Name: oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Molecular Pathology Shared Resource der University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) und vom Colorado Center for Personalized Medicine.

1. Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung
<ol><li>Allgemeine Assay-Überlegungen und Pre-Assay-Schritte
	<ol>
<li>Assay-Läufe bestehen in der Regel aus sieben klinischen Proben und einer positiven Kontrolle (obwohl die Anzahl der Proben pro Bibliotheksvorbereitungslauf bei Bedarf angepasst werden kann). Verwenden Sie eine positiv-kontroll, die mindestens mehrere Genfusionen enthält (die die Assay-Ziele), die von einem Hersteller bestätigt wurden und/oder durch eine orthogonale Methodik bestätig...

<ol>
	<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li><li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer.">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer.">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li><li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children.">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li><li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma.">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li><li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing's+sarcoma.">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li><li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion.">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute.">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li><li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer.">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li><li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK)+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment.">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li><li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry.">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li><li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions.">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples.">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li><li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors.">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing.">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li><li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion.">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li><li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches.">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).</li><li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions.">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li><li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation:+Report+of+10+Cases.">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li><li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li></ol>

Verankerte Multiplex-PCR-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von der Sequenzierung der nächsten Generation, eignet sich gut für die Multiplex-Genfusionsbewertung in klinischen Tumorproben. Durch die Konzentration auf DEN RNA-Eingang und nicht auf die genomische DNA wird die Notwendigkeit vermieden, große und sich wiederholende Introns zu sequenzieren. Da dieser Ansatz genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners verstärkt, werden neue Fusionen nachgewiesen. Dies ist ein kr...

