Name: oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Detta arbete stöddes av den molekylära patologi delade resursen vid University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center support Grant No. P30-CA046934) och Colorado Center för personlig medicin.

1. förberedelse av bibliotek och sekvensering
<ol><li>Allmänna assay överväganden och pre-assay steg
	<ol>
<li>Analyskörningar består vanligtvis av sju kliniska prover och en positiv kontroll (även om antalet prover per biblioteks förberedelse körning kan justeras vid behov). Använda en positiv kontroll som innehåller minst flera gen fusioner (att analysens mål) som har bekräftats av en tillverkare och/eller har bekräftats genom en ortogonal metod. En icke-mall kontroll (NTC) måste ingå...

<ol>
	<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li><li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer.">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer.">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li><li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children.">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li><li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma.">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li><li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing's+sarcoma.">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li><li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion.">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute.">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li><li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer.">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li><li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK)+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment.">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li><li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry.">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li><li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions.">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples.">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li><li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors.">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing.">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li><li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion.">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li><li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches.">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).</li><li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions.">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li><li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation:+Report+of+10+Cases.">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li><li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li></ol>

Förankrade Multiplex PCR-baserade mål berikning och bibliotek förberedelse följt av nästa generations sekvensering är väl lämpad för multiplexade Gene fusion bedömning i kliniska tumörprover. Genom att fokusera på RNA-indata i stället för genomiskt DNA undviks behovet av att sekvensera stora och repetitiva introner. Eftersom detta tillvägagångssätt förstärker gen fusioner oavsett identiteten hos fusions partnern upptäcks nya fusioner. Detta är en kritisk fördel i den kliniska sfären, och det har f?...

