin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Presynaptik proteinler olarak, uyarıcı sinaptik vezikül proteini vGlut1 ve aktif bölge proteini Munc18-1 ' i analiz ettik. Biz de vGlut1 ve Munc18-1 birikiminin zaman ders presynapses, ve sonuç Munc18-1 hücre organları ve bir protein sentezi inhibitörü kaldırma akons kullanarak presynapses gösteren elde edildi. Son zamanlarda, biz kırılgan X zihinsel r...

Watch this Scientific Journal Video about Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and Ã¢â‚¬Å“Neuron BallÃ¢â‚¬Â Culture at JoVE.com

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œNeuron BallÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Culture

Presynapse oluşumu doğru sırayla sinaptik proteinlerin birikimi de dahil olmak üzere dinamik bir süreçtir. Bu yöntemle, presynapse oluşumu "nöron topu" kültürünün aktik levhalar üzerinde bir presynapse Organizatör protein ile konjuti boncuklar tarafından tetiklenir, böylece Sinapik proteinlerin birikimi presynapse oluşumu sırasında analiz edilmesi kolaydır.

Presynapse oluşum assay kullanarak Presynapse Organizatör boncuk ve "neuron Ball" kültür

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Bu protokol, presinaptik proteinlerin nereden kaynaklandığını araştırmak için uygundur: hücre cisimleri veya aksonlar. Ve sinaps oluşumu sırasında presinaptik proteinlerin düzenli bir şekilde presinapslarda nasıl birikir. Bu teknik aynı anda binlerce presinaps neden olabilir, ve akson birçok presynaps oluşumunun verimli analizi sağlayan kültürde akson korumak için herhangi bir özel cihaz kullanmaz.Yüksek lisans öğrencisi Honami'nin yanı sıra, bu prosedürü gösteren Rie Ishii, laboratuvarımda lisans öğrencisi olacak. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi fare ötenazisi ile başlayın. E16 embriyoları elde etmek için karın incelemek.İnce uçlu forsepsyardımıyla embriyolardan beyni dikkatlice çıkarın ve dört mililitre HEPES tamponlu tuz çözeltisi veya HBSS içeren 60 milimetrelik hücre kültürü yemeklerine aktarın. Menenjitleri çıkarın ve koku ampulü kesin. Stereo mikroskop altında forceps ince uçlarını kullanarak her serebral yarımküreden ayrı korteksler ve taze HBSS içeren başka bir 60 milimetrelik çanak transfer.Her ayrı nöron topu kültürü için en az üç ila beş embriyo kullanın. Bir laminar akış hücre kültür başlık mikrodissecting bahar makası ile küçük parçalar halinde corticekes. Şimdi, kıymalı korteksleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.HbSS'de %0.125 tripsin olmak için dört mililitre lik kıyma lı kortikleri 37 santigrat derecede bir su banyosunda 4,5 dakika deneyin. Hücre agregalarını steril transfer pipeti ile 10 mililitre HBSS içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlamadan önce 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatın.Daha sonra hücre agregalarını iki mililitre NGB orta, %0.01 DNase I ve %10 at serumu içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Tepiştirilmiş korteksleri, ateş cilalı ince cam Pasteur pipet'i kullanarak tekrar tekrar üç ila beş kez yukarı ve aşağı borulandırarak triturate. Nöron topları hazırlamak için, NGB orta kullanarak mililitre başına bir milyon hücre hücre hücre süspansiyon hücre yoğunluğunu ayarlayın.Kültür yemeklerinin alt kısmına yedi mililitre PBS ekleyin. Kültür 10 mikrolitre 10 mikrolitre asılı damla olarak kortikal nöronlar 10 santimetrelik kültür yemekleri üst kapakları içinde damla başına 10.000 hücre içeren. Nören top oluşumuna izin vermek için bulaşıkları 37 santigrat derecede %5 CO2 ile üç gün boyunca bir kuvözde tutun.Kat poli-L-lizin veya PLL parafin boncuklu cam kapak üzerine 60 milimetrelik yemeklerde borat tampon mililitre PLL çözeltisi başına 15 mikrogram kullanarak final in. 37 santigrat derecede bir CO2 kuluçka makinesinde en az bir saat bekletin. PBS ile dört kez yıkadıktan sonra, PLL kaplı kapak fişlerini her kuyuda üç mikromolar AraC bulunan 350 mikrolitre NGB orta sıyrık içeren dört kuyulu bir plakaya aktarın.AraC, bölünen hücreleri öldürmek için ortama eklenir. Nöron toplarını transfer etmeden önce ortamın sıcaklığının 37 dereceye ulaştığından emin olmak için CO2 inkübatöründeki PLL kaplı kapak fişlerini içeren dört kuyulu plakaları en az 20 dakika kuluçkaya yatırın. DIV 3'te nöron topları çok iyi oluştuğunda, bunları PLL kaplı kapak fişlerine aktarın.Dört kuyuplaka