Name: oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av molekylær patologi delt ressurs ved University of Colorado (National Cancer Institute kreft Center support Grant no. P30-CA046934) og av Colorado Center for personlig medisin.

1. biblioteks forberedelser og sekvenser
<ol><li>Generelle analysen betraktninger og pre-analysen trinn
	<ol>
<li>Analysen går vanligvis består av syv kliniske prøver og en positiv kontroll (selv om antall prøver per bibliotek forberedelse kjøre kan justeres etter behov). Bruk en positiv kontroll som inneholder minst flere gen fusjoner (som analysen mål) som har blitt bekreftet av en produsent og/eller har blitt bekreftet av en ortogonale metodikk. En ikke-mal kontroll (NTC) må inkluderes som en...

<ol>
	<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li><li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer.">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer.">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li><li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children.">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li><li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma.">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li><li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing's+sarcoma.">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li><li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion.">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute.">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li><li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer.">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li><li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK)+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment.">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li><li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry.">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li><li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions.">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples.">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li><li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors.">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing.">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li><li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion.">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li><li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches.">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).</li><li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions.">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li><li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation:+Report+of+10+Cases.">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li><li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li></ol>

Forankret multiplex PCR-basert mål berikelse og bibliotek forberedelse etterfulgt av neste generasjons sekvensering er godt egnet for multiplekset gen fusjon vurdering i kliniske tumor prøver. Ved å fokusere på RNA-input i stedet for genomisk DNA, unngås behovet for å sekvens store og repeterende introns. I tillegg, siden denne tilnærmingen forsterker genet fusjoner uavhengig av identiteten til Fusion partner, er romanen fusjoner oppdaget. Dette er en kritisk fordel i den kliniske riket, og det har vært mange eks...