Fusion av två eller flera gener till en enda transkriptionell enhet kan inträffa som ett resultat av storskaliga kromosomala variationer inklusive borttagningar, dubbleringar, infogningar, inversioner och translokationer. Genom förändrad transkriptionell kontroll och/eller förändrade funktionella egenskaper hos den uttryckta genprodukten kan dessa fusions gener ge onkogena egenskaper till cancerceller1. I många fall är fusions gener kända för att fungera som primära onkogena förare genom att direkt aktivera cellulär proliferation och överlevnads vägar.
Den kliniska relevansen av gen fusioner för cancerpatienter blev först uppenbar med upptäckten av Philadelphia-kromosomen och motsvarande BCR-ABL1 fusions gen vid kronisk myelogen leukemi (KML)2. Den lilla molekyl hämmaren imatinib mesylate utvecklades för att specifikt rikta in sig på denna fusions gen och uppvisade anmärkningsvärd effekt hos BCR-ABL1-positiva KML-patienter3. Terapeutisk inriktning av onkogena gen fusioner har också varit framgångsrik i solida tumörer, med hämning av ALK och ROS1 fusion gener i icke-småcellig lungcancer som fungerar som primära exempel4,5. Nyligen, den NTRK inhibitor larotrectinib var FDA godkänt för NTRK1/2/3 fusion-positiva solida tumörer, oavsett sjukdoms plats6. Utöver terapi val, gen fusion upptäckt har också roller i sjukdomsdiagnos och prognos. Detta är särskilt utbredd i olika sarkom och hematologiska malignitet subtyper som är diagnostiskt definieras av närvaron av specifika fusioner och/eller för vilka förekomst av en fusion direkt informerar prognosen7,8 , 9 , 10 , 11. Detta är bara några exempel på klinisk tillämpning av detektion av gen fusion för cancerpatienter.
På grund av den kritiska roll i kliniskt beslutsfattande, noggrann gen fusion detektion från kliniska prover är av avgörande betydelse. Många tekniker har tillämpats i kliniska laboratorier för fusion eller kromosom rearrangering analys inklusive: cytogenetiska tekniker, omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR), fluorescens in situ hybridisering (fisk), immunohistokemi (IHC), och 5 '/3 ' Expression obalans analys (bland annat)12,13,14,15. För närvarande, den snabbt växande lista över angripbara gen fusioner i cancer har resulterat i behovet av att bedöma fusions status av flera gener samtidigt. Följaktligen, vissa traditionella tekniker som bara kan fråga en eller några gener i taget blir ineffektiva metoder, särskilt när man överväger att kliniska tumör prover är ofta mycket ändlig och inte mottagliga för att delas upp bland flera analyser. Nästa generations sekvensering (NGS) är dock en analysplattform som lämpar sig väl för flergenstester, och NGS-baserade analyser har blivit vanliga i laboratorier för klinisk molekylär diagnostik.
För närvarande används NGS analyser för fusion/rearrangering upptäckt varierar med avseende på använt material, kemiska sammansättningar som används för bibliotek beredning och mål berikning, och antalet gener tillfrågade inom en analys. NGS-analyser kan baseras på RNA eller DNA (eller båda) som utvinns ur provet. Även om RNA-baserad analys hämmas av tendensen hos kliniska prover att innehålla kraftigt försämrad RNA, kringgår det behovet av att sekvensera stora och ofta repetitiva introner som är målen för DNA-baserade fusions test men har visat sig vara svåra för NGS dataanalys16. Mål beriknings strategier för RNA-baserade NGS-analyser kan till stor del delas in i hybrid fångst eller amplicon-medierade metoder. Även om båda strategierna framgångsrikt har utnyttjats för fusion Detection, varje innehåller fördelar jämfört med de andra17,18. Hybrid Capture-analyser resulterar i allmänhet i mer komplexa bibliotek och minskad alleliska dropout, medan amplicon-baserade analyser i allmänhet kräver lägre indata och resulterar i mindre off-Target-sekvensering19. Men kanske den primära begränsningen av traditionella amplicon-baserade berikning är behovet av primers till alla kända fusion partners. Detta är problematiskt eftersom många kliniskt viktiga gener är kända för att smälta samman med dussintals olika partners, och även om primer design tillåts för detektering av alla kända partners, nya fusion händelser skulle förbli oupptäckta. En nyligen beskrivna teknik kallas förankrade Multiplex PCR (eller AMP för kort) adresser denna begränsning20. I amp är en halv funktionell ngs-adapter och ligaturer till cDNA-fragment som härleds från ingångsrna. Mål berikningen uppnås genom amplifiering mellan genspecifika primers och en primer till adaptern. Som ett resultat av detta bör alla fusioner till gener av intresse, även om en ny fusion partner berörs, upptäckas (se figur 1). Denna artikel beskriver användningen av ArcherDx FusionPlex solid tumör kit, en NGS-baserad analys som sysselsätter AMP för mål berikning och bibliotek förberedelse, för detektion av onkogen gen fusioner i fasta tumörprover (se kompletterande tabell 1 för fullständiga gen listan). Wet-Bench protokoll och dataanalys steg har noggrant validerats i en klinisk laboratorie förbättring ändringar (CLIA)-certifierade laboratorium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-05-01-13</td>
			<td>Used for TNA dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>Used in library pooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent Reservoir with divider</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9173-2000</td>
			<td>For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9700</td>
			<td>Plate used for thermocycler steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Used in purification after several assay steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Formapure Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A33343</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AB0005</td>
			<td>This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block, 96-well</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A7079</td>
			<td>Used for keeping samples chilled at various steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Used for bead washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification for Illumina Internal Control Standard</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4906</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4973</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Standards</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4903</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet Plate, 96-well (N38 grade)</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td>Used in bead purificiation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBC Adapters Set B</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AK0016-48</td>
			<td>Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td>Used for spinning down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4483485</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microamp Optical Film Compression Pad</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4312639</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plate Spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>MPS-1000</td>
			<td>Used for collecing liquid at bottom of plate wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>Contains components necessary for a MiSeq sequencing run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeqDx System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>NGS Sequencing Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 9700 Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for several steps during assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9938</td>
			<td>Used as general diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical ABI 96-well PCR plate covers</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Workstation Model 600</td>
			<td>Air Clean Systems</td>
			<td>BZ10119636</td>
			<td>Wet-bench assay steps performed in this &#39;dead air box&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1019499</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>LSA28139</td>
			<td>qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Use for determing RNA concentration in TNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-402-178</td>
			<td>Used for general RNase decontamination of work areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>0710-0129</td>
			<td>Used as the assay positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Used in clean-up steps and for sequencing setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td>Component of PreSeq QC Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>Used for reagent and sample mixing etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template RT PCR film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-7800</td>
			<td>Used for covering 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom 96-well Microplate</td>
			<td>LSP</td>
			<td>MP8117-R</td>
			<td>Used during bead purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing

