Name: oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla Molecular Pathology Shared Resource dell'Università del Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) e dal Colorado Center for Personalized Medicine.

1. Preparazione della biblioteca e sequenziamento
<ol><li>Considerazioni generali sul saggio e passi di pre-saggio
	<ol>
<li>Le esecuzioni di analisi sono in genere costituite da sette campioni clinici e da un controllo positivo (anche se il numero di campioni per ogni esecuzione di preparazione della libreria può essere regolato in base alle esigenze). Utilizzare un controllo positivo che contenga almeno diverse fusioni genetiche (che il test è obiettivo) che sono state confermate da un produttore e...

<ol>
	<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li><li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer.">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer.">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li><li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children.">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li><li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma.">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li><li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing's+sarcoma.">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li><li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion.">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute.">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li><li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer.">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li><li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK)+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment.">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li><li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry.">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li><li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions.">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples.">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li><li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors.">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing.">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li><li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion.">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li><li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches.">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).</li><li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions.">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li><li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation:+Report+of+10+Cases.">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li><li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li></ol>

L'arricchimento e la preparazione della libreria basati su PCR multiplex ancorati seguiti dal sequenziamento di nuova generazione sono adatti per la valutazione della fusione genica multiplexneista in campioni di tumore clinici. Concentrandosi sull'input di RNA piuttosto che sul DNA genomico, si evita la necessità di sequenziare introni di grandi dimensioni e ripetitivi. Inoltre, poiché questo approccio amplifica le fusioni geniche indipendentemente dall'identità del partner di fusione, vengono rilevate nuove fusioni....