Fusjonen av to eller flere gener i en enkelt transcriptional enhet kan forekomme som et resultat av stor skala kromosom variasjoner inkludert slettinger, duplikasjoner, innsettinger, inversions, og translokasjoner. Gjennom endrede transcriptional kontroll og/eller endrede funksjonelle egenskaper ved det uttrykte genet, kan disse fusjons genene tildele kreftfremkallende egenskaper til kreftceller1. I mange tilfeller er fusjons gener kjent for å fungere som primær kreftfremkallende sjåfører ved direkte aktivering av mobilnettet spredning og overlevelse trasé.
Den kliniske relevansen av gen fusjoner for kreftpasienter ble først klart med oppdagelsen av Philadelphia-kromosom og det korresponderende ABL1 Fusion- genet i Kronisk myelogen-LEUKEMI (KML)2. Den lille molekyl hemmer Imatinib mesylate ble utviklet for å spesifikt målrette dette fusjons genet og demonstrerte bemerkelsesverdig effekt i BCR-ABL1-positive KML-pasienter3. Terapeutisk målretting av kreftfremkallende Gene fusjoner har også vært vellykket i solide svulster, med hemming av ALK og ROS1 Fusion gener i ikke-liten celle lungekreft som primære eksempler4,5. Nylig var NTRK inhibitor larotrectinib FDA godkjent for NTRK1/2/3 Fusion-positive solide svulster, uavhengig av sykdom site6. Utover terapi valg, gen Fusion deteksjon har også roller i sykdoms diagnose og prognose. Dette er særlig utbredt i ulike sarkom og Hematologic kreft undergrupper som er diagnostisk definert av tilstedeværelsen av spesifikke fusjoner og/eller som tilstedeværelsen av en fusjon direkte informerer prognose7,8 , 9 andre priser , 10 andre , 11. Dette er bare noen eksempler på klinisk anvendelse av gen fusjon deteksjon for kreftpasienter.
På grunn av den kritiske rollen i klinisk beslutningstaking er nøyaktig gen fusjon deteksjon fra kliniske prøver av vital betydning. Tallrike teknikker har blitt brukt i kliniske laboratorier for fusjon eller kromosom omorganisering analyse inkludert: cytogenetisk teknikker, omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR), fluorescens in situ hybridisering (FISH), immunhistokjemi (IHC), og 5 '/3 ' uttrykk ubalanse analyse (blant andre)12,13,14,15. For tiden har den raskt voksende liste over nyttige gen fusjoner i kreft resulterte i behovet for å vurdere Fusion status for flere gener samtidig. Følgelig, noen tradisjonelle teknikker som bare kan søke en eller noen gener om gangen blir ineffektiv tilnærminger, spesielt når de vurderer at kliniske tumor prøver er ofte svært begrenset og ikke mottagelig for å bli delt mellom flere analyser. Neste generasjons sekvensering (NGS) er imidlertid en analyseplattform som egner seg godt til testing av flere gener, og NGS-baserte analyser har blitt vanlig i kliniske molekylær diagnostiske laboratorier.
For tiden brukes NGS analyser for fusjon/omorganisering deteksjon varierer i forhold til input materialet som brukes, kjemikalier ansatt for biblioteket forberedelse og målet berikelse, og antall gener spørres i en analyse. NGS-analyser kan baseres på RNA eller DNA (eller begge) som utvinnes fra prøven. Selv om RNA-basert analyse er hemmet av tendensen til kliniske prøver til å inneholde svært degradert RNA, omgår det behovet for å sekvens store og ofte repeterende introns som er målene for DNA-basert fusjons testing, men har vist seg å være vanskelig for NGS dataanalyse16. Mål berikelse strategier for RNA-baserte NGS analyser kan i stor grad deles inn i hybrid fangst eller amplicon-mediert tilnærminger. Mens begge strategiene har blitt utnyttet for fusjon deteksjon, inneholder hver fordeler over den andre17,18. Hybrid fangst analyser generelt resultere i mer komplekse biblioteker og redusert allel frafall, mens amplicon-baserte analyser generelt krever lavere input og resultere i mindre off-mål sekvensering19. Men kanskje den primære begrensningen av tradisjonell amplicon berikelse er behovet for grunning til alle kjente Fusion partnere. Dette er problematisk siden mange klinisk viktige gener er kjent for å fusjonere med dusinvis av forskjellige partnere, og selv om primer design tillatt for påvisning av alle kjente partnere, ville romanen Fusion hendelser forbli uoppdaget. En nylig beskrevet teknikk betegnes forankret multiplex PCR (eller AMP for kort) adresser denne begrensningen20. I AMP er en "halv funksjonell" NGS-adapter ligaturer til cDNA-fragmenter som er avledet fra inn data RNA. Mål berikelse oppnås ved forsterkning mellom gen spesifikke primere og en primer til adapteren. Som et resultat, alle fusjoner til gener av interesse, selv om en roman Fusion partner er involvert, bør oppdages (se figur 1). Denne artikkelen beskriver bruken av ArcherDx FusionPlex solid tumor Kit, en NGS-basert analysen som sysselsetter AMP for målet berikelse og bibliotek forberedelse, for påvisning av kreftfremkallende gen fusjoner i solide tumor prøver (se supplerende tabell 1 for fullstendig gen liste). Den våte-benk protokoll og dataanalyse trinnene har blitt grundig validert i et klinisk laboratorium Improvement endringer (CLIA)-sertifisert laboratorium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-05-01-13</td>
			<td>Used for TNA dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>Used in library pooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent Reservoir with divider</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9173-2000</td>
			<td>For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9700</td>
			<td>Plate used for thermocycler steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Used in purification after several assay steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Formapure Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A33343</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AB0005</td>
			<td>This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block, 96-well</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A7079</td>
			<td>Used for keeping samples chilled at various steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Used for bead washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification for Illumina Internal Control Standard</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4906</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4973</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Standards</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4903</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet Plate, 96-well (N38 grade)</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td>Used in bead purificiation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBC Adapters Set B</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AK0016-48</td>
			<td>Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td>Used for spinning down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4483485</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microamp Optical Film Compression Pad</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4312639</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plate Spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>MPS-1000</td>
			<td>Used for collecing liquid at bottom of plate wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>Contains components necessary for a MiSeq sequencing run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeqDx System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>NGS Sequencing Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 9700 Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for several steps during assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9938</td>
			<td>Used as general diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical ABI 96-well PCR plate covers</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Workstation Model 600</td>
			<td>Air Clean Systems</td>
			<td>BZ10119636</td>
			<td>Wet-bench assay steps performed in this &#39;dead air box&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1019499</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>LSA28139</td>
			<td>qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Use for determing RNA concentration in TNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-402-178</td>
			<td>Used for general RNase decontamination of work areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>0710-0129</td>
			<td>Used as the assay positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Used in clean-up steps and for sequencing setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td>Component of PreSeq QC Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>Used for reagent and sample mixing etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template RT PCR film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-7800</td>
			<td>Used for covering 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom 96-well Microplate</td>
			<td>LSP</td>
			<td>MP8117-R</td>
			<td>Used during bead purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing

Gene fusjoner ofte bidra til kreftfremkallende fenotype av mange ulike typer kreft. I tillegg, tilstedeværelsen av visse fusjoner i prøver fra kreftpasienter ofte direkte påvirker diagnose, prognose, og/eller terapi valg. Som følge av det har den nøyaktige oppdagelsen av gen fusjoner blitt en kritisk komponent i klinisk ledelse for mange sykdomstyper. Inntil nylig, klinisk gen fusjon deteksjon ble overveiende gjennomført gjennom bruk av enkelt-genet analyser. Den stadig voksende listen av gen-fusjoner med klinisk betydning har imidlertid skapt et behov for å vurdere fusjons status for flere gener samtidig. Neste generasjons sekvensering (NGS)-basert testing har møtt denne etterspørselen gjennom evnen til å sekvens nukleinsyre syre i massivt parallell måte. Flere NGS-baserte tilnærminger som benytter ulike strategier for gen mål berikelse er nå tilgjengelig for bruk i klinisk molekylær diagnostikk, hver med sine egne styrker og svakheter. Denne artikkelen beskriver bruken av forankret multiplex PCR (AMP)-basert mål berikelse og bibliotek forberedelse etterfulgt av NGS å vurdere for gen fusjoner i kliniske solide tumor prøver. AMP er unik blant amplicon-baserte berikelse tilnærminger i at den identifiserer genet fusjoner uavhengig av identiteten til Fusion partner. Detaljert her er både våt-benk og dataanalyse trinn som sikrer nøyaktig gen fusjon deteksjon fra kliniske prøver.

Vist i Figur 3, Figur 4 og figur 5 er screenshots fra analysen brukergrensesnittet demonstrere resultater fra en lunge adenokarsinom prøve. I Figur 3vises eksempel sammendraget (øverst) som viser de kalte sterke bevis fusjoner, i tillegg til QC-statusen (sirkel i rødt). Den ADCK4-NUMBL Fusion (hvorav 3 isoformene er oppført) er umiddelbart ignorert fordi det er en vedvarende transcriptional...

Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Denne artikkelen detaljer bruk av en forankret multiplex polymerase kjede reaksjon-basert bibliotek forberedelse Kit etterfulgt av neste generasjons sekvensering å vurdere for kreftfremkallende gen fusjoner i kliniske solide tumor prøver. Fremgangsmåten for både våt benk og dataanalyse beskrives.

Kreftfremkallende Gene Fusion Detection bruke forankret multiplex polymerase Kjedere reaksjon etterfulgt av neste generasjon sekvensering