Gen fusioner bidrar ofta till den onkogena fenotypen hos många olika typer av cancer. Dessutom, närvaron av vissa fusioner i prover från cancerpatienter ofta direkt påverkar diagnos, prognos, och/eller terapi urval. Som ett resultat har korrekt detektion av gen fusioner blivit en kritisk komponent i klinisk hantering för många sjukdomstyper. Tills nyligen, klinisk gen fusion upptäckt var främst åstadkommas genom användning av engenstester. Den ständigt växande förteckningen över gen fusioner med klinisk betydelse har dock skapat ett behov av att bedöma fusions status för flera gener samtidigt. Nästa generations sekvensering (NGS)-baserad testning har uppfyllt denna efterfrågan genom förmågan att sekvensera nukleinsyra i massivt parallella sätt. Flera NGS-baserade metoder som använder olika strategier för gentarget berikning är nu tillgängliga för användning i klinisk molekylär diagnostik, var och en med sina egna styrkor och svagheter. Denna artikel beskriver användningen av förankrade Multiplex PCR (AMP)-baserade mål berikning och bibliotek förberedelse följt av NGS att bedöma för gen fusioner i kliniska fasta tumörprover. AMP är unik bland amplicon-baserade berikningsmetoder genom att den identifierar gen fusioner oavsett identiteten hos fusions partnern. Detaljerade här är både våt-bänk och dataanalys steg som säkerställer korrekt gen fusion upptäckt från kliniska prover.

Visas i figur 3, figur 4 och figur 5 är skärmdumpar från analys användargränssnittet som visar resultaten från ett lungadenocarcinom prov. I figur 3visas exempel sammanfattningen (överst) som listar de s.k. starka bevis fusioner samt QC-status (inringad i rött). Den ADCK4- ANT fusion (av vilken 3 isoformer är katalogiserat) är omedelbart ignorerat emedan den er en ihärdig transkripti...

Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Denna artikel specificerar användningen av en förankrad multiplex polymeras kedjereaktion-baserade bibliotek förberedelse kit följt av nästa generations sekvensering för att bedöma för onkogena gen fusioner i kliniska fasta tumörprover. Både våt-bänk och dataanalys steg beskrivs.

Onkogen Gene fusion detektion med förankrade multiplex Polymerase kedjereaktion följt av nästa generations sekvensering