Die Verschmelzung von zwei oder mehr Genen zu einer einzigen transkriptionellen Einheit kann als Ergebnis großflächiger chromosomaler Variationen auftreten, einschließlich Deletionen, Duplizierungen, Insertionen, Inversionen und Translokationen. Durch veränderte Transkriptionskontrolle und/oder veränderte funktionelle Eigenschaften des exprimierenden Genprodukts können diese Fusionsgene Krebszellen onkogene Eigenschaften verleihen1. In vielen Fällen sind Fusionsgene dafür bekannt, als primäre onkogene Treiber zu fungieren, indem sie die Zellproliferation und Überlebenswege direkt aktivieren.
Die klinische Relevanz von Genfusionen für Krebspatienten wurde erstmals durch die Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms und des entsprechenden BCR-ABL1-Fusionsgens bei chronischer myelogenöser Leukämie (CML)2deutlich. Der kleine Molekülinhibitor Imatinib-Mesylat wurde speziell für dieses Fusionsgen entwickelt und zeigte eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei BCR-ABL1-positivenCML-Patienten3. Die therapeutische Ausrichtung auf onkogene Genfusionen war auch bei soliden Tumoren erfolgreich, wobei die Hemmung von ALK- und ROS1-Fusionsgenen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs als primäre Beispiele 4,5dient. Kürzlich wurde der NTRK-Hemmer Larotrectinib von der FDA für NTRK1/2/3 fusionspositive solide Tumoren zugelassen, unabhängig von der Krankheitsstelle6. Neben der Therapieauswahl spielt der Genfusionsnachweis auch eine Rolle in der Krankheitsdiagnose und -prognose. Dies ist besonders häufig bei verschiedenen Sarkom- und hämatologischen Malignitätssubtypen, die diagnostisch durch das Vorhandensein spezifischer Fusionen definiert werden und/oder für die das Vorhandensein einer Fusion direkt die Prognose7,8 , 9 , 10 , 11. Dies sind nur einige Beispiele für die klinische Anwendung der Genfusionserkennung für Krebspatienten.
Aufgrund der entscheidenden Rolle bei der klinischen Entscheidungsfindung ist der genaue Genfusionsnachweis aus klinischen Proben von entscheidender Bedeutung. Zahlreiche Techniken wurden in klinischen Laboratorien für Fusions- oder chromosomale Umlagerungsanalysen eingesetzt, darunter: zytogenetische Techniken, Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Immunhistochemie (IHC) und 5'/3' Expressionsungleichgewichtsanalyse (unter anderem)12,13,14,15. Derzeit hat die schnell wachsende Liste von umsetzbaren Genfusionen bei Krebs dazu geführt, dass der Fusionsstatus mehrerer Gene gleichzeitig bewertet werden muss. Folglich werden einige traditionelle Techniken, die nur ein oder wenige Gene gleichzeitig abfragen können, zu ineffizienten Ansätzen, insbesondere wenn man bedenkt, dass klinische Tumorproben oft sehr endlich sind und nicht auf mehrere Assays aufgeteilt werden können. Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ist jedoch eine Analyseplattform, die sich gut für Multi-Gen-Tests eignet, und NGS-basierte Assays sind in klinischen molekulardiagnostischen Laboratorien üblich geworden.
Derzeit verwendete NGS-Assays für die Fusions-/Rearrangement-Erkennung variieren in Bezug auf das verwendete Eingabematerial, die für die Bibliotheksvorbereitung und Zielanreicherung eingesetzten Chemikalien und die Anzahl der Gene, die im Rahmen eines Tests abgefragt werden. NGS-Assays können auf RNA oder DNA (oder beidem) basieren, die aus der Probe extrahiert werden. Obwohl die RNA-basierte Analyse durch die Tendenz klinischer Proben behindert wird, stark degradierte RNA zu enthalten, umgeht sie die Notwendigkeit, große und oft sich wiederholende Introns zu sequenzieren, die das Ziel von DNA-basierten Fusionstests sind, sich aber für NGS als schwierig erwiesen haben. Datenanalyse16. Zielanreicherungsstrategien für RNA-basierte NGS-Assays lassen sich weitgehend in hybride Erfassung oder ampliconvermittelte Ansätze unterteilen. Während beide Strategien erfolgreich für die Fusionserkennung eingesetzt wurden, enthält jede von ihnen Vorteile gegenüber den anderen17,18. Hybride Erfassungsassays führen in der Regel zu komplexeren Bibliotheken und reduziertem Allelic-Aussetzer, während ampliconbasierte Assays im Allgemeinen weniger Input erfordern und zu weniger Off-Target-Sequenzierung19führen. Die primäre Einschränkung der traditionellen Amplikon-basierten Anreicherung ist jedoch vielleicht die Notwendigkeit von Primern für alle bekannten Fusionspartner. Dies ist problematisch, da viele klinisch wichtige Gene bekanntermaßen mit Dutzenden von verschiedenen Partnern verschmelzen, und selbst wenn das Primerdesign den Nachweis aller bekannten Partner erlaubt, blieben neuartige Fusionsereignisse unentdeckt. Eine kürzlich beschriebene Technik, die als verankerte Multiplex-PCR (kurz AMP) bezeichnet wird, behebt diese Einschränkung20. In AMP wird ein "halbfunktioneller" NGS-Adapter zu cDNA-Fragmenten ligiert, die aus Input-RNA abgeleitet werden. Die Zielanreicherung wird durch Verstärkung zwischen genspezifischen Primern und einem Primer am Adapter erreicht. Daher sollten alle Fusionen zu Genen von Interesse nachgewiesen werden, selbst wenn ein neuartiger Fusionspartner beteiligt ist (siehe Abbildung 1). Dieser Artikel beschreibt die Verwendung des ArcherDx FusionPlex Solid Tumor Kits, eines NGS-basierten Assays, der AMP für die Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung verwendet, zum Nachweis onkogener Genfusionen in soliden Tumorproben (siehe Ergänzende Tabelle 1 für vollständige Genliste). Das Wet-Bench-Protokoll und die Datenanalysewurden in einem CLIA-zertifizierten Labor (Clinical Laboratory Improvement Amendments) streng validiert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-05-01-13</td>
			<td>Used for TNA dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>Used in library pooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent Reservoir with divider</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9173-2000</td>
			<td>For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9700</td>
			<td>Plate used for thermocycler steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Used in purification after several assay steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Formapure Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A33343</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AB0005</td>
			<td>This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block, 96-well</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A7079</td>
			<td>Used for keeping samples chilled at various steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Used for bead washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification for Illumina Internal Control Standard</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4906</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4973</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Standards</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4903</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet Plate, 96-well (N38 grade)</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td>Used in bead purificiation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBC Adapters Set B</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AK0016-48</td>
			<td>Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td>Used for spinning down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4483485</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microamp Optical Film Compression Pad</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4312639</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plate Spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>MPS-1000</td>
			<td>Used for collecing liquid at bottom of plate wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>Contains components necessary for a MiSeq sequencing run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeqDx System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>NGS Sequencing Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 9700 Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for several steps during assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9938</td>
			<td>Used as general diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical ABI 96-well PCR plate covers</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Workstation Model 600</td>
			<td>Air Clean Systems</td>
			<td>BZ10119636</td>
			<td>Wet-bench assay steps performed in this &#39;dead air box&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1019499</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>LSA28139</td>
			<td>qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Use for determing RNA concentration in TNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-402-178</td>
			<td>Used for general RNase decontamination of work areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>0710-0129</td>
			<td>Used as the assay positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Used in clean-up steps and for sequencing setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td>Component of PreSeq QC Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>Used for reagent and sample mixing etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template RT PCR film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-7800</td>
			<td>Used for covering 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom 96-well Microplate</td>
			<td>LSP</td>
			<td>MP8117-R</td>
			<td>Used during bead purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing

Genfusionen tragen häufig zum onkogenen Phänotyp vieler verschiedener Krebsarten bei. Darüber hinaus beeinflusst das Vorhandensein bestimmter Fusionen in Proben von Krebspatienten häufig direkt die Diagnose, Prognose und/oder Therapieauswahl. Infolgedessen ist der genaue Nachweis von Genfusionen für viele Krankheitstypen zu einem kritischen Bestandteil des klinischen Managements geworden. Bis vor kurzem wurde der klinische Genfusionsnachweis überwiegend durch den Einsatz von Single-Gen-Assays durchgeführt. Die ständig wachsende Liste von Genfusionen mit klinischer Bedeutung hat jedoch dazu führen, dass der Fusionsstatus mehrerer Gene gleichzeitig bewertet werden muss. NGS-basierte Tests der nächsten Generation haben diese Nachfrage durch die Fähigkeit, Nukleinsäure massiv parallel zu sequenzieren, erfüllt. Mehrere NGS-basierte Ansätze, die unterschiedliche Strategien für die Genzielanreicherung anwenden, stehen nun für den Einsatz in der klinischen Molekulardiagnostik zur Verfügung, die jeweils ihre eigenen Stärken und Schwächen haben. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von verankerter Multiplex-PCR (AMP)-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von NGS, um Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. AMP ist einzigartig unter Amplikon-basierten Anreicherungsansätzen, da es Genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners identifiziert. Hier sind sowohl die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte aufgeführt, die einen genauen Genfusionsnachweis aus klinischen Proben gewährleisten.

In Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 sind Screenshots aus der Analyse-Benutzeroberfläche zu sehen, die die Ergebnisse einer Lungenadenokarzinomprobe zeigen. In Abbildung 3wird die Stichprobenzusammenfassung (oben) angezeigt, die die so genannten starken Evidenzfusionen sowie den QC-Status (rot eingekreist) auflistet. Die ADCK4-NUMBL-Fusion (von denen 3 Isoformen aufgeführt sind) wird s...

Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines verankerten Multiplex-Polymerase-Kettenreaktions-basierten Bibliotheksvorbereitungskits, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation, um onkogene Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. Es werden sowohl Die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte beschrieben.

Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Dieses Protokoll wird zum Nachweis von kritisch informativen Genfusionen für Patiententumorproben verwendet. Der Fusionsstatus von Dutzenden von Genen wird gleichzeitig in einem einzigen Test bewertet. Der Vorteil dieser Technik ist, dass ich Genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners aus Tumorproben identifizieren kann, die durch formelhafte Fixierung verarbeitet wurden.Der Nachweis bestimmter Genfusionen in klinischen Tumorproben informiert direkt über Diagnose, Prognose und Behandlungsauswahl bei vielen Krebsarten. Es ist wichtig zu verstehen, dass viele Fusionen, die vom Analysealgorithmus aufgerufen werden, Artefakte sind. Die schwierigste Aufgabe beim Analysieren von Daten ist die Unterscheidung zwischen Artefakt und echten Fusionsaufrufen.Beginnen Sie mit der Verdünnung der Gesamtennukleinsäure, um die gewünschte Konzentration von RNA zu erreichen. Für jede Probe 20 Mikroliter der Verdünnung in die zufälligen Grundierreagenz-Bandrohre in einem vorgekühlten Aluminiumblock übertragen und durch Sechs- bis Achtmales nach oben und unten mischen. Drehen Sie die Proben kurz herunter, übertragen Sie das gesamte Volumen auf eine 96-Well-PCR-Platte und versiegeln Sie sie mit Plattenversiegelungsfolie.Legen Sie die Platte in einen Thermocycler ein, decken Sie sie mit dem Kompressionspad ab und schließen Sie den Deckel. Bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Nach der Inkubation das gesamte Volumen des zufälligen Grundierprodukts in die ersten Strangreagenzbandrohre übertragen.Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten und kurz nach unten drehen. Übertragen Sie das gesamte Volumen auf eine 96-Well-PCR-Platte und versiegeln Sie mit RT-Folie. Setzen Sie die Platte in den Thermocycler ein und führen Sie die Reaktion entsprechend den Manuskriptrichtungen aus.Führen Sie die zweite Strang-cDNA-Synthese und Reparatur und LigationSchritt eins entsprechend den Manuskriptrichtungen durch und fahren Sie mit dem zweiten Ligationsschritt fort. Um den molekularen Barcode oder MBC AdapterStreifenrohre zu nummerieren, positionieren Sie die Rohre horizontal mit Scharnieren nach hinten und verwenden Sie einen permanenten Marker. Nehmen Sie die Perlenreinigungsplatte aus dem ersten Ligationsschritt und übertragen Sie 40 Mikroliter jeder Probe in die MBC Adapterstreifenrohre, wobei darauf geachtet wird, das Perlenpellet nicht zu stören.Mischen Sie die Reagenzien durch Pipettieren, drehen Sie die Rohre herunter und übertragen Sie das gesamte Volumen auf die Ligationsstufe zwei Reagenzienbandrohre. Mischen Sie die Proben, drehen Sie sie nach unten, und legen Sie sie in einen Thermocycler-Block. Lassen Sie den beheizten Deckel ab und führen Sie den Thermocycler bei 22 Grad Celsius für fünf Minuten, gefolgt von 4 Grad Celsius halten.Als nächstes bereiten Sie die Ligationsbereinigung Perlen vor, indem Sie sie wirbeln und 50 Mikroliter zu einem neuen Satz von PCR-Streifenröhren hinzufügen. Auf dem Magneten für eine Minute bebrüten und den Überstand entsorgen. Entfernen Sie die Streifenrohre vom Magneten und setzen Sie die Perlen in 50 Mikroliter Ligationsreinigungspuffer wieder auf, indem Sie nach oben und unten pfeifen.Übertragen Sie das gesamte Probenvolumen aus dem zweiten Ligationsschritt in den Ligationsbereinigungsperlenstreifen. Wirbeln Sie die Proben zu mischen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Wirbeln Sie die Probe einmal auf halbem Weg durch die Inkubation.Anschließend wirbeln die Proben, spinnen Sie sie herunter und brüten eine Minute lang auf dem Magneten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter frischer Ligationsreinigungspuffer hinzu. Wirbel zum Resuspendieren, Nachdrehen und Platzieren auf dem Magneten für eine Minute.Nach den beiden Waschungen eine dritte Wäsche mit reinem Wasser anstelle von Puffer durchführen. Setzen Sie die Perlen in 20 Mikrolitern von 5 Millimeter Natriumhydroxid aus und übertragen Sie die Proben auf eine 96-Well-PCR-Platte. Legen Sie die Platte in einen Thermocycler mit einem Kompressionspad und führen Sie sie bei 75 Grad Celsius für 10 Minuten, gefolgt von einem 4 Grad Celsius halten.Sobald die Proben auf 4 Grad Celsius abgekühlt sind, legen Sie die Platte mindestens drei Minuten auf einen Magneten und fahren Sie mit der ersten PCR fort. Bereiten Sie die PCR-Reaktionen vor, indem Sie zwei Mikroliter GSP1-Primer zu jedem Bohrwert des ersten PCR-Reagenzstreifens hinzufügen. 