Name: oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Bu çalışma Colorado Üniversitesi Moleküler patoloji paylaşımlı kaynak tarafından destekleniyordu (Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek Grant No. P30-CA046934) ve Colorado Merkezi tarafından Kişiselleştirilmiş tıp.

1. Kütüphane hazırlama ve sıralama
<ol><li>Genel tahlil hususlar ve ön tahlil adımları
	<ol>
<li>Tahlil çalışır genellikle yedi klinik numuneler ve bir olumlu kontrol oluşur (kütüphane hazırlama başına numune sayısı gerektiğinde ayarlanabilir rağmen). Bir üretici tarafından teyit edilmiş ve/veya bir ortogonal metodoloji tarafından teyit edilmiştir en az birkaç gen Fusions (Bu tahlil hedefleri) içeren olumlu bir kontrol kullanın. Olmayan bir şablon denetimi (NTC) her tahlil...

<ol>
	<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation.">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li><li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer.">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li><li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer.">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li><li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children.">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li><li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma.">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li><li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing's+sarcoma.">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li><li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion.">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li><li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute.">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li><li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer.">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li><li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK)+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment.">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li><li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry.">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li><li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions.">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples.">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li><li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors.">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li><li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing.">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li><li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing.">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li><li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion.">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li><li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches.">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).</li><li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions.">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li><li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation:+Report+of+10+Cases.">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li><li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst.">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li></ol>

Bağlantılı Multiplex PCR tabanlı hedef zenginleştirme ve kitaplık hazırlığı yeni nesil sıralamanın ardından, klinik tümör örneklerinde Multiplexed gen Fusion değerlendirmesi için de uygundur. Genomik DNA yerine RNA girişine odaklanarak, büyük ve tekrarlayan intron dizilme ihtiyacı kaçınılmaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım füzyon ortağının kimliğine bakılmaksızın gen Fusions güçlendiriyor, yeni Fusions algılanır. Bu klinik alanda kritik bir avantajdır ve literatürde bildirilen amp ara...