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Detta protokoll används för detektering av kritiskt informativa gen fusioner för patient tumör prover. Fusionsstatusen för dussintals gener bedöms samtidigt i en enda analys. Fördelen med denna teknik är att jag kan identifiera genfusioner oavsett fusionspartnerns identitet från tumörprover som har bearbetats genom formulerad fixering.Detektion av viss genfusion i kliniskt tumörprov informerar direkt diagnos, prognos och behandlingsval i många cancertyper. Det är viktigt att förstå att många fusioner som kallas av analysalgoritmen är artefakter. Den svåraste uppgiften när man analyserar data är att skilja mellan artefakt och verkliga fusionssamtal.Börja med att späda ut total nukleinsyra för att uppnå önskad koncentration av RNA. För varje prov, överför 20 mikroliter av utspädningen till de slumpmässiga priming reagensskensrören i ett förkylt aluminiumblock och blanda genom pipettering upp och ner sex till åtta gånger. Kort spinn ner proverna, överföra hela volymen till en 96-väl PCR-platta, och täta med tallrik sealer film.Sätt in plattan i en termocyklare, täck med kompressionsdynan och stäng locket. Inkubera vid 65 grader Celsius i fem minuter. Efter inkubationen överför du hela volymen av den slumpmässiga primingprodukten i de första strängreagensremsrören.Blanda genom pipettering upp och ner och kort snurra ner. Överför hela volymen till en 96-väl PCR-platta och tätning med RT-film. Sätt in plattan i termocyklaren och kör reaktionen enligt manuskriptriktningarna.Utför andra strängen cDNA syntes, och reparation, och ligering steg ett enligt manuskriptet riktningar och fortsätt till den andra ligering steg. För att numrera molekylstreckkoden eller MBC-adapterremsorna, placera rören horisontellt med gångjärn mot baksidan och använd en permanent markör. Ta pärla reningsplattan från det första ligeringssteget och överför 40 mikroliter av varje prov i MBC-adapterremsrören, var noga med att inte störa pärlpelletsen.Blanda reagenserna genom pipettering, snurra ner rören, och överför hela volymen till ligeringssteg två reagensremsrör. Blanda proverna, snurra ner dem och placera i ett termocykleringsblock. Lämna det uppvärmda locket av och kör termocyklaren på 22 grader Celsius i fem minuter, följt av 4 grader Celsius håll.Därefter förbereder ligeringsrensning pärlor genom att virveling dem och lägga till 50 mikroliter till en ny uppsättning AVTR bandrör. Inkubera på magneten i en minut och kassera supernatanten. Ta bort bandrören från magneten och resuspend pärlorna i 50 mikroliter av ligaturreningsbuffert genom pipettering upp och ner.Överför hela provvolymen från andra ligering steget in i ligeringsrensningspärlorsremsan. Vortexa proverna för att blanda och lämna dem i rumstemperatur i 10 minuter. Vortexa provet en gång halvvägs genom inkubationen.Efteråt, virvel proverna, snurra ner dem, och inkubera på magneten i en minut. Kassera supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av färsk ligeringsrensningsbuffert. Vortex att återanvända, snurra ner, och placera på magneten för en minut.Efter de två tvättar, utföra en tredje tvätt med ultrapure vatten i stället för buffert. Resuspend pärlorna i 20 mikroliter av 5 millimeter natriumhydroxid och överföra proverna till en 96-väl PCR-platta. Placera plattan i en thermocycler med en komprimering pad och kör den på 75 grader Celsius i 10 minuter, följt av en 4 grader Celsius håll.När proverna har svalnat till 4 grader Celsius, placera plattan på en magnet i minst tre minuter och fortsätt med den första PCR. Förbered PCR-reaktionerna genom att tillsätta två mikroliter av GSP1-primers till varje brunn av den första PCR-reagensremsan. Överför 18 mikroliter av den andra ligeringsrensningsprodukten till de första PCR-reagensremsrören och blanda genom pipettering upp och ner.Snurra ner proverna och överför dem till en 96-väl PCR-platta. Placera dem i termocyklaren och kör PCR enligt manuskriptet riktningar. Fortsätt med pärlrening genom att lägga till 20 mikroliter av PCR-produkten till en U-bottenplatta fylld med 24 mikroliter reningspärlor per brunn.Pipetter upp och ner för att blanda och lämna plattan i rumstemperatur i fem minuter, sedan inkubera plattan på magneten i två minuter. Kassera supernantanten från pärlorna och tvätta dem två gånger med 200 mikroliter av 70%etanol. Efter den slutliga tvätten, ta bort all etanol och låt provet lufttorka i två minuter.Ta bort plattan från magneten och resuspend pärlorna i 24 mikroliter på 10 millimeter Tris-HCl och pH 8.0. Inkubera av magneten i tre minuter och placera sedan plattan tillbaka på