La fusione di due o più geni in una singola entità trascrizionale può avvenire come risultato di variazioni cromosomiche su larga scala, tra cui delezioni, duplicazioni, inserimenti, inversioni e traslocazioni. Attraverso il controllo trascrizionale alterato e/o le proprietà funzionali alterate del prodotto genetico espresso, questi geni di fusione possono conferire proprietà oncogene alle cellule tumorali1. In molti casi, i geni di fusione sono noti per agire come driver oncogeni primari attivando direttamente la proliferazione cellulare e le vie di sopravvivenza.
La rilevanza clinica delle fusioni geniche per i pazienti oncologici è diventata evidente con la scoperta del cromosoma di Filadelfia e del corrispondente gene di fusione BCR-ABL1 nella leucemia mielogiosa cronica (CML)2. L'imasilatere di piccole molecole imalistio mesylate è stato sviluppato per indirizzare specificamente questo gene di fusione e ha dimostrato una notevole efficacia nei pazienti positivi a CCML BCR-ABL13. Il targeting terapeutico delle fusioni geniche oncogeniche ha avuto successo anche nei tumori solidi, con l'inibizione dei geni di fusione ALK e ROS1 nel cancro del polmone non a piccole cellule che funge da esempi primari4,5. Recentemente, l'inibitore NTRK larotrectinib è stato approvato dalla FDA per i tumori solidi NTRK1/2/3 con grado di fusione positivi, indipendentemente dal sito della malattia6. Oltre alla selezione della terapia, il rilevamento della fusione genica ha anche ruoli nella diagnosi e nella prognosi della malattia. Ciò è particolarmente diffuso in vari sottotipi di sarcoma e malignità ematologica che sono definiti diagnosticamente dalla presenza di fusioni specifiche e/o per i quali la presenza di una fusione direttamente in forma prognosi7,8 , 9 (in vie , 10 del sistema , 11.Questi sono solo alcuni esempi dell'applicazione clinica del rilevamento della fusione genica per i pazienti oncologici.
A causa del ruolo fondamentale nel processo decisionale clinico, la rilevazione accurata della fusione genica da campioni clinici è di vitale importanza. Numerose tecniche sono state applicate nei laboratori clinici per l'analisi di riorganizzazione della fusione o cromosomica, tra cui: tecniche citogenetiche, reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR), fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH), immunohistochimica (IHC) e 5'/3' analisi dello squilibrio di espressione (tra gli altri)12,13,14,15. Attualmente, l'elenco in rapida espansione delle fusioni di geni utilizzabili nel cancro ha portato alla necessità di valutare contemporaneamente lo stato di fusione di più geni. Di conseguenza, alcune tecniche tradizionali che possono interrogare solo uno o pochi geni alla volta stanno diventando approcci inefficienti, soprattutto se si considera che i campioni di tumore clinico sono spesso molto finiti e non suscettibili di essere divisi tra diversi saggi. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), tuttavia, è una piattaforma di analisi adatta per i test multigeni, e i saggi basati su NGS sono diventati comuni nei laboratori clinici di diagnostica molecolare.
I saggi NGS attualmente utilizzati per il rilevamento della fusione/riarrangiamento variano per quanto riguarda il materiale di input utilizzato, le funzioni chimiche impiegate per la preparazione della biblioteca e l'arricchimento dei bersagli e il numero di geni interrogati all'interno di un'analizzazione. I saggi NGS possono essere basati su RNA o DNA (o entrambi) estratti dal campione. Sebbene l'analisi basata sull'RNA sia ostacolata dalla tendenza dei campioni clinici a contenere RNA altamente degradato, elude la necessità di sequenziare introni grandi e spesso ripetitivi che sono gli obiettivi di test di fusione basati su DNA, ma si sono dimostrati difficili per NGS analisi dei dati16. Le strategie di arricchimento target per i saggi NGS basati sull'RNA possono essere in gran parte suddivise in approcci ibridi di cattura o di amplicon mediazione. Mentre entrambe le strategie sono state utilizzate con successo per il rilevamento della fusione, ognuna contiene vantaggi rispetto alle altre17,18. I saggi di cattura ibrida in genere si traducono in librerie più complesse e in un abbandono allelico ridotto, mentre i saggi basati su amplicon richiedono generalmente un input inferiore e comportano un sequenziamento meno off-target19. Tuttavia, forse la limitazione primaria dell'arricchimento tradizionale basato sull'amplicon è la necessità di primer per tutti i partner di fusione conosciuti. Questo è problematico poiché molti geni clinicamente importanti sono noti per fondersi con decine di partner diversi, e anche se la progettazione del primer permettesse di rilevare tutti i partner noti, nuovi eventi di fusione rimarrebbero inosservati. Una tecnica descritta di recente definita multiplex PCR (o AMP in breve) affronta questa limitazione20. In AMP, un adattatore NGS "semifunzionale" è migate a frammenti di cDNA derivati dall'RNA di input. L'arricchimento del bersaglio si ottiene amplificando tra primer specifici del gene e un primer all'adattatore. Di conseguenza, tutte le fusioni con geni di interesse, anche se è coinvolto un nuovo partner di fusione, dovrebbero essere rilevate (vedi Figura 1). Questo articolo descrive l'uso del kit ArcherDx FusionPlex Solid Tumor, un saggio basato su NGS che impiega AMP per l'arricchimento del bersaglio e la preparazione della libreria, per il rilevamento di fusioni geniche oncogeniche in campioni di tumori solidi (vedere la tabella supplementari 1 per dell'elenco completo dei geni). Il protocollo wet-bench e le fasi di analisi dei dati sono stati rigorosamente convalidati in un laboratorio certificato CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-05-01-13</td>
			<td>Used for TNA dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>Used in library pooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent Reservoir with divider</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9173-2000</td>
			<td>For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9700</td>
			<td>Plate used for thermocycler steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Used in purification after several assay steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Formapure Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A33343</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AB0005</td>
			<td>This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block, 96-well</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A7079</td>
			<td>Used for keeping samples chilled at various steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Used for bead washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification for Illumina Internal Control Standard</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4906</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4973</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Standards</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4903</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet Plate, 96-well (N38 grade)</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td>Used in bead purificiation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBC Adapters Set B</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AK0016-48</td>
			<td>Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td>Used for spinning down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4483485</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microamp Optical Film Compression Pad</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4312639</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plate Spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>MPS-1000</td>
			<td>Used for collecing liquid at bottom of plate wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>Contains components necessary for a MiSeq sequencing run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeqDx System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>NGS Sequencing Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 9700 Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for several steps during assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9938</td>
			<td>Used as general diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical ABI 96-well PCR plate covers</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Workstation Model 600</td>
			<td>Air Clean Systems</td>
			<td>BZ10119636</td>
			<td>Wet-bench assay steps performed in this &#39;dead air box&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1019499</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>LSA28139</td>
			<td>qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Use for determing RNA concentration in TNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-402-178</td>
			<td>Used for general RNase decontamination of work areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>0710-0129</td>
			<td>Used as the assay positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Used in clean-up steps and for sequencing setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td>Component of PreSeq QC Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>Used for reagent and sample mixing etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template RT PCR film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-7800</td>
			<td>Used for covering 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom 96-well Microplate</td>
			<td>LSP</td>
			<td>MP8117-R</td>
			<td>Used during bead purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing

