Name: oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den molekylære patologi delte ressource af University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center support Grant No. P30-CA046934) og af Colorado Center for personlig medicin.

1. forberedelse og sekvensering af biblioteker
<ol><li>Generelle analyse betragtninger og præ-assay trin
	<ol>
<li>Analyse kørsler består typisk af syv kliniske prøver og en positiv kontrol (selv om antallet af prøver pr. Biblioteks forberedelses kørsel kan justeres efter behov). Brug en positiv kontrol, der indeholder mindst flere gen-fusioner (at analysen mål), der er blevet bekræftet af en fabrikant og/eller er blevet bekræftet af en ortogononal metode. En ikke-skabelon kontrol (NTC) skal m...

<ol>
	<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li><li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer.">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer.">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li><li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children.">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li><li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma.">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li><li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing's+sarcoma.">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li><li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion.">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute.">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li><li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer.">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li><li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK)+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment.">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li><li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry.">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li><li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions.">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples.">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li><li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors.">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing.">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li><li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion.">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li><li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches.">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).</li><li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions.">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li><li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation:+Report+of+10+Cases.">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li><li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li></ol>

Forankret multiplex PCR-baseret Target berigelse og bibliotek forberedelse efterfulgt af næste generation sekvensering er velegnet til multiplexed gen fusion vurdering i kliniske tumorprøver. Ved at fokusere på RNA-input i stedet for genomisk DNA undgås behovet for at sekvens store og gentagne introner. Desuden, da denne fremgangsmåde forstærker genfusioner uanset identiteten af fusions partneren, opdages nye fusioner. Dette er en kritisk fordel i det kliniske rige, og der har været mange eksempler på handlingsre...

