Name: oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי משאב משותף לפתולוגיה מולקולרית של אוניברסיטת קולורדו (המכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכה מענקים לא. P30-CA046934) ועל ידי מרכז קולורדו לרפואה אישית.

1. הכנה ועריכה של הספרייה
<ol><li>שיקולי שיקול כללי ושלבי מראש
	<ol>
<li>שיטת הפעולה מורכבת בדרך כלל משבעה דגימות קליניות ושליטה חיובית אחת (למרות שניתן לכוונן את מספר הדגימות לכל ההכנה בספריה בהתאם לצורך). השתמש בפקד חיובי המכיל לפחות מספר fusions גנים (כי מטרות הספק) אשר אושרו על-ידי יצרן ו/...

<ol>
	<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li><li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer.">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer.">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li><li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children.">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li><li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma.">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li><li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing's+sarcoma.">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li><li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion.">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute.">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li><li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer.">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li><li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK)+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment.">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li><li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry.">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li><li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions.">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples.">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li><li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors.">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing.">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li><li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion.">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li><li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches.">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).</li><li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions.">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li><li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation:+Report+of+10+Cases.">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li><li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li></ol>

העשרה היעד המבוסס על PCR והכנה הספריה מעוגנת ואחריו רצף הדור הבא מתאים גם להערכת היתוך גנים מולטיקות בדגימות הגידול הקליני. על ידי התמקדות בקלט RNA במקום DNA גנומית, הצורך ברצף introns גדולים וחוזרים הוא נמנע. בנוסף, מאז גישה זו מגבירה את הגן fusions ללא קשר לזהותו של שותף היתוך, fusions הרומן מזוהים. זהו י...