Le fusioni geniche spesso contribuiscono al fenotipo oncogenico di molti tipi diversi di cancro. Inoltre, la presenza di alcune fusioni in campioni di pazienti oncologici spesso influenza direttamente la diagnosi, la prognosi e/o la selezione della terapia. Di conseguenza, l'accurata rilevazione delle fusioni geniche è diventata una componente critica della gestione clinica per molti tipi di malattie. Fino a poco tempo fa, la rilevazione clinica della fusione genica era effettuata prevalentemente attraverso l'uso di saggi unigene. Tuttavia, l'elenco in continua crescita delle fusioni geniche con significato clinico ha creato la necessità di valutare contemporaneamente lo stato di fusione di più geni. I test basati sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno soddisfatto questa domanda attraverso la capacità di sequenziare l'acido nucleico in modo massicciamente parallelo. Sono ora disponibili per l'uso nella diagnostica molecolare clinica, ognuno con i propri punti di forza e di debolezza, che utilizzano diverse strategie per l'arricchimento dei bersagli genici. Questo articolo descrive l'uso dell'arricchimento del bersaglio e della preparazione della biblioteca basati su PCR (AMP) ancorato seguito da NGS per valutare le fusioni geniche nei campioni clinici del tumore solido. AMP è unico tra gli approcci di arricchimento basati sull'amplicon in quanto identifica le fusioni geniche indipendentemente dall'identità del partner di fusione. Di seguito sono riportate sia le fasi di analisi della panca umida che quelli che garantiscono un rilevamento accurato della fusione genica da campioni clinici.

Illustrato Figura 3, Figura 4 e Figura 5 sono screenshot dall'interfaccia utente di analisi che dimostra i risultati di un esempio di adenocarcinoma polmonare. Nella figura 3, viene visualizzato il riepilogo dell'esempio (in alto) che elenca le cosiddette fusioni di prove complesse, nonché lo stato QC (cerchiato in rosso). La fusione ADCK4-NUMBL (di cui sono elencati 3 isoformi) viene immediat...

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Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Questo articolo descrive in dettaglio l'uso di un kit di preparazione della libreria a catena di reazione a catena multiplea Vengono descritte entrambe le fasi di analisi wet-bench e dei dati.

Rilevamento oncogenico della fusione genica utilizzando la reazione della catena di polimerasi multiplex ancorata seguita dal sequenziamento di nuova generazione