içinde, iyi başına beş nöron topları ekleyin. DIV 11'de streptavidin kaplı manyetik partiküllerin süspansiyonundan mikrosantrifüj tüpüne 20 mikrolitre aktarın. Boncukları neodimyum kalıcı mıknatıslarla bağlı el yapımı bir cihaza yerleştirin ve 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 100 mikrolitre PBS-MCBC ile üç kez yıkayın.PBS-MCBC'yi boncuklardan tamamen çıkardıktan sonra, yıkanmış boncuklara önceden belirlenmiş bir LRRTM2 stokhacmi ekleyin. Karışımı dört santigrat derecede bir rotator kullanarak 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra boncukları 100 mikrolitre PBS-MCBC ile iki kez yıkayın.Daha sonra boncukları 100 mikrolitre NGB orta sıyla yıkayın. Nöron topu kültürüne uygulama için NGB orta 50 mikrolitre LRRTM2 boncukre askıya alın. Şimdi 45 derecelik açıyla, stereo mikroskop altında bir jiletle sarı bir ucun ucunu kesin.Bir nöron topu hücre vücut alanı üzerinde sarı uç ucu koyun ve emme ile hücre organları kaldırın. LRRTM2 uygulayın ve nöron topu kültürü üzerinde kontrol boncuklar. Sonra ön sinaps oluşumu başlatmak için ferrit mıknatıslar kullanarak bir dakika için nöron topu kültürünün plakaları altına boncuk batırın.Bu yordam, tüm boncukları aynı anda touchdown sağlar. Metin protokolünde açıklandığı gibi boncuklar ile pre-sinaps oluşumu ndan sonra nöronlar düzeltmek ve leke. 60X yağ daldırma lensi kullanarak soğutulmuş ccd kamera ile ters floresan mikroskop altında diferansiyel girişim kontrastı ve immünofloresan görüntüleri yakalayın.Aksondaki ön sinapslarda immünfloresans yoğunluğunu ölçün. Boncuklar üzerinde ilgi bölgenin immünofloresan yoğunlukları kullanın. Eksi kapalı boncuk bölge yoğunluğu aksonal yoğunluğu ile bölünmüş, boncuk20 mikron boyunca.Eksi arka plan yoğunluğu. Bu oran yoğunluğu protein birikim indeksi sağlar. LRRTM2 boncukları ile indüklenen bir presinyofaz belirli bir proteinin birikim düzeyini ölçmek için, her zaman görüş iki alan veya hücre gövdesi nden daha fazla alan seçin.Doğru ölçüm için, coverslip başına beş farklı aksonal alan seçin. Burada gösterilen cd 11 munc18-1 nöron topları aksonların presynapses indüklenen birikimi nde nöron topu kültürüne LRRTM2 boncuk uygulamasıdır. Nöron toplarının aksonları üzerindeki boncuklar faz mikroskopi görüntülerinde görülebilir.Ve presinaptik proteinlerin birikimi immünoresans görüntüleri tarafından gözlenir. Hücre organları çıkarılan aksonlarda bile, munc18-1 birikimi boncukaltında gözlendi, hücre organları ile nöron topları aksonlar benzer. Aksonal levhanın periferik bölgesi yüksek büyütme nesnel lens, vGlut1 ve Munc18-1 ile analiz edildiğinde, hücre gövdeleri olan ve olmayan boncukların presynapseslerinde açıkça birikti.Zaman dersi deneyleri presinapslarda vGlut1 birikiminin 30 dakikada önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Öte yandan, Munc18-1 birikimi iki saatte önemli ölçüde artmaya başladı ve dört saatte bir platoya ulaştı. Bu veriler sinaptik vezikül proteini vGlut1'in presinapslarda aktif bölge proteini Munc18-1'den daha erken biriktiğini göstermektedir.Fmr1-KO nöronlarının presinaseslerinde Munc18-1 birikimi, Munc18-1 birikiminde FMRP'nin tutulumunu gösteren yabani tiptekilere göre 1,5 kat daha fazla arttı. Protein sentezi inhibitörü, anisomisin, hücre organları olan ve olmayan aksonlarda Munc18-1 birikimini önemli ölçüde bastırdı. Bu birikimin protein sentezine bağlı olduğunu gösterir.Tepilmiş kortekslerin ateş cilalı ince cam Pasteur pipetkullanılarak pipetlenmesi önemli bir adımdır. Deneyciler, 2-3 farklı çapa sahip ateşcilli pipetler hazırlar ve uygun çapa sahip bir pipet seçerler. Bu prosedür kullanılarak, LRRTM2 boncuklar tarafından indüklenen presinapslardan sinaptik salınım canlı görüntüleme ile ölçülür.Bu ek yöntem aksonlarda protein sentezinin sinaptik salınımın düzenlenmesinde rol alıp almadığı sorusuna cevap vermiştir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar presinaptik proteinlerin presinapses te nasıl biriktiğini ve presinaptik proteinlerin kaynağının yerini düzenli bir şekilde incelerler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Tavuk İşitsel Beyin Sapı Dilimleri hazırlanması ve Kültür

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA&#39;erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade<sub&gt; A</sub&gt; Reseptörler

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...