Name: oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00
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この研究は、コロラド大学の分子病理学共有リソース(国立がん研究所がんセンター支援助成金第1号)によって支援されました。P30-CA046934)とコロラド州パーソナライズド医療センターによって。

1. 図書館の準備と順序付け
<ol><li>一般的なアッセイに関する考慮事項と事前アッセイ手順
	<ol>
<li>アッセイランは、通常、7つの臨床サンプルと1つの陽性対照で構成されています(ただし、ライブラリ調製実行あたりのサンプル数は必要に応じて調整できます)。製造業者によって確認された、または直交的方法論によって確認された少なくともいくつかの遺伝子融合(アッセイタ?...

<ol>
	<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li><li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer.">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer.">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li><li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children.">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li><li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma.">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li><li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing's+sarcoma.">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li><li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion.">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute.">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li><li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer.">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li><li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK)+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment.">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li><li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry.">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li><li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions.">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples.">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li><li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors.">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing.">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li><li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion.">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li><li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches.">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).</li><li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions.">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li><li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation:+Report+of+10+Cases.">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li><li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li></ol>

アンカー多重PCRベースの標的濃縮およびライブラリー調製に続いて次世代シーケンシングは、臨床腫瘍サンプルにおける多重遺伝子融合評価に適しています。ゲノムDNAではなくRNA入力に焦点を当てることで、大きく反復的なイントロンを配列する必要性が回避されます。さらに、このアプローチは、融合パートナーの同一性にかかわらず遺伝子融合を増幅するため、新規の融合が検出される?...