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Questo protocollo viene utilizzato per il rilevamento di fusioni geniche informativo critico per campioni di tumore del paziente. Lo stato di fusione di dozzine di geni viene valutato simultaneamente in un unico saggio. Il vantaggio di questa tecnica è che posso identificare le fusioni geniche indipendentemente dall'identità del partner di fusione da campioni di tumore che sono stati elaborati per fissazione formulativa.L'individuazione di una certa fusione genica nel campione di tumore clinico informa direttamente la diagnosi, la prognosi e la selezione del trattamento in molti tipi di cancro. È fondamentale capire che molte fusioni chiamate dall'algoritmo di analisi sono artefatti. Il compito più difficile quando si analizzano i dati è distinguere tra chiamate artefatto e fusione reale.Inizia diluire l'acido nucleico totale per ottenere la concentrazione desiderata di RNA. Per ogni campione, trasferire 20 microlitri della diluizione nei tubi casuali del reagente di adescamento in un blocco di alluminio pre-refrigerato e mescolare tubazione su e giù da sei a otto volte. Far girare brevemente i campioni, trasferire l'intero volume su una piastra PCR da 96 po 'e sigillare con pellicola di sigillare a piastre.Inserire la piastra in un termociclo, coprire con il pad di compressione e chiudere il coperchio. Incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, trasferire l'intero volume del prodotto di adescamento casuale nei primi tubi del nastro del reagente del filo.Mescolare pipettando su e giù e girare brevemente verso il basso. Trasferire l'intero volume su una piastra PCR da 96 po' e sigillare con pellicola RT. Inserire la lastra nel termociclo e eseguire la reazione in base alle indicazioni del manoscritto.Eseguire la sintesi del cDNA del secondo filamento, la riparazione e la legatura passo uno in base alle direzioni del manoscritto e procedere alla seconda fase di legazione. Per numerare il codice a barre molecolare o i tubi a nastro adattatore MBC, posizionare i tubi orizzontalmente con cerniere sul retro e utilizzare un marcatore permanente. Prendere la piastra di purificazione del tallone dal primo passaggio di legatura e trasferire 40 microlitri di ciascun campione nei tubi del nastro adattatore MBC, facendo attenzione a non disturbare il pellet di perline.Mescolare i reagenti pipettando, far girare i tubi e trasferire l'intero volume al passaggio di legatura due tubi a nastro reagente. Mescolare i campioni, farli girare verso il basso e posizionarli in un blocco termociclo. Lasciare il coperchio riscaldato spento e eseguire il termociclo a 22 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da 4 gradi Celsius tenere.Successivamente, preparare le perline di pulizia della legatura vortice e aggiungendo 50 microlitri a un nuovo set di tubi a strisce PCR. Incubare sul magnete per un minuto e scartare il supernatante. Rimuovere i tubi del nastro dal magnete e riprestare le perline in 50 microlitri di tampone di pulizia della legatura pipettando su e giù.Trasferire l'intero volume del campione dalla seconda fase di legatura nella striscia di perline di pulizia della legatura. Vortice i campioni da mescolare e lasciarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Vortice il campione una volta a metà dell'incubazione.Successivamente, vortice i campioni, farli girare verso il basso e incubare sul magnete per un minuto. Scartare il supernatante e aggiungere 200 microlitri di tampone di pulizia della legatura fresca. Vortice per rimorsi, girare verso il basso e posizionare sul magnete per un minuto.Dopo i due lavaggi, eseguire un terzo lavaggio utilizzando acqua ultrapura al posto del tampone. Rimostrare le perline in 20 microlitri di idrossido di sodio da 5 millimetri e trasferire i campioni su una piastra PCR da 96 po '. Posizionare la piastra in un termociclo con un pad di compressione e eseguirla a 75 gradi Celsius per 10 minuti, seguita da una tenuta di 4 gradi Celsius.Una volta che i campioni si sono raffreddati a 4 gradi Celsius, posizionare la piastra su un magnete per almeno tre minuti e procedere con la prima PCR. Preparare le reazioni PCR aggiungendo due microlitri di primer GSP1 a ciascun pozzo della prima striscia di reagente PCR. Trasferire 18 microlitri del secondo prodotto di pulizia della legatura sui primi tubi a nastro reagente PCR e mescolare tubazione su e giù.Far girare i campioni e trasferirli su una piastra PCR da 96 po'. Posizionarli nel termociclo e far funzionare