המיזוג של שניים או יותר גנים לתוך ישות בודדת הטרנססקריפט יכול להתרחש כתוצאה של וריאציות בקנה מידה גדול כרומוזום כולל מחיקות, כפילויות, הוספות, inversions, ו translocations. באמצעות שינוי שליטה ההמרה ו/או מאפיינים פונקציונליים משתנה של המוצר הגן המבוטא, אלה גנים היתוך יכול להעניק מאפיינים אונגניים לתאים סרטניים1. במקרים רבים, גנים היתוך ידועים לשמש מנהלי אונגניים העיקרי על ידי הפעלת התפשטות הסלולר ומסלולים הישרדות.
הרלוונטיות הקלינית של fusions גנים לחולי סרטן התברר תחילה עם גילוי של כרומוזום פילדלפיה ואת הגן המקביל Bcr-ABL1 fusion ב לוקמיה myeloסוגני כרונית (cml)2. מולקולה קטנה מעכב imatinib mesylate פותחה במיוחד היעד הזה גן היתוך והפגינו יעילות יוצאת דופן Bcr-ABL1-חיובי cml חולים3. התמקדות טיפולית של fusions גן אונגניים יש גם הצליח בגידולים מוצקים, עם עיכוב של הROS1 והפיוז גנים בסרטן שאינם קטנים הריאות התאים לשמש דוגמאות ראשיות4,5. לאחרונה, מעכב NTRK המעכב את ה-FDA אושרה עבור NTRK1/2/3 פיוז'ן-חיובי מוצק גידולים, ללא קשר לאתר מחלה6. מעבר בחירת תרפיה, זיהוי היתוך גנטי יש גם תפקידים אבחון המחלה פרוגנוזה. זה נפוץ במיוחד סרקומה שונים וסוגי ממאירות המטולוגיים המוגדרים באופן מאבחן על ידי נוכחות של fusions ספציפי ו/או עבור איזו נוכחות של היתוך ישירות מודיע פרוגנוזה7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. אלה הם אבל כמה דוגמאות של היישום הקליני של זיהוי היתוך גנטי לחולי סרטן.
בשל התפקיד הקריטי בקבלת החלטות קליניות, זיהוי היתוך גנטי מדויק מדגימות קליניות הוא בעל חשיבות חיונית. טכניקות רבות הוחלו במעבדות הקליני לניתוח היתוך או כרומוזומיום כולל: שיטות ציטוגנטיות, הפוכה הפוך תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR), זריחה בתוך היברידיזציה באתרו (דג), אימונוהיסטוכימיה (ihc), וביטוי של 5 '/3 ' ניתוח חוסר איזון (בין היתר)12,13,14,15. כיום, הרשימה המתרחב במהירות של גן שימושי fusions בסרטן הביא את הצורך להעריך סטטוס היתוך של גנים מרובים בו זמנית. כתוצאה מכך, כמה טכניקות מסורתיות שיכולות רק לבצע שאילתה אחת או כמה גנים בזמן הם הופכים גישות לא יעילות, במיוחד כאשר בהתחשב כי דגימות הגידול הקליני הם לעתים קרובות מאוד סופי ולא מוכן להיות מחולק בין כמה assays מספר. רצף הדור הבא (ngs), עם זאת, היא פלטפורמת ניתוח כי הוא מתאים גם עבור בדיקות מרובות גנים, ו ngs מבוסס בחני הפכו נפוצים במעבדות אבחון קליני מולקולרי.
משמש כיום ngs בחני לאיתור היתוך/סידור מחדש לגבי חומר הקלט המשמש, את ה המועסקים להכנת הספריה העשרה היעד, ואת מספר הגנים שאילתות בתוך הסדר. Ngs בחני יכול להיות מבוסס על RNA או DNA (או שניהם) שחולצו מן המדגם. למרות RNA מבוססי ניתוח הוא הקשה על ידי הנטייה של דגימות קליניות להכיל RNA מושפל מאוד, זה חוסם את הצורך רצף introns גדולים לעתים קרובות חוזרות כי הם מטרות של בדיקות היתוך מבוססי DNA אבל הוכיחו להיות קשה NGS . ניתוח נתונים16 אסטרטגיות העשרה יעד עבור מבוססי RNA ngs בחני יכול להיות מחולק במידה רבה ללכידה היברידית או amplicon-בתיווך גישות. בעוד ששתי האסטרטגיות שנוצלו בהצלחה לאיתור היתוך, כל אחד מהם מכיל יתרונות על פני17,18. היברידית לכידת בחני התוצאה בדרך כלל בספריות מורכבות יותר מופחתת allelic נושרת, בעוד amplicon מבוסס בחני בדרך כלל דורשים קלט נמוך ותוצאה פחות מחוץ למטרה רצף19. עם זאת, אולי המגבלה העיקרית של העשרה המסורתית מבוסס amplicon הוא הצורך בצבעי היסוד לכל שותפי היתוך ידועים. זה בעייתי מאז רבים הגנים החשובים קלינית ידועים הפתיל עם עשרות שותפים שונים, וגם אם העיצוב התחל מותר לגילוי של כל השותפים הידועים, הרומן היתוך אירועים יישאר לא מזוהה. טכניקה שתוארה לאחרונה כינה מספר מעוגן PCR (או AMP עבור קצר) כתובות זה מגבלה20. ב AMP, מתאם ' חצי פונקציונלי ' NGS הוא ליגלים לרסיסים cDNA הנגזרים מ-RNA קלט. העשרה היעד מושגת על ידי הגברה בין התחל הספציפי גנים התחל למתאם. כתוצאה מכך, כל הfusions לגנים של עניין, גם אם שותף היתוך הרומן מעורב, יש לזהות (ראה איור 1). מאמר זה מתאר את השימוש בערכת הגידול המלא של ArcherDx, מבוסס NGS, אשר מעסיקה AMP עבור העשרה היעד והכנת הספריה, לאיתור fusions גן אונגניים בדגימות הגידול מוצק (ראה טבלה משלימים 1 עבור רשימת גנים מלאה). פרוטוקול הספסל רטוב וניתוח נתונים הצעדים אומתו בקפדנות בתיקונים קליניים שיפור במעבדה (CLIA) מעבדה מוסמכת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-05-01-13</td>
			<td>Used for TNA dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>Used in library pooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent Reservoir with divider</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9173-2000</td>
			<td>For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9700</td>
			<td>Plate used for thermocycler steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Used in purification after several assay steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Formapure Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A33343</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AB0005</td>
			<td>This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block, 96-well</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A7079</td>
			<td>Used for keeping samples chilled at various steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Used for bead washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification for Illumina Internal Control Standard</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4906</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4973</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Standards</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4903</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet Plate, 96-well (N38 grade)</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td>Used in bead purificiation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBC Adapters Set B</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AK0016-48</td>
			<td>Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td>Used for spinning down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4483485</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microamp Optical Film Compression Pad</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4312639</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plate Spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>MPS-1000</td>
			<td>Used for collecing liquid at bottom of plate wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>Contains components necessary for a MiSeq sequencing run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeqDx System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>NGS Sequencing Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 9700 Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for several steps during assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9938</td>
			<td>Used as general diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical ABI 96-well PCR plate covers</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Workstation Model 600</td>
			<td>Air Clean Systems</td>
			<td>BZ10119636</td>
			<td>Wet-bench assay steps performed in this &#39;dead air box&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1019499</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>LSA28139</td>
			<td>qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Use for determing RNA concentration in TNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-402-178</td>
			<td>Used for general RNase decontamination of work areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>0710-0129</td>
			<td>Used as the assay positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Used in clean-up steps and for sequencing setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td>Component of PreSeq QC Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>Used for reagent and sample mixing etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template RT PCR film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-7800</td>
			<td>Used for covering 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom 96-well Microplate</td>
			<td>LSP</td>
			<td>MP8117-R</td>
			<td>Used during bead purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing

ג'ין fusions לעתים קרובות לתרום הפנוגניים הפנטיפ של סוגים רבים ושונים של סרטן. בנוסף, הנוכחות של fusions מסוימים בדגימות מחולי סרטן לעתים קרובות ישירות משפיע על אבחון, פרוגנוזה, ו/או טיפול בחירה. כתוצאה מכך, זיהוי מדויק של fusions גן הפך למרכיב קריטי של ניהול קליני עבור סוגי מחלות רבות. עד לאחרונה, זיהוי היתוך הגן הקליני הושג בעיקר באמצעות שימוש באחד הגנים assays. עם זאת, את הרשימה ההולכת וגוברת של גנים fusions עם משמעות קלינית יצרה צורך בהערכת סטטוס היתוך של גנים מרובים בו זמנית. רצף הדור הבא (NGS) מבוססי בדיקות פגש ביקוש זה דרך היכולת לרצף חומצת גרעין בצורה מקבילה בנפט. מספר גישות מבוססות NGS המעסיקים אסטרטגיות שונות עבור העשרה היעד גנטי זמינים כעת לשימוש באבחון מולקולרי קליני, כל אחד עם החוזקות שלה חולשות. מאמר זה מתאר את השימוש במגה-בתים מעוגנים PCR (AMP) מבוסס העשרה יעד הכנה הספריה ואחריו NGS כדי להעריך את הגן fusions בדגימות הגידול הקליני מוצק. AMP היא ייחודית בקרב גישות העשרה מבוססות amplicon כי הוא מזהה גנים fusions ללא קשר לזהותו של שותף הפיוז. מפורטים כאן הן הספסל רטוב וניתוח נתונים שלבים שמבטיחים זיהוי היתוך גנטי מדויק מדגימות קליניות.

מוצג באיור 3, איור 4 ואיור 5 הם צילומי מסך מממשק המשתמש ניתוח להפגין תוצאות ממדגם אדנוקרצינומה ריאה. באיור 3, התקציר לדוגמה מוצג (למעלה) המפרט את הfusions הראיות החזקות, כמו גם את מצב ה-QC (מוקפים באדום). פיוז ' ן ADCK4- מנוקל (אשר שלו...

Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

מאמר זה מפרט את השימוש ברשת מעוגנת מערכת התגובה המבוססת על תגובת שרשרת של הספרייה ואחריו ברצף הדור הבא כדי להעריך את fusions גן אונגניים בדגימות הגידול הקליני מוצק. מתוארים שלבי הספסל הרטוב וניתוח הנתונים.