2つ以上の遺伝子を単一の転写実体に融合させるのは、欠損、複製、挿入、反転、転座を含む大規模な染色体変動の結果として起こり得る。これらの融合遺伝子は、発現した遺伝子産物の転写制御および/または改変された機能特性を通じて、癌細胞1に発癌特性を付与することができる。多くの場合、融合遺伝子は、細胞増殖および生存経路を直接活性化することによって、主要な発癌因子として作用することが知られている。
がん患者に対する遺伝子融合の臨床的関連性は、フィラデルフィア染色体およびそれに対応するBCR-ABL1融合遺伝子の慢性骨髄性白血病(CML)2の発見によって最初に明らかになった。この融合遺伝子を特異的に標的とする低分子阻害剤イマチニブメシレートを開発し、BCR-ABL1-陽性CML患者3において顕著な有効性を実証した。 腫瘍遺伝子融合の治療的ターゲティングは固形腫瘍においても成功しており、非小細胞肺癌におけるALKおよびROS1融合遺伝子の阻害が主な例として役立つ4、5。最近、NTRK阻害剤ラロトレクチニブは、疾患部位6にかかわらず、NTRK1/2/3融合陽性固形腫瘍に対してFDA承認された。 治療の選択を超えて、遺伝子融合検出は疾患診断および予後にも役割を持つ。これは、特定の融合の存在によって診断的に定義される様々な肉腫および血液悪性腫瘍のサブタイプおよび/または融合の存在が予後を直接知らせる7,8で特に一般的である。,9,10歳,11.これらは、がん患者に対する遺伝子融合検出の臨床応用例のほんの一部にすぎない。
臨床意思決定において重要な役割を果たしているため、臨床サンプルからの正確な遺伝子融合検出は極めて重要です。細胞遺伝学的手法、逆転写性ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、現場ハイブリダイゼーションにおける蛍光(FISH)を含む融合または染色体再配置分析のための臨床検査室で多数の技術が適用されている。免疫組織化学(IHC)、および5'/3'発現不均衡分析(とりわけ)12、13、14、15。現在、がんにおけるアクション可能な遺伝子融合のリストが急速に拡大している結果、複数の遺伝子の融合状態を同時に評価する必要が出てきました。その結果、一度に1つまたは少数の遺伝子しか照会できない伝統的な技術の中には、特に臨床腫瘍サンプルが非常に有限であり、複数のアッセイに分けられることが多いと考えると、非効率的なアプローチになりつつあります。しかし、次世代シーケンシング(NGS)は、多遺伝子検査に適した解析プラットフォームであり、NGSベースのアッセイは臨床分子診断ラボで一般的になっています。
現在使用されている核融合/再配置検出に使用されるNGSアッセイは、使用される入力材料、ライブラリー調製および標的濃縮に使用される化学物質、およびアッセイ内で照会された遺伝子の数に関して異なります。NGSアッセイは、試料から抽出されたRNAまたはDNA(またはその両方)に基づいていることができる。RNAベースの分析は、高度に分解されたRNAを含む臨床サンプルの傾向によって妨げられますが、DNAベースの融合試験の標的であるが、NGSでは困難であることが証明されている大規模で頻繁に反復的なイントロンを配列する必要性を回避します。データ分析16.RNAベースのNGSアッセイの標的濃縮戦略は、主にハイブリッド捕捉またはアンプリコン媒介アプローチに分けられます。両方の戦略は融合検出にうまく利用されていますが、それぞれが他の17、18に対する利点を含んでいます。ハイブリッドキャプチャアッセイは、一般的に、より複雑なライブラリと減少したアリルドロップアウトをもたらすのに対し、アンプリコンベースのアッセイは一般的に低い入力を必要とし、オフターゲットシーケンシング19の結果が少ない。しかし、おそらく、従来のアンプリコンベースの濃縮の主な制限は、すべての既知の融合パートナーへのプライマーの必要性です。多くの臨床的に重要な遺伝子が数十の異なるパートナーと融合することが知られており、たとえプリマー設計がすべての既知のパートナーの検出を可能にしたとしても、新しい融合事象は検出されないままであるので、これは問題となる。アンカー多重 PCR (または短い場合は AMP) と呼ばれる最近説明された手法は、この制限20に対処します。AMP では、入力 RNA から派生した cDNA フラグメントに「半機能」NGS アダプターがリゲーションされます。標的濃縮は、遺伝子特異的プライマーとアダプターへのプライマーとの間の増幅によって達成される。その結果、目的の遺伝子に対するすべての融合は、たとえ新しい融合パートナーが関与していても、検出されるべきである(図1参照)。この記事では、固形腫瘍サンプルにおける発因性遺伝子融合の検出にAMPを採用したNGSベースのアッセイであるArcherDx FusionPlex固形腫瘍キットの使用について説明します(補足表1参照)完全な遺伝子リスト)。ウェットベンチプロトコルとデータ分析手順は、臨床検査改善修正(CLIA)認定ラボで厳密に検証されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-05-01-13</td>
			<td>Used for TNA dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>Used in library pooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent Reservoir with divider</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9173-2000</td>
			<td>For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9700</td>
			<td>Plate used for thermocycler steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Used in purification after several assay steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Formapure Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A33343</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AB0005</td>
			<td>This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block, 96-well</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A7079</td>
			<td>Used for keeping samples chilled at various steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Used for bead washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification for Illumina Internal Control Standard</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4906</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4973</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Standards</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4903</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet Plate, 96-well (N38 grade)</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td>Used in bead purificiation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBC Adapters Set B</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AK0016-48</td>
			<td>Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td>Used for spinning down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4483485</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microamp Optical Film Compression Pad</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4312639</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plate Spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>MPS-1000</td>
			<td>Used for collecing liquid at bottom of plate wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>Contains components necessary for a MiSeq sequencing run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeqDx System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>NGS Sequencing Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 9700 Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for several steps during assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9938</td>
			<td>Used as general diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical ABI 96-well PCR plate covers</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Workstation Model 600</td>
			<td>Air Clean Systems</td>
			<td>BZ10119636</td>
			<td>Wet-bench assay steps performed in this &#39;dead air box&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1019499</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>LSA28139</td>
			<td>qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Use for determing RNA concentration in TNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-402-178</td>
			<td>Used for general RNase decontamination of work areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>0710-0129</td>
			<td>Used as the assay positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Used in clean-up steps and for sequencing setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td>Component of PreSeq QC Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>Used for reagent and sample mixing etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template RT PCR film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-7800</td>
			<td>Used for covering 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom 96-well Microplate</td>
			<td>LSP</td>
			<td>MP8117-R</td>
			<td>Used during bead purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing

遺伝子融合は、多くの異なるタイプの癌の発癌表現型にしばしば寄与する。さらに、癌患者からのサンプル中の特定の融合の存在は、多くの場合、診断、予後、および/または治療の選択に直接影響を与えます。その結果、遺伝子融合の正確な検出は、多くの疾患タイプの臨床管理の重要な構成要素となっています。最近まで、臨床遺伝子融合検出は、主に単一遺伝子アッセイの使用によって達成されました。しかし、臨床的意義を持つ遺伝子融合のリストが増え続けているために、複数の遺伝子の融合状態を同時に評価する必要性が生まれています。次世代シーケンシング(NGS)ベースのテストは、核酸を非常に平行な方法で配列する能力を通じて、この要求を満たしています。遺伝子標的濃縮に異なる戦略を採用した複数のNGSベースのアプローチが、それぞれ独自の長所と短所を持つ臨床分子診断で使用できるようになりました。本稿では、臨床固形腫瘍標本における遺伝子融合を評価するためにNGSに続くアンカー多重PCR(AMP)ベースの標的濃縮およびライブラリー調製の使用について説明する。AMPは、アンプリコンベースの濃縮アプローチの中でも、融合パートナーのアイデンティティにかかわらず遺伝子融合を識別するというユニークなアプローチです。ここでは、臨床サンプルからの正確な遺伝子融合検出を保証するウェットベンチとデータ解析の両方の手順を詳しく説明します。