Sammensmeltningen af to eller flere gener i en enkelt transkriptional enhed kan forekomme som følge af store kromosomale variationer, herunder sletninger, gentagelser, indsættelser, inversioner og omplaceringer. Gennem ændret transkriptional kontrol og/eller ændrede funktionelle egenskaber af det udtrykte genprodukt kan disse fusions gener give onkogene egenskaber til kræftceller1. I mange tilfælde er fusions gener kendt for at fungere som primære onkogene chauffører ved direkte at aktivere cellulære proliferation og overlevelses veje.
Den kliniske relevans af genfusioner for cancerpatienter blev først tydelig med opdagelsen af Philadelphia kromosom og det tilsvarende BCR-ABL1-fusions- gen i kronisk myeloid leukæmi (CML)2. Den lille molekyle hæmmer Imatinib mesylat blev udviklet til specifikt at målrette dette fusions-gen og udviste en bemærkelsesværdig virkning hos BCR-ABL1-positive CML-patienter3. Terapeutisk målretning af onkogene gene fusioner har også været en succes i solide tumorer, med hæmning af ALK og ROS1 fusions gener i ikke-småcellet lungekræft tjener som primære eksempler4,5. For nylig, NTRK-hæmmer larotrectinib var FDA godkendt til NTRK1/2/3 fusion-positive solide tumorer, uanset sygdom site6. Ud over behandling udvælgelse, genfusion detektion har også roller i sygdoms diagnose og prognose. Dette er især fremherskende i forskellige sarkom og hæmatologiske maligniteter undertyper, der er diagnostisk defineret ved tilstedeværelsen af specifikke fusioner og/eller for hvilke tilstedeværelsen af en fusion direkte informerer prognose7,8 , 9 , 10 , 11. disse er blot nogle af eksemplerne på klinisk anvendelse af genfusions påvisning for cancerpatienter.
På grund af den kritiske rolle i den kliniske beslutningstagning er nøjagtig genfusions påvisning fra kliniske prøver af vital betydning. Der er anvendt talrige teknikker i kliniske laboratorier til analyse af fusions-eller kromosom reorganisering, herunder: cytogenetiske teknikker, reverse transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR), fluorescens in situ-hybridisering (fisk), immunhistochemistry (IHC) og 5 '/3 ' Expression ubalance analyse (blandt andre)12,13,14,15. I øjeblikket, den hastigt voksende liste over handlingsrettede gen fusioner i kræft har resulteret i behovet for at vurdere fusion status af flere gener samtidigt. Derfor er nogle traditionelle teknikker, der kun kan forespørge en eller et par gener på et tidspunkt bliver ineffektive tilgange, især når man tænker på, at kliniske tumorprøver ofte er meget begrænsede og ikke modtagelig for at blive delt mellem flere assays. Next Generation sekventering (NGS) er imidlertid en analyseplatform, der er velegnet til multi-gen-testning, og NGS-baserede assays er blevet almindelige i kliniske molekylære diagnoselaboratorier.
Aktuelt anvendte NGS-assays til fusion/rearrangement-detektion varierer med hensyn til det anvendte inputmateriale, de kemiske stoffer, der anvendes til Biblioteks forberedelse og målberigelse, samt antallet af gener, som er forespurgt i en analyse. NGS-assays kan være baseret på RNA eller DNA (eller begge) udvundet fra prøven. Selv om RNA-baseret analyse hæmmes af tendensen i kliniske prøver til at indeholde stærkt forringet RNA, det omgår behovet for at sekvens store og ofte gentagne introner, der er mål for DNA-baseret fusions testning, men har vist sig at være vanskeligt for NGS dataanalyse16. Målberignings strategier for RNA-baserede NGS-analyser kan i vid udstrækning opdeles i hybrid indfangning eller amplicon-medierede tilgange. Mens begge strategier er blevet udnyttet med succes for fusion Detection, hver indeholder fordele i forhold til de andre17,18. Hybrid Capture assays resulterer generelt i mere komplekse biblioteker og reduceret allelisk Dropout, hvorimod amplicon-baserede assays generelt kræver lavere input og resulterer i mindre off-Target sekvensering19. Men måske den primære begrænsning af traditionel amplicon-baseret berigelse er behovet for primere til alle kendte fusions partnere. Dette er problematisk, da mange klinisk vigtige gener er kendt for at smelte med snesevis af forskellige partnere, og selv om primer design tilladt for påvisning af alle kendte partnere, nye fusion begivenheder vil forblive uopdaget. En nylig beskrevet teknik kaldet forankret multiplex PCR (eller AMP for Short) adresser denne begrænsning20. I AMP er en halv funktionel NGS-adapter ligeret til cDNA-fragmenter, der er afledt af input-RNA. Målberigelse opnås ved forstærkning mellem gene specifikke primere og en primer til adapteren. Som følge heraf bør alle fusioner af interesse gener, selv om der er tale om en ny fusions partner, påvises (Se figur 1). Denne artikel beskriver brugen af ArcherDx FusionPlex solid tumor kit, en NGS-baseret assay, der beskæftiger AMP for Target berigelse og bibliotek forberedelse, til påvisning af onkogene genfusioner i solide tumor prøver (Se supplerende tabel 1 for komplet genliste). Wet-Bench protokol og dataanalyse trin er blevet strengt valideret i et klinisk laboratorium forbedring ændringer (CLIA)-certificeret laboratorium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-05-01-13</td>
			<td>Used for TNA dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>Used in library pooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent Reservoir with divider</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9173-2000</td>
			<td>For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9700</td>
			<td>Plate used for thermocycler steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Used in purification after several assay steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Formapure Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A33343</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AB0005</td>
			<td>This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block, 96-well</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A7079</td>
			<td>Used for keeping samples chilled at various steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Used for bead washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification for Illumina Internal Control Standard</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4906</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4973</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Standards</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4903</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet Plate, 96-well (N38 grade)</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td>Used in bead purificiation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBC Adapters Set B</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AK0016-48</td>
			<td>Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td>Used for spinning down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4483485</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microamp Optical Film Compression Pad</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4312639</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plate Spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>MPS-1000</td>
			<td>Used for collecing liquid at bottom of plate wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>Contains components necessary for a MiSeq sequencing run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeqDx System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>NGS Sequencing Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 9700 Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for several steps during assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9938</td>
			<td>Used as general diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical ABI 96-well PCR plate covers</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Workstation Model 600</td>
			<td>Air Clean Systems</td>
			<td>BZ10119636</td>
			<td>Wet-bench assay steps performed in this &#39;dead air box&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1019499</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>LSA28139</td>
			<td>qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Use for determing RNA concentration in TNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-402-178</td>
			<td>Used for general RNase decontamination of work areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>0710-0129</td>
			<td>Used as the assay positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Used in clean-up steps and for sequencing setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td>Component of PreSeq QC Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>Used for reagent and sample mixing etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template RT PCR film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-7800</td>
			<td>Used for covering 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom 96-well Microplate</td>
			<td>LSP</td>
			<td>MP8117-R</td>
			<td>Used during bead purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing

Genfusioner bidrager ofte til den onkogene fænotype af mange forskellige typer kræft. Desuden, tilstedeværelsen af visse fusioner i prøver fra cancerpatienter ofte direkte påvirker diagnose, prognose, og/eller terapi udvælgelse. Som følge heraf er den nøjagtige påvisning af genfusioner blevet en kritisk komponent i klinisk administration for mange sygdomstyper. Indtil for nylig blev påvisning af klinisk genfusion fortrinsvis gennemført ved hjælp af Single-gen-assays. Den stadigt voksende liste over genfusioner med klinisk signifikans har imidlertid skabt et behov for at vurdere fusionens status for flere gener samtidigt. Next Generation sekventering (NGS)-baserede test har opfyldt dette krav gennem evnen til at sekvens af nukleinsyre i massivt parallel mode. Flere NGS-baserede tilgange, der anvender forskellige strategier for genmålberigelse, er nu tilgængelige til brug i klinisk Molekylær diagnostik, hver med sine egne styrker og svagheder. Denne artikel beskriver brugen af forankret multiplex PCR (AMP)-baseret Target berigelse og bibliotek forberedelse efterfulgt af NGS til at vurdere for genfusioner i kliniske solide tumorprøver. AMP er unik blandt amplicon-baserede berigelse tilgange i, at det identificerer genfusioner uanset identiteten af fusions partneren. Detaljeret her er både de våde-bænk og dataanalyse trin, der sikrer nøjagtig genfusions detektering fra kliniske prøver.

Vist i figur 3, figur 4 og figur 5 er screenshots fra analysen brugergrænseflade demonstrerer resultater fra en lunge adenokarcinom prøve. I figur 3vises prøve resumeet (øverst), der viser de kaldte stærke beviser fusioner, samt QC status (cirklede i rødt). ADCK4-NUMBL fusion (hvoraf 3 isoformer er angivet) ignoreres straks, fordi det er en vedvarende transkriptional readthrough-hændelse...

Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Denne artikel beskriver brugen af en forankret multiplex polymerase kæde reaktions baseret bibliotek forberedelse kit efterfulgt af næste generation sekventering at vurdere for onkogene gen fusioner i kliniske solide tumorprøver. Både våd-bænk og dataanalyse trin er beskrevet.

Onkogen Genfusions detektering ved hjælp af forankret multiplex Polymerasekæde reaktion efterfulgt af næste generations sekvensering