la PCR secondo le indicazioni del manoscritto. Procedere con la purificazione delle perline aggiungendo 20 microlitri del prodotto PCR a una piastra inferiore a U riempita con 24 microlitri di perline di purificazione per pozzo.Pipettare su e giù per mescolare e lasciare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi incubare la piastra sul magnete per due minuti. Scartare il supernantante dalle perline e lavarlo due volte con 200 microlitri di 70% di etanolo. Dopo il lavaggio finale, rimuovere tutto l'etanolo e lasciare asciugare l'aria del campione per due minuti.Rimuovere la piastra dal magnete e rimescolare le perline in 24 microlitri di Tris-HCl da 10 millimetri e pH 8.0. Incubare il magnete per tre minuti e quindi riposizionare la piastra sul magnete per due minuti. Inizia la quantificazione della libreria preparando da una a cinque diluizioni del secondo prodotto PCR in Tris-HCl da 10 millimetri.Segui questo con una diluizione seriale di 1:199, 1:199 e 20:80 in Tris-HCl da 10 millimetri con 05% di polisorbato. Impostare la PCR chiave aggiungendo sei microlitri di master mix a ciascun pozzo di una piastra ottica da 96 poggia, seguiti da quattro microlitri della diluizione o dello standard appropriato. Ruotare la piastra e caricarla nello strumento qPCR.Eseguire qPCR secondo le indicazioni del manoscritto. Al termine della quantificazione della libreria, diluire tutte le librerie in due nanomolari con Tris-HCl da 10 millimetri. Crea un pool di biblioteche combinando 10 microlitri di ogni libreria normalizzata in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Successivamente, preparare la libreria di amplicon denaturati, o piscina DAL, combinando 10 microlitri della piscina della biblioteca con 10 microlitri di idrossido di sodio normale 0,2 e incubando la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 microlitri di Tris-HCl da 200 millimetri a pH 7.0, seguiti da 970 microlitri di HT1 Hybridization Buffer. Crea il tubo di carico finale combinando 300 microlitri di HT1, 25 microlitri di PhiX picomolare e 675 microlitri della piscina DAL.Aggiungere l'intero volume del tubo di carico al pozzo campione della cartuccia del reagente del sequencer e caricare la cartuccia nel sequencer. Iniziare selezionando il campione di controllo positivo e assicurarsi che tutte le fusioni previste e le isoforme oncogeniche siano state rilevate e siano elencate nella scheda prove forti. Per ogni campione, esaminare il valore di controllo medio univoco dei siti di avvio per GSP2, quindi visualizzare le letture di supporto per ogni potenziale fusione facendo clic sul collegamento Visualizza che porta l'utente a una visualizzazione JBrowse basata sul Web di pileup di singole letture di supporto per la fusione.Conferma che le letture sono per lo più libere da disallineamenti, ma più di 30 basi delle letture si allineano con il partner di fusione, e che le sequenze adiacenti al punto di rottura tra i geni e i siti di legame primer sono libere da inserimenti o eliminazioni. È fondamentale garantire che ogni fusione di chiamata sia generalmente priva di disallineamento e che una parte significativa delle letture si allinei al partner di fusione. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare lo stato di fusione genica in un campione di adenocarcinoma polmonare.Il riepilogo mostra forti fusioni di prove e la pagina Leggi statistiche mostra le metriche dell'esempio. Questo campione mostra una buona qualità dell'RNA, quindi i risultati negativi sarebbero riportati se non fossero state trovate fusioni. Una chiamata di fusione legittima ha un numero elevato di letture di supporto, un'alta percentuale di letture dal primer che supporta la fusione e un numero elevato di siti di avvio.La visualizzazione delle letture dimostra un buon allineamento alle grandi aree del partner di fusione. Al contrario, una chiamata di fusione artefatto ha metriche di supporto inferiori e un alto tasso di errore durante il mapping al partner. Le chiamate di fusione artefatto effettuate dall'algoritmo di analisi sono comuni.È fondamentale ispezionare manualmente ogni chiamata per assicurarsi che rappresenti una vera fusione genica nel campione del paziente.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Mappatura delle relazioni struttura-funzione dei fattori di trascrizione oncogenica disordinati utilizzando l'analisi trascrittomica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Profilazione spaziale dell'espressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...