היתוך גנים אונגניים באמצעות שרשרת מעוגנת התגובה השרשרת מעוגן ואחריו רצף הדור הבא

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

פרוטוקול זה משמש לגילוי היתוך גנים אינפורמטיביים קריטיים לדגימות גידול של מטופלים. מצב ההיתוך של עשרות גנים מוערך בו זמנית בהסטה אחת. היתרון של טכניקה זו הוא שאני יכול לזהות היתוך גנים ללא קשר לזהותו של שותף ההיתוך מדגימות הגידול שעובדו על ידי קיבעון נוסחתי.הגילוי של היתוך גנים מסוימים בדגימה גידול קליני מודיע ישירות אבחון, פרוגנוזה ובחירת טיפול בסוגים רבים של סרטן. זה קריטי להבין כי היתוך רבים שנקרא על ידי אלגוריתם הניתוח הם חפצים. המשימה הקשה ביותר בעת ניתוח נתונים היא הבחנה בין חפץ לבין שיחות היתוך אמיתיות.התחל על ידי דילול חומצת גרעין הכוללת כדי להשיג את הריכוז הרצוי של RNA. עבור כל מדגם, להעביר 20 microliters של הדילול לתוך צינורות רצועת reagent priming אקראי בבלוק אלומיניום מקורר מראש ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה שש עד שמונה פעמים. בקצרה לסובב את הדגימות, להעביר את כל עוצמת הקול לצלחת PCR 96-well, ולאטום עם סרט איטום צלחת.הכנס את הצלחת לתוך התרמוצ'ילר, לכסות עם כרית הדחיסה, ולסגור את המכסה. דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, להעביר את כל הנפח של המוצר priming אקראי צינורות רצועת הרצועה הריג'נט הגדיל הראשון.מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה ולסובב בקצרה למטה. העבר את עוצמת הקול כולה לצלחת PCR 96 היטב וחותם עם סרט RT. הכנס את הלוחית לתרמוציקלר והפעל את התגובה בהתאם לכיווני כתב היד.בצע סינתזת cDNA גדיל השני, ותיקון, שלב קשירה אחד על פי הוראות כתב היד ולהמשיך לשלב הקשירה השני. כדי למספר את ברקוד מולקולרי או צינורות רצועת מתאם MBC, למקם את הצינורות אופקית עם צירים לחלק האחורי ולהשתמש סמן קבוע. קח את צלחת טיהור חרוזים מן הצעד הראשון קשירה ולהעביר 40 microliters של כל מדגם לתוך צינורות רצועת מתאם MBC, דואג לא להפריע גלולת חרוזים.מערבבים את הריג'ים על ידי צינורות, לסובב את הצינורות, ולהעביר את כל הנפח לשלב הקשה שני צינורות רצועה reagent. מערבבים את הדגימות, מסובבים אותן כלפי מטה, ומ מניחים בבלוק תרמוסיקלר. השאירו את המכסה המחומם והפעילו את התרמוצ'ילר ב-22 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואחריו 4 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להכין את חרוזי ניקוי קשירה על ידי מערבולת אותם והוספת 50 microliters לקבוצה חדשה של צינורות פס PCR. דגירה על המגנט לדקה אחת ולהשליך את העל-טבעי. הסר את צינורות הרצועה מהמגנט ולחץ מחדש על חרוזים ב 50 microliters של חיץ ניקוי קשירה על ידי צינור למעלה ולמטה.העבר את אמצעי האחסון לדוגמה כולו מהשלב השני של הרצועה לתוך רצועת חרוז ניקוי הרצועה. Vortex הדגימות לערבב ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. וורטקס הדגימה פעם אחת באמצע הדגירה.לאחר מכן, מערבולת הדגימות, לסובב אותם למטה, דגירה על המגנט לדקה אחת. השלך את העל-טבעי והוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר ניקוי קשירה טרי. מערבולת כדי להתרכך, להסתובב למטה, ולמקם על המגנט לדקה אחת.לאחר שתי שטיפה, לבצע שטיפה שלישית באמצעות מים אולטרה חוץ במקום חיץ. תן שימוש חוזר את חרוזים ב 20 microliters של 5 מילימטרים נתרן הידרוקסיד ולהעביר את הדגימות לצלחת PCR 96-well. מניחים את הצלחת לתוך תרמוצ'ילר עם כרית דחיסה ולהפעיל אותו ב 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואחריו להחזיק 4 מעלות צלזיוס.לאחר הדגימות התקררו ל 4 מעלות צלזיוס, מניחים את הצלחת על מגנט לפחות שלוש דקות ולהמשיך עם PCR הראשון. הכן את תגובות PCR על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של פריימרים GSP1 לכל באר של רצועת הריג'נט PCR הראשונה. העבר 18 מיקרוליטרים של מוצר ניקוי הרצועות השני לצינורות רצועת הריג'נט הראשונים של PCR ומערבבים על ידי צינורות למעלה ולמטה.