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Denne protokol bruges til påvisning af kritisk informative genfusioner for patienttumorprøver. Fusion status snesevis af gener vurderes samtidig i en enkelt analyse. Fordelen ved denne teknik er, at jeg kan identificere genfusioner uanset identiteten af fusionspartneren fra tumorprøver, der er blevet behandlet ved formel fiksering.Påvisning af visse genfusion i klinisk tumor prøve direkte informerer diagnose, prognose og behandling udvælgelse i mange kræfttyper. Det er afgørende at forstå, at mange fusioner kaldet af analysen algoritme er artefakter. Den sværeste opgave, når man analyserer data, er at skelne mellem artefakt og reelle fusionsopkald.Begynd med at fortynde total nukleinsyre for at opnå den ønskede koncentration af RNA. For hver prøve overføres 20 mikroliter af fortyndingen til de tilfældige priming reagensstriprør i en forkølet aluminiumsblok og blandes ved pipettering op og ned seks til otte gange. Drej kortvarigt prøverne ned, overfør hele lydstyrken til en 96-brønd PCR-plade, og forsegling med pladeforseglingsfilm.Sæt pladen i en termocykator, dæksel med kompressionspuden, og luk låget. Inkubere ved 65 grader Celsius i fem minutter. Efter inkubationen overføres hele volumenet af det tilfældige priming-produkt i de første strengegenrørsstrimmelrør.Bland ved pipettering op og ned og kort spin ned. Overfør hele lydstyrken til en 96-brønd PCR plade og forsegling med RT film. Sæt pladen i termocymanen og kør reaktionen i henhold til håndskriftsanvisningerne.Udfør anden streng cDNA syntese, og reparation, og ligation trin et i henhold til manuskriptet retninger og gå videre til den anden ligation trin. For at nummerere de molekylære stregkode- eller MBC-adapterstrimlerrør skal rørene placeres vandret med hængsler bagpå og anvendes en permanent markør. Beadrensningspladen udtages fra det første ligationstrin, og 40 mikroliter af hver prøve overføres til MBC-adapterstriberørene, idet man skal passe på ikke at forstyrre perlepellet.Reagenserne blandes ved at pipettere, dreje rørene ned og overføre hele volumenet til ligationstrinet to reagensstriprør. Bland prøverne, drej dem ned, og sted i en termocyrblok. Lad det opvarmede låg være slukket og kør termocyren ved 22 grader Celsius i fem minutter, efterfulgt af 4 grader Celsius hold.Dernæst forberede ligation oprydning perler ved vortexing dem og tilføje 50 mikroliter til et nyt sæt PCR striprør. Inkuber magneten i et minut og kassér supernatanten. Fjern strimlen rør fra magneten og resuspend perlerne i 50 mikroliter af ligation oprydning buffer ved pipettering op og ned.Hele prøvevolumenet overføres fra det andet ligationstrin til ligationsoprimeringen. Vortex prøverne til at blande og lade dem ved stuetemperatur i 10 minutter. Vortex prøven en gang halvvejs gennem inkubationen.Bagefter vortex prøverne, spin dem ned, og inkubere på magneten i et minut. Kassér supernatanten og tilsæt 200 mikroliter frisk ligationsoprydningsbuffer. Vortex at resuspendre, spin ned, og sted på magneten i et minut.Efter de to vasker, udføre en tredje vask ved hjælp af ultrapure vand i stedet for buffer. Resuspend perlerne i 20 mikroliter af 5 millimeter natriumhydroxid og overføre prøverne til en 96-brønd PCR plade. Placer pladen i en termocykstyring med en kompression pad og køre det på 75 grader Celsius i 10 minutter, efterfulgt af en 4 grader Celsius hold.Når prøverne er afkølet til 4 grader Celsius, placeres pladen på en magnet i mindst tre minutter, og fortsæt med den første PCR. Forbered PCR-reaktionerne ved at tilføje to mikroliter GSP1-primere til hver brønd på den første PCR-reagensstrimler. Overfør 18 mikroliter af det andet ligationsoprydningsprodukt til de første PCR reagensstriprør, og bland ved pipettering op og ned.Spin ned prøverne og overføre dem til en 96-godt PCR plade. Placer dem i termocymaneren, og kør PCR i henhold til håndskriftsanvisningerne. Fortsæt med beadrensning ved at tilføje 20 mikroliter af PCR-produktet til en U-bundplade fyldt med 24 mikroliter rensningsperler pr. brønd.Pipette op og ned for at blande og lad pladen stå ved stuetemperatur i fem minutter, derefter inkubere pladen på magneten i to minutter. Kassér supernanten fra perlerne og vask dem to gange med 200 mikroliter på 70% ethanol. Efter den endelige vask fjernes al ethanolen, og prøveluften tørres i to minutter.Fjern pladen fra magneten og resuspend perlerne i 24 mikroliter på 10 millimeter Tris-HCl og pH 8,0. Inkuber magneten af i tre minutter, og placer