18 Mikroliter des zweiten Ligationsreinigungsprodukts auf die ersten PCR-Reagenzbandrohre übertragen und durch Pipettieren nach oben und unten mischen.Drehen Sie die Proben herunter und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-PCR-Platte. Legen Sie sie in den Thermocycler und führen Sie PCR entsprechend den Manuskriptrichtungen aus. Fahren Sie mit der Perlenreinigung fort, indem Sie 20 Mikroliter des PCR-Produkts zu einer U-Bodenplatte hinzufügen, die mit 24 MikroliterReinigungsperlen pro Brunnen gefüllt ist.Pipette nach oben und unten zu mischen und lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für fünf Minuten, dann inkubieren Sie die Platte auf dem Magneten für zwei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand aus den Perlen und waschen Sie ihn zweimal mit 200 Mikrolitern 70% Ethanol. Nach der letzten Wäsche das gesamte Ethanol entfernen und die Probenluft zwei Minuten trocknen lassen.Entfernen Sie die Platte vom Magneten und setzen Sie die Perlen in 24 Mikrolitern von 10 Millimeter NB-HCl und pH 8.0 wieder auf. Den Magneten für drei Minuten abbrüteund und dann die Platte für zwei Minuten wieder auf den Magneten legen. Beginnen Sie die Bibliotheksquantifizierung, indem Sie ein bis fünf Verdünnungen des zweiten PCR-Produkts in 10-Millimeter-Tris-HCl vorbereiten.Folgen Sie diesem durch eine serielle Verdünnung von 1:199, 1:199 und 20:80 in 10 Millimeter Tris-HCl mit 05%Polysorbat. Richten Sie die Schlüssel-PCR ein, indem Sie jedem Brunnen einer optischen 96-Well-Platte sechs Mikroliter Master-Mix hinzufügen, gefolgt von vier Mikrolitern der entsprechenden Verdünnung oder Norm. Drehen Sie die Platte herunter und laden Sie sie in das qPCR-Instrument.Führen Sie qPCR gemäß den Manuskriptanweisungen aus. Nachdem die Bibliotheksquantifizierung abgeschlossen ist, verdünnen Sie alle Bibliotheken auf zwei Nanomolar mit 10 Millimeter Tris-HCl. Erstellen Sie einen Bibliothekspool, indem Sie 10 Mikroliter jeder normalisierten Bibliothek zu einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr kombinieren.Als nächstes bereiten Sie die denaturierte Amplicon-Bibliothek, oder DAL-Pool, vor, indem Sie 10 Mikroliter des Bibliothekspools mit 10 Mikrolitern 0,2 normalem Natriumhydroxid kombinieren und die Mischung für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 10 Mikroliter 200 Millimeter Tris-HCl bei pH 7,0 hinzufügen, gefolgt von 970 MikroliterHT1 Hybridization Buffer. Machen Sie das endbelastbare Rohr, indem Sie 300 Mikroliter HT1, 25 Mikroliter 20 picomolar PhiX und 675 Mikroliter des DAL-Pools kombinieren.Fügen Sie das gesamte Volumen des Lastrohrs in den Probenbrunnen der Sequenzer-Reagenzpatrone und laden Sie die Patrone in den Sequenzer. Wählen Sie zunächst die Positivkontrollprobe aus und stellen Sie sicher, dass alle erwarteten Fusionen und onkogenen Isoformen nachgewiesen und auf der Registerkarte "Starke Evidenz" aufgeführt sind. Überprüfen Sie für jedes Beispiel die durchschnittlichen eindeutigen Startsites pro GSP2-Steuerelementwert, und visualisieren Sie dann die unterstützenden Lesevorgänge für jede potenzielle Fusion, indem Sie auf den Link "Visualisieren" klicken, der den Benutzer zu einer webbasierten JBrowse-Ansicht von Anhäufungen einzelner Fusionsunterstützender Lesevorgänge führt.Bestätigen Sie, dass die Lesevorgänge größtenteils frei von Inübereinstimmungen sind, aber mehr als 30 Basen der Lesevorgänge mit dem Fusionspartner übereinstimmen und dass Sequenzen, die an den Haltepunkt zwischen den Genen und Primerbindungsstellen angrenzen, frei von Einfügungen oder Löschungen sind. Es ist wichtig sicherzustellen, dass jede Anruffusion im Allgemeinen frei von Fehlausrichtung ist und dass ein erheblicher Teil der Lesevorgänge mit dem Fusionspartner übereinstimmt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um den Genfusionsstatus in einer Lungenadenokarzinomprobe zu untersuchen.Die Zusammenfassung zeigt starke Evidenzfusionen und die Seite Statistik lesen zeigt Metriken der Stichprobe. Diese Probe weist eine gute RNA-Qualität auf, so dass negative Ergebnisse gemeldet würden, wenn keine Fusionen gefunden würden. Ein legitimer Fusionsaufruf hat eine hohe Anzahl von unterstützenden Lesevorgängen, einen hohen Prozentsatz der Lesevorgänge aus dem Primer, der die Fusion unterstützt, und eine hohe Anzahl von Startsites.Die Visualisierung der Lesevorgänge zeigt eine gute Ausrichtung auf große Bereiche des Fusionspartners. Umgekehrt weist ein artefaktischer Fusionsaufruf niedrigere unterstützende Metriken und eine hohe Fehlerquote bei der Zuordnung zum Partner auf. Artefaktische Fusionsaufrufe, die vom Analysealgorithmus getätigt werden, sind häufig.Es ist wichtig, jeden Aufruf manuell zu inspizieren, um sicherzustellen, dass er eine echte Genfusion in der Patientenprobe darstellt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Forschung

Krebsforschung

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Räumliches Profiling der Protein- und RNA-Expression im Gewebe: Ein Ansatz zur Feinabstimmung der virtuellen Mikrodissektion

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...