magneten i två minuter. Påbörja bibliotekskvantitation genom att förbereda en till fem utspädningar av den andra PCR-produkten i 10 millimeter Tris-HCl.Följ detta med en serieutspädning av 1:199, 1:199 och 20:80 i 10 millimeter Tris-HCl med 05%polysorbat. Ställ in viktiga PCR genom att lägga till sex mikroliter av master mix till varje brunn av en optisk 96-brunnsplatta, följt av fyra mikroliter av lämplig utspädning eller standard. Snurra ner plattan och ladda in den i qPCR-instrumentet.Utför qPCR enligt manuskriptet riktningar. Efter bibliotekskvantifiering är klar, späd alla bibliotek till två nanomolar med 10 millimeter Tris-HCl. Gör ett bibliotek pool genom att kombinera 10 mikroliter av varje normaliserade bibliotek i en 1,5 milliliter microcentrifug rör.Därefter förbereder denaturerade amplicon biblioteket, eller DAL pool, genom att kombinera 10 mikroliter av biblioteket poolen med 10 mikroliter av 0,2 normal natriumhydroxid och inkubera blandningen i fem minuter vid rumstemperatur. Efter inkubationen, tillsätt 10 mikroliter av 200 millimeter Tris-HCl vid pH 7.0, följt av 970 mikroliter av HT1 Hybridisering Buffer. Gör det slutliga laströret genom att kombinera 300 mikroliter av HT1, 25 mikroliter av 20 picomolar PhiX, och 675 mikroliter av DAL poolen.Tillsätt hela volymen av laströret till provvälken på sequencer-reagenspatronen och ladda in patronen i sequencern. Börja med att välja det positiva kontrollprovet och se till att alla förväntade fusioner och onkogena isoformer har upptäckts och är listade i fliken starka bevis. För varje prov, inspektera den genomsnittliga unika start platser per GSP2 kontroll värde, sedan visualisera de stödjande läsningar för varje potentiell fusion genom att klicka på Visualisera länken som tar användaren till en webbaserad JBrowse syn på högar av enskilda fusion stödjande läser.Bekräfta att läsningarna är mestadels fria från obalans, men mer än 30 baser av läsningarna överensstämmer med fusionspartnern, och att sekvenser intill brytpunkten mellan generna och primerbindningsställena är fria från infogningar eller borttagningar. Det är viktigt att se till att varje samtal fusion är i allmänhet fri från feljustering och att en betydande del av läsningar anpassa till fusion partner. Detta protokoll har använts för att undersöka gen fusion status i en lunga adenocarcinom prov.Sammanfattningen visar starka bevisfusioner och lässtatistiksidan visar mätvärden av urvalet. Detta prov uppvisar god RNA-kvalitet så negativa resultat skulle rapporteras om inga fusioner hittades. En legitim fusion samtal har ett stort antal stödjande läser, en hög procent av läser från primer stödja fusion, och ett stort antal startplatser.Visualisering av läsningarna visar god anpassning till stora regioner av fusionspartnern. Omvänt har ett artifactual fusion-anrop lägre stödmått och en hög felfrekvens vid mappning till partnern. Artifactual fusion samtal som gjorts av analysalgoritmen är vanliga.Det är viktigt att manuellt inspektera varje samtal för att säkerställa att det representerar en verklig genfusion i patientprovet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Nästa generations sekvense för detektion av vilken talan Mutationer i fast och flytande tumörer

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Detektion av sällsynta mutationer i CtDNA med nästa generations sekvensering

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Söker förare vägar av förvärvad resistens till riktad terapi: resistenta Subclone Generation och känslighet återställa av genen Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Med hjälp av CRISPR/Cas9 gen redigering för att undersöka onkogena aktiviteten av muterade Calreticulin i cytokin beroende av hematopoetiska celler

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitala polymeras Chain Reaction Assay för den genetiska variationen i en sporadisk familjär adenomatös polypos Patient med formatet Chip-i-ett-rör

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): anpassning av telomere upprepa amplifiering protokoll till droplet Digital polymerase kedje reaktion

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kartläggning av strukturfunktionsrelationer för oordnade onkogena transkriptionsfaktorer med transkriptomisk analys

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Rumslig profilering av protein- och RNA-uttryck i vävnad: Ett tillvägagångssätt för att finjustera virtuell mikrodissektion

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitokondriell cybridgenerering med hjälp av cancercellinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...