derefter pladen tilbage på magneten i to minutter. Begynd biblioteksmængden ved at forberede en til fem fortyndinger af det andet PCR-produkt i 10 millimeter Tris-HCl.Følg dette ved en seriel fortynding af 1:199, 1:199 og 20:80 i 10 millimeter Tris-HCl med 05% polysorbat. Opsæt nøgle PCR ved at tilføje seks mikroliter af master mix til hver brønd af en optisk 96-brønd plade, efterfulgt af fire mikroliter af den relevante fortynding eller standard. Drej pladen ned og læg den i qPCR-instrumentet.Udfør qPCR i henhold til håndskriftsanvisningerne. Når biblioteksskvanificeringen er færdig, fortyndes alle biblioteker til to nanomolar med 10 millimeter Tris-HCl. Lav en bibliotekspulje ved at kombinere 10 mikroliter af hvert normaliseret bibliotek i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Dernæst forberede denatureret amplicon bibliotek, eller DAL pool, ved at kombinere 10 mikroliter af biblioteket pool med 10 mikroliter af 0,2 normal natriumhydroxid og inkubere blandingen i fem minutter ved stuetemperatur. Efter inkubationen tilsættes 10 mikroliter på 200 millimeter Tris-HCl ved pH 7.0, efterfulgt af 970 mikroliter HT1 Hybridiseringsbuffer. Gør den endelige belastning rør ved at kombinere 300 mikroliter af HT1, 25 mikroliter af 20 picomolar PhiX, og 675 mikroliter af DAL pool.Tilsæt hele belastningsrørets volumen til prøvepanden på sequencer-reagenspatronen, og læg patronen ind i sequenceren. Start med at udvælge den positive kontrolprøve og sikre, at alle forventede fusioner og onkogen isoformer er blevet opdaget og er opført under fanen Stærk evidens. For hver prøve skal du undersøge de gennemsnitlige unikke startsteder pr. GSP2-kontrolværdi og derefter visualisere de understøttende læsninger for hver potentiel fusion ved at klikke på Visualize-linket, som fører brugeren til en webbaseret JBrowse-visning af pileups af individuelle fusionsunderblæsninger.Bekræft, at læser er for det meste fri for uoverensstemmelser, men mere end 30 baser af læser tilpasse sig fusion partner, og at sekvenser støder op til breakpoint mellem gener og primer bindende steder er fri for indsættelser eller sletninger. Det er afgørende at sikre, at enhver fusion generelt er fri for forskydning, og at en betydelig del af læseren tilpasser sig fusionspartneren. Denne protokol er blevet anvendt til at undersøge genfusionsstatus i en lungeadenocarcinomprøve.Resuméet viser stærke evidens fusioner og Read Statistics side viser målinger af prøven. Denne prøve udviser god RNA-kvalitet, så negative resultater ville blive rapporteret, hvis der ikke blev fundet fusioner. En legitim fusion opkald har et stort antal understøttende læser, en høj procent af læser fra primer støtte fusion, og et stort antal start sites.Visualisering af læserne viser god tilpasning til store regioner af fusion partner. Omvendt har et artefakt fusionsopkald lavere understøttende målinger og en høj fejlprocent, når der tilknyttes partneren. Artifactual fusion opkald foretaget af analysen algoritme er almindelige.Det er afgørende manuelt at inspicere alle opkald for at sikre, at det repræsenterer en reel genfusion i patientprøven.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Next Generation Sequencing til påvisning af søgsmål mutationer i fast og flydende tumorer

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Påvisning af sjældne mutationer i CtDNA ved hjælp af næste Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Udkig efter Driver veje af erhvervet modstand mod målrettede terapi: resistente Subclone Generation og følsomhed gendannelse af genet Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering til at undersøge de muterede aktivitet af Mutant Calreticulin i cytokin afhængige hæmatopoietisk celler

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Dråbe digital TRAP (ddTRAP): tilpasning af telomere REPEAT forstærknings protokol til droplet digital polymerase kædereaktion

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kortlægning af strukturfunktionsforhold for uordnede onkogene transskriptionsfaktorer ved hjælp af transskriptomisk analyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering af onkogene transformation i humane mammary epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Rumlig profilering af protein- og RNA-ekspression i væv: En tilgang til finjustering af virtuel mikrodissektion

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondrial Cybrid Generation ved hjælp af kræftcellelinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...