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Denne protokollen brukes til påvisning av kritisk informative genfusjoner for pasientsvulstprøver. Fusjonsstatusen til dusinvis av gener vurderes samtidig i en enkelt analyse. Fordelen med denne teknikken er at jeg kan identifisere genfusjoner uavhengig av identiteten til fusjonspartneren fra tumorprøver som har blitt behandlet ved formulering.Påvisning av visse genfusjon i klinisk tumorprøve informerer direkte diagnose, prognose og behandlingsvalg i mange krefttyper. Det er viktig å forstå at mange fusjoner kalt av analysealgoritmen er artefakter. Den vanskeligste oppgaven når du analyserer data, skiller mellom artefakt og ekte fusjonssamtaler.Begynn med å fortynne total nukleinsyre for å oppnå ønsket konsentrasjon av RNA. For hver prøve, overfør 20 mikroliter av fortynningen til tilfeldige grunning reagens stripe rør i en pre-kjølt aluminiumblokk og bland ved å pipettering opp og ned seks til åtte ganger. Spinn kort ned prøvene, overfør hele volumet til en 96-brønns PCR-plate, og forsegle med platetetningsfilm.Sett platen inn i en termocycler, dekk med kompresjonsputen og lukk lokket. Inkuber ved 65 grader Celsius i fem minutter. Etter inkubasjonen, overfør hele volumet av det tilfeldige primingproduktet i de første trådreagensstriperørene.Bland ved å pipetter opp og ned og kort spinne ned. Overfør hele volumet til en 96-brønns PCR-plate og forsegle med RT-film. Sett platen inn i termocycleren og kjør reaksjonen i henhold til manuskriptets retninger.Utfør andre tråd cDNA syntese, og reparasjon, og ligation trinn en i henhold til manuskriptet retninger og gå videre til den andre ligation trinn. Hvis du vil nummerere den molekylære strekkoden eller MBC-adapterstriperørene, plasserer du rørene horisontalt med hengsler på baksiden og bruker en permanent markør. Ta perlerenseplaten fra det første ligation trinnet og overfør 40 mikroliter av hver prøve til MBC adapter stripe rør, ta vare på ikke å forstyrre perlepellet.Bland reagensene ved å pipettering, spinne ned rørene og overfør hele volumet til ligation trinn to reagensstriperør. Bland prøvene, spinn dem ned og legg dem i en termocyclerblokk. La det oppvarmede lokket være av og kjør termocycleren ved 22 grader Celsius i fem minutter, etterfulgt av 4 grader Celsius hold.Deretter forbereder du ligation opprydding perler ved å virvle dem og legge til 50 mikroliter til et nytt sett med PCR stripe rør. Inkuber på magneten i ett minutt og kast supernatanten. Fjern striperørene fra magneten og gjenoppuss perlene i 50 mikroliter ligation opprydding buffer ved å pipetter opp og ned.Overfør hele prøvevolumet fra det andre ligation trinnet inn i ligation opprydding perle stripe. Vortex prøvene for å blande og la dem stå ved romtemperatur i 10 minutter. Vortex prøven en gang halvveis gjennom inkubasjonen.Etterpå virvler prøvene, spinner dem ned og inkuberer på magneten i ett minutt. Kast det overnaturlige og tilsett 200 mikroliter friskt ligation oppryddingsbuffer. Vortex å gjenbruke, spinne ned, og plassere på magneten i ett minutt.Etter de to vaskene, utfør en tredje vask med ultrarent vann i stedet for buffer. Resuspend perlene i 20 mikroliter på 5 millimeter natriumhydroksid og overfør prøvene til en 96-brønns PCR-plate. Plasser platen i en termocycler med en kompresjonspute og kjør den på 75 grader Celsius i 10 minutter, etterfulgt av en 4 grader Celsius hold.Når prøvene er avkjølt til 4 grader Celsius, plasser platen på en magnet i minst tre minutter og fortsett med den første PCR. Forbered PCR-reaksjonene ved å legge til to mikroliter GSP1-primere på hver brønn av den første PCR-reagensstripen. Overfør 18 mikroliter av det andre ligationoppryddingsproduktet til de første PCR-reagensstriperørene og bland ved å pipetter opp og ned.Spinn ned prøvene og overfør dem til en 96-brønns PCR-plate. Plasser dem i termocycleren og kjør PCR i henhold til manuskriptets retninger. Fortsett med perlerensing ved å legge til 20 mikroliter av PCR-produktet til en U-bunnplate fylt med 24 mikroliter renseperler per brønn.Pipetten opp og ned for å blande og la platen stå ved romtemperatur i fem minutter, og inkuber deretter platen på magneten i to minutter. Kast supernantanten fra perlene og vask dem to ganger med 200 mikroliter på 70% etanol. Etter den endelige vasken, fjern alt etanol og la prøven tørke i to minutter.Fjern platen fra magneten og resuspend perlene i 24 mikroliter på 10 millimeter Tris-HCl og pH 8.0. Inkuber av magneten i tre minutter og plasser