図3、図4および図5に示すのは、肺腺癌サンプルからの結果を示す分析ユーザーインターフェースからのスクリーンショットである。図 3では、サンプルサマリーが示され(上)、いわゆる強い証拠融合と QC ステータス (赤で囲まれた) が表示されます。ADCK4-NUMBL融合(そのうち3つのアイソフォームがリ...

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Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

この記事では、アンカーされた多重ポリメラーゼ連鎖反応ベースのライブラリー調製キットの使用について詳しく述べたり、臨床固形腫瘍サンプルにおける発生遺伝子融合を評価するための次世代シーケンシングが続きます。ウェットベンチとデータ分析の両方の手順について説明します。

アンカー多重ポリメラーゼ連鎖反応を用いた腫瘍性遺伝子融合検出、次世代シーケンシング

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

このプロトコルは、患者の腫瘍サンプルに関する重要な有益な遺伝子融合の検出に使用されます。数十個の遺伝子の融合状態を、1回のアッセイで同時に評価します。この技術の利点は、製剤固定によって処理された腫瘍サンプルから融合パートナーの同一性に関係なく遺伝子融合を同定できることである。臨床腫瘍サンプルにおける特定の遺伝子融合の検出は、多くの癌タイプにおける診断、予後および治療選択を直接知らせる。解析アルゴリズムによって呼び出される多くの融合がアーティファクトであることを理解することが重要です。データを分析する際の最も困難なタスクは、アーティファクトと実際のフュージョン呼び出しを区別することです。まず、全核酸を希釈して、所望のRNA濃度を達成します。各サンプルに対して、希釈液の20マイクロリットルを、冷やされたアルミニウムブロック内のランダムプライミング試薬ストリップチューブに移し、6〜8回上下にピペットで混合します。サンプルを簡単にスピンダウンし、ボリューム全体を96ウェルPCRプレートに移し、プレートシーラーフィルムでシールします。プレートをサーモサイクラーに挿入し、圧縮パッドで覆い、蓋を閉めます。摂氏65度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、ランダムプライミング製品の全容を第1ストランド試薬ストリップチューブに移す。上下にピペットを入れ、短時間スピンダウンして混ぜます。96ウェルPCRプレートに全ボリュームを移し、RTフィルムでシールします。プレートをサーモサイクラーに挿入し、原稿の指示に従って反応を実行します。第2鎖cDNA合成を行い、修復し、原稿の方向に従って第1のライゲーションステップを行い、第2のライゲーションステップに進む。分子バーコードまたはMBCアダプタストリップチューブに番号を付けるには、チューブをヒンジを背部に水平に配置し、永久マーカーを使用します。第1のライゲーションステップからビーズ精製プレートを取り、各サンプルの40マイクロリットルをMBCアダプターストリップチューブに移し、ビーズペレットを乱さないよう注意してください。ピペットで試薬を混合し、チューブをスピンダウンし、リゲーションステップ2試薬ストリップチューブに全容を移します。サンプルを混ぜて回転させ、サーモサイクラーブロックに入れます。加熱した蓋を外し、サーモサイクラーを摂氏22度で5分間走らせ、続いて摂氏4度のホールドを実行します。次に、それらをボルテックスし、PCRストリップチューブの新しいセットに50マイクロリットルを追加することによって、ライゲーションクリーンアップビーズを準備します。磁石を1分間インキュベートし、上清を捨てます。磁石からストリップチューブを取り出し、上下にピペット処理して50マイクロリットルのライゲーションクリーンアップバッファでビーズを再懸濁します。第2のライゲーションステップから、サンプル全体をライゲーションクリーンアップビードストリップに移します。混合し、10分間室温でそれらを残すためにサンプルを渦。インキュベーションの途中でサンプルを一度渦を出す。その後、サンプルを渦を出し、それらを回転させ、磁石で1分間インキュベートします。上清を捨て、200マイクロリットルの新鮮なライゲーションクリーンアップバッファーを追加します。渦は再中断し、スピンダウンし、磁石の上に1分間置きます。2回の洗浄後、緩衝液の代わりに超純水を用いて3回目の洗浄を行う。ビーズを20マイクロリットルの5ミリメートルの水酸化ナトリウムに再懸濁し、サンプルを96ウェルPCRプレートに移します。プレートを圧縮パッド付きのサーモサイクラーに入れ、摂氏75度で10分間実行し、続いて摂氏4度のホールドを実行します。サンプルが摂氏4度まで冷却されたら、プレートを磁石の上に3分以上置き、最初のPCRに進みます。