סובב את הדגימות והעבר אותן לצלחת PCR של 96 באר. מניחים אותם לתוך התרמוצ'ילר ולהפעיל PCR על פי הוראות כתב היד. המשך עם טיהור חרוזים על ידי הוספת 20 microliters של המוצר PCR לצלחת U-bottom מלא 24 microliters של חרוזים טיהור לבא.פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהשאיר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, ואז להידגר את הצלחת על המגנט במשך שתי דקות. השליכו את העל-טבעי מהחרוזים ושטפו אותם פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של 70% אתנול. לאחר הכביסה הסופית, להסיר את כל האתנול ולתת את האוויר לדגום יבש במשך שתי דקות.מוציאים את הלוחית מהמגנט ומוציאים מחדש את חרוזים ב-24 מיקרוליטרים של טריס-HCl 10 מילימטר ו-pH 8.0. דגירה את המגנט במשך שלוש דקות ולאחר מכן למקם את הצלחת בחזרה על המגנט במשך שתי דקות. התחל כימות ספרייה על ידי הכנת אחד עד חמישה דילולים של מוצר PCR השני ב 10 מילימטר טריס-HCl.בצע זאת על-ידי דילול סדרתי של 1:199, 1:199 ו- 20:80 ב- 10 מילימטר טריס-HCl עם 05%polysorbate. הגדר PCR מפתח על ידי הוספת שישה microliters של תערובת אב לכל באר של צלחת אופטית 96 באר, ואחריו ארבעה microliters של דילול או תקן המתאים. לסובב את הצלחת טען אותו לתוך מכשיר qPCR.בצע qPCR בהתאם לכיווני כתב היד. לאחר כימות הספרייה הושלמה, לדלל את כל הספריות לשני nanomolar עם 10 מילימטר טריס-HCl. הפוך בריכת ספרייה על ידי שילוב של 10 microliters של כל ספרייה מנורמלת לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר מיקרוצנטריפוגה.לאחר מכן, הכינו את ספריית האמפליקון, או בריכת DAL, על ידי שילוב של 10 מיקרוליטרים של בריכת הספרייה עם 10 מיקרוליטרים של 0.2 נתרן הידרוקסידי רגיל ודגירה של התערובת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, להוסיף 10 microliters של 200 מילימטר טריס-HCl ב pH 7.0, ואחריו 970 microliters של חיץ הכלאה HT1. הפוך את צינור העומס הסופי על ידי שילוב של 300 microliters של HT1, 25 microliters של 20 picomolar PhiX, ו 675 microliters של בריכת DAL.הוסף את כל עוצמת הקול של צינור העומס ל הבאר לדוגמה של מחסנית הריג'נט הרצף וטען את המחסנית לרצף. התחל על-ידי בחירת דוגמת הבקרה החיובית וודא שכל ההיתוך הצפוי והאיסופורמים האונקוגניים זוהו והם מפורטים בכרטיסיה ראיות חזקות. עבור כל דוגמה, בדוק את אתרי ההתחלה הייחודיים הממוצעים לכל ערך פקד GSP2 ולאחר מכן דמיין את קריאות התמיכה עבור כל היתוך פוטנציאלי על-ידי לחיצה על הקישור הצג חזותי שלוקח את המשתמש לתצוגת JBrowse מבוססת אינטרנט של ערימות של קריאות תומכות היתוך בודדות.ודא כי קריאות הם בעיקר ללא התאמה, אבל יותר מ 30 בסיסים של קריאות ליישר עם שותף היתוך, כי רצפים הסמוכים נקודת העצירה בין הגנים ואתרי איגוד פריימר הם ללא הוספות או מחיקות. זה קריטי כדי להבטיח כי כל היתוך שיחה הוא בדרך כלל ללא אי התאמה, כי חלק משמעותי של הקריאות ליישר את השותף היתוך. פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את מצב היתוך גנים בדגימה אדנוקרצינומה ריאות.הסיכום מציג היתוך ראיות חזק והדף 'קריאת סטטיסטיקה' מציג מדדים של המדגם. מדגם זה מציג איכות RNA טובה כך תוצאות שליליות ידווחו אם לא נמצאו היתוך. לשיחת היתוך לגיטימית יש מספר גבוה של קריאות תומכות, אחוז גבוה של קריאות מה פריימר התומך בהיתוך ומספר גבוה של אתרי התחלה.הדמיה של קריאות מדגימה יישור טוב לאזורים גדולים של שותף ההיתוך. לעומת זאת, לשיחת היתוך חפצים יש מדדי תמיכה נמוכים יותר וקצב שגיאות גבוה בעת מיפוי לשותף. שיחות היתוך חפץ שבוצעו על ידי אלגוריתם הניתוח נפוצות.זה קריטי כדי לבדוק באופן ידני כל שיחה כדי להבטיח שהוא מייצג היתוך גנים אמיתי בדגימה החולה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

מלכודת droplet דיגיטלית (ddTRAP): הסתגלות פרוטוקול Telomere חזרה הגברה על תגובת שרשרת התגובה של רביב דיגיטלי

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

פרופיל מרחבי של ביטוי חלבונים ורנ"א ברקמות: גישה לכוונון עדין של מיקרו-דיסקציה וירטואלית

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...