deretter platen tilbake på magneten i to minutter. Begynn biblioteksmengden ved å forberede én til fem fortynninger av det andre PCR-produktet i 10 millimeter Tris-HCl.Følg dette med en seriell fortynning på 1:199, 1:199 og 20:80 i 10 millimeter Tris-HCl med 05% polysorbat. Sett opp nøkkel-PCR ved å legge til seks mikroliter master mix til hver brønn av en optisk 96-brønnsplate, etterfulgt av fire mikroliter av riktig fortynning eller standard. Spinn ned platen og legg den inn i qPCR-instrumentet.Utfør qPCR i henhold til manuskriptets retninger. Etter at bibliotekskvantifiseringen er fullført, fortynner alle bibliotekene til to nanomolar med 10 millimeter Tris-HCl. Lag et bibliotekbasseng ved å kombinere 10 mikroliter av hvert normaliserte bibliotek i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Deretter forbereder den denaturerte amplicon biblioteket, eller DAL pool, ved å kombinere 10 mikroliter av biblioteket bassenget med 10 mikroliter av 0,2 normal natriumhydroksid og inkubere blandingen i fem minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjonen legger du til 10 mikroliter på 200 millimeter Tris-HCl ved pH 7.0, etterfulgt av 970 mikroliter HT1 Hybridization Buffer. Lag det endelige lastrøret ved å kombinere 300 mikroliter HT1, 25 mikroliter på 20 picomolar PhiX og 675 mikroliter av DAL-bassenget.Tilsett hele volumet på lastrøret i prøvebrønnen til sequencerreagenskassetten, og legg sylinderampullen inn i sequenceren. Start med å velge den positive kontrollprøven og sørg for at alle forventede fusjoner og onkogene isoformer er oppdaget og er oppført i kategorien sterke bevis. For hvert eksempel inspiserer du den gjennomsnittlige unike startområdene per GSP2-kontrollverdi, og deretter visualiserer du støtteleserne for hver potensielle fusjon ved å klikke visualiseringskoblingen som tar brukeren til en nettbasert JBrowse-visning av hauger av individuelle fusjonsstøttelesere.Bekreft at lysene for det meste er fri for mismatch, men mer enn 30 baser av leserne samsvarer med fusjonspartneren, og at sekvenser ved siden av avbruddspunktet mellom genene og primerbindingsstedene er fri for innsettinger eller slettinger. Det er viktig å sikre at hver samtalefusjon generelt er fri for feiljustering, og at en betydelig del av lesingen er tilpasset fusjonspartneren. Denne protokollen har blitt brukt til å undersøke genfusjonsstatus i en lungeadenokarsinomprøve.Sammendraget viser sterke bevisfusjoner, og Les statistikk-siden viser beregninger av utvalget. Dette eksemplet viser god RNA-kvalitet, slik at negative resultater vil bli rapportert hvis ingen fusjoner ble funnet. En legitim fusjonssamtale har et høyt antall støttelesere, en høy prosentandel av lesingene fra primeren som støtter fusjonen, og et høyt antall startsider.Visualisering av lesingene viser god justering til store regioner av fusjonspartneren. Omvendt har et artefaktlig fusjonskall lavere støtteberegninger og en høy feilfrekvens når du tilordner til partneren. Artefaktlige fusjonssamtaler gjort av analysealgoritmen er vanlige.Det er viktig å inspisere hvert anrop manuelt for å sikre at det representerer en ekte genfusjon i pasientprøven.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Next Generation Sequencing for påvisning av Actionable mutasjoner i faste og flytende Svulster

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Påvisning av sjeldne mutasjoner i CtDNA med neste generasjons sekvensering

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Leter Driver veier av ervervet motstand mot målrettet terapi: resistente Subclone generasjon og følsomhet gjenoppretting av Gene sammenleggbare

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Bruker CRISPR/Cas9 Gene redigering for å undersøke kreftfremkallende aktiviteten av muterte Calreticulin i cytokin avhengige blodkreft cellene

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Dråpe Digital TRAP (ddTRAP): tilpasning av telomere gjenta forsterkning protokoll til dråpe Digital polymerase Kjedere reaksjon

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kartlegging av strukturfunksjonsrelasjoner av uordnede onkogene transkripsjonsfaktorer ved hjelp av transkripsjonsanalyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Romlig profilering av protein- og RNA-uttrykk i vev: En tilnærming til finjustering av virtuell mikrodisseksjon

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondrial cybrid generasjon ved hjelp av kreftcellelinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...