最初のPCR試薬ストリップの各ウェルにGSP1プライマーを2マイクロリットル加えてPCR反応を準備します。第2のライゲーション・クリーンアップ製品の18マイクロリットルを第1のPCR試薬ストリップチューブに移し、上下にピペットを入れ、混合します。サンプルをスピンダウンし、96ウェルPCRプレートに移します。サーモサイクラーに入れ、原稿の指示に従ってPCRを実行します。20マイクロリットルのPCR製品を、1ウェルあたり24マイクロリットルの精製ビーズで充填したU-底板に添加することにより、ビーズ精製を進めます。ピペットを上下に混ぜ、プレートを室温で5分間放置し、マグネットのプレートを2分間インキュベートします。ビーズからスーパーナントを捨て、200マイクロリットルの70%エタノールで2回洗浄します。最後の洗浄後、エタノールをすべて取り除き、サンプルを2分間乾燥させます。磁石からプレートを取り出し、10ミリトリスHClとpH 8.0の24マイクロリットルでビーズを再懸濁します。磁石を3分間インキュベートし、プレートを磁石に2分間戻します。2番目のPCR産物の1~5個の希釈液を10ミリメートルTris-HClで調製して、ライブラリ定量を開始します。10ミリメートルのトリス-HClで1:199、1:199、および20:80の連続希釈でこれに従ってください。光学96ウェルプレートの各ウェルに6マイクロリットルのマスターミックスを加え、その後に適切な希釈または標準の4マイクロリットルを加えることによって、キーPCRを設定します。プレートを回転させ、qPCR装置にロードします。原稿の指示に従ってqPCRを行います。ライブラリの定量が完了したら、すべてのライブラリを10ミリメートルTris-HClで2ナノモルに希釈します。1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに各正規化されたライブラリの10マイクロリットルを組み合わせることによって、ライブラリプールを作ります。次に、変性アンプリコンライブラリ、またはDALプールを、10マイクロリットルのライブラリプールと10マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウムを組み合わせ、室温で5分間混合物をインキュベートして調製する。インキュベーション後、pH 7.0で200ミリトリス-HClの10マイクロリットルを加えて、HT1ハイブリダイゼーションバッファーの970マイクロリットルを加えます。300マイクロリットルのHT1、20ピコモルPhiXの25マイクロリットル、DALプール675マイクロリットルを組み合わせて、最終的なロードチューブを作ります。シーケンサー試薬カートリッジのサンプルウェルにロードチューブの全容を加え、シーケンサーにカートリッジを積み込みます。陽性対照サンプルを選択して開始し、期待される融合と発がんアイソフォームがすべて検出され、強力な証拠タブにリストされていることを確認します。各サンプルについて、GSP2 コントロール値ごとの平均一意の開始サイトを調べ、各潜在的な融合のサポートリードを視覚化するリンクをクリックして、個々の融合をサポートする個々の融合の積み重ねの Web ベースの JBrowse ビューに移動します。読み取りはほとんど不一致が含まれ、読み取りの 30 塩基以上が融合パートナーと一致していること、および遺伝子とプライマー結合部位の間のブレークポイントに隣接する配列が挿入または欠損を含まないことを確認します。すべての呼び出しフュージョンは、一般的にミスアライメントがなく、読み取りのかなりの部分がフュージョンパートナーに合致するようにすることが重要です。このプロトコルは、肺腺癌サンプルにおける遺伝子融合状態を調べるのに用いられてきた。サマリーは強力なエビデンスの融合を示し、統計の読み取りページにはサンプルのメトリックが表示されます。このサンプルは良好なRNA品質を示すため、融合が見つからなかった場合に否定的な結果が報告されます。正当な融合呼び出しには、サポートする読み取り数が多く、融合をサポートするプライマーからの読み取りの割合が高く、開始サイトの数が多い。読み取りの視覚化は、融合パートナーの大きな領域に良好な位置合わせを示す。逆に、アーティフィファクトフュージョンコールは、パートナーにマッピングする際に、サポート指標が低く、高いエラー率を持っています。分析アルゴリズムによって行われた実際の融合呼び出しは一般的です。すべての呼び出しを手動で検査して、患者サンプル内の実際の遺伝子融合を表すことを確認することが重要です。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

液滴デジタルトラップ (ddTRAP): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...