İki veya daha fazla genin tek bir transkripsiyon varlığı içine birleşmeleri, silmeler, yinelemeler, eklemeler, inversions ve translocations dahil olmak üzere büyük ölçekli kromozomal varyasyonların sonucu olarak ortaya çıkabilir. Değiştirilmiş transkripsiyonel kontrol ve/veya ifade gen ürünün fonksiyonel özellikleri değiştirilmiş sayesinde, bu füzyon genler kanser hücrelerine Onkojenik özellikleri görüşmek olabilir1. Birçok durumda, Fusion genler doğrudan hücresel proliferasyon ve hayatta kalma yollarını aktive ederek primer Onkojenik sürücüler olarak hareket bilinmektedir.
Kanser hastaları için gen Fusions klinik alaka ilk Philadelphia kromozom ve karşılık gelen BCR-ABL1 Fusion gen kronik Miyelojen lösemi (KML)2keşfi ile belirgin oldu. Küçük molekül inhibitörü İmatinib Mesilat özellikle bu füzyon geni hedef ve BCR-ABL1-pozitif KML hastalarda dikkat çekici etkinliği göstermiştir geliştirilmiştir3. Onkojenik gen Fusions terapötik hedefleme de katı tümörlerde başarılı olmuştur, alk ve ROS1 Fusion genleri temel örnekler olarak hizmet veren küçük hücreli olmayan akciğer kanseri inhibisyonu ile4,5. Son zamanlarda, NTRK inhibitörü larotrectinib FDA onaylı NTRK1/2/3 Fusion-pozitif katı tümörlerin, ne olursa olsun hastalık site6. Terapi seçimlerinin ötesinde, gen füzyon tespiti de hastalık tanısı ve prognoz rolleri vardır. Bu özellikle belirli Fusions ve/veya bir füzyon varlığı doğrudan prognoz bilgilendirir tarafından tanımlanan çeşitli sarkomu ve hematolojik malignite alt türleri yaygındır7,8 , 9 , 10 ' dan fazla , 11. Bunlar ancak kanser hastaları için gen füzyon algılama klinik uygulama örneklerinden birkaçı.
Klinik karar verme konusunda kritik rol oynadığı için klinik örneklerden doğru gen füzyon tespiti hayati önem taşımaktadır. Klinik laboratuvarlarda, sitogenetik teknikler, Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), floresans in situ hibridizasyon (balık) gibi füzyon veya kromozomal yeniden düzenleme analizi için çok sayıda teknik uygulandı. immünhistokimya (IHC) ve 5 '/3 ' ifade dengesizliği Analizi (diğerleri arasında)12,13,14,15. Şu anda, kanserde harekete geçirilebilir gen Fusions hızla genişleyen listesi aynı anda birden fazla genlerin füzyon durumunu değerlendirmek için ihtiyaç sonuçlandı. Sonuç olarak, bir defada sadece bir veya birkaç geni sorgulayabilir bazı geleneksel teknikler verimsiz yaklaşımlar haline gelmektedir, özellikle de klinik tümör örneklerinin genellikle çok sonlu olduğunu ve çeşitli bulguların arasına bölünmeye imkan olmadığını düşünürsek. Ancak yeni nesil sıralama (NGS), çok gen testi için uygun bir analiz platformudur ve NGS tabanlı testler klinik Moleküler diagnostik laboratuvarlarda yaygın hale gelmiştir.
Şu anda kullanılmış NGS Fusion/yeniden düzenleme algılama için kullanılan giriş malzemesi, Kütüphane hazırlama ve hedef zenginleştirme için kullanılan kimyaları ve bir tahlil içinde sorgulanan genlerin sayısı açısından değişir. NGS Analizör, örnekten çıkarılan RNA veya DNA (ya da her ikisi) temelinde olabilir. RNA tabanlı analiz, klinik numunelerin son derece bozulmuş RNA içermesine eğiliminden kaçınmasına karşın, DNA tabanlı füzyon testinin hedefleri olan ama NGS için zor olduğu kanıtlanmış büyük ve sık tekrarlayan intronlar sıralama ihtiyacını aşmaktadır. Veri Analizi16. RNA tabanlı NGS uygulamaları için hedef zenginleştirme stratejileri büyük ölçüde hibrit yakalama veya Amplicon-aracılı yaklaşımlara bölünebilir. Fusion algılama için her iki strateji de başarıyla kullanılırken, her biri diğer17,18üzerinde avantajları içerir. Hibrid yakalama genellikle daha karmaşık kütüphaneler ve azaltılmış allelik bırakma sonucu, Amplicon tabanlı asder genellikle daha düşük giriş gerektirir ve daha az hedef sıralı19sonuç sağlar. Ancak, belki de geleneksel Amplicon tabanlı zenginleştirme birincil sınırlama tüm bilinen Fusion ortakları için astar gerekir. Birçok klinik olarak önemli genlerin düzinelerce farklı ortakla sigortalı olduğu bilinmektedir ve primer tasarım tüm bilinen ortakların algılanması için izin verilse bile, yeni füzyon etkinlikleri tespit edilmedi. Son zamanlarda tarif edilen teknik, bu sınırlama20' de (veya kısa amp) bağlantılı MULTIPLEX PCR olarak adlandırılır. AMP 'de, ' yarı işlevsel ' NGS bağdaştırıcısı, giriş RNA 'dan türetilen cDNA parçalarıyla bağlanıyor. Hedef zenginleştirme, gen spesifik astar ve adaptör için bir astar arasındaki amplifikasyon ile elde edilir. Sonuç olarak, bir yeni füzyon ortağı dahil olsa bile, ilgi genler için tüm Fusions, tespit edilmelidir (bkz. Şekil 1). Bu makalede ArcherDx FusionPlex katı tümör kiti kullanımı, bir NGS tabanlı tahlil, hedef zenginleştirme ve kitaplık hazırlama için AMP istihdam, katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions tespiti için (bkz: Tamamlayıcı Tablo 1 için tam gen listesi). Islak tezgah Protokolü ve veri analizi adımları, klinik laboratuar Iyileştirme değişiklikleri (CLIA) sertifikalı bir laboratuvarda titizlikle onaylanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-05-01-13</td>
			<td>Used for TNA dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>Used in library pooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent Reservoir with divider</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9173-2000</td>
			<td>For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9700</td>
			<td>Plate used for thermocycler steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Used in purification after several assay steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Formapure Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A33343</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Archer FusionPlex Solid Tumor kit</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AB0005</td>
			<td>This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block, 96-well</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A7079</td>
			<td>Used for keeping samples chilled at various steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Used for bead washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification for Illumina Internal Control Standard</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4906</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4973</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Standards</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4903</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet Plate, 96-well (N38 grade)</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td>Used in bead purificiation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBC Adapters Set B</td>
			<td>ArcherDX</td>
			<td>AK0016-48</td>
			<td>Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td>Used for spinning down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4483485</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microamp Optical Film Compression Pad</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4312639</td>
			<td>Used for library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plate Spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>MPS-1000</td>
			<td>Used for collecing liquid at bottom of plate wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
			<td>Contains components necessary for a MiSeq sequencing run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeqDx System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>NGS Sequencing Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 9700 Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for several steps during assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9938</td>
			<td>Used as general diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical ABI 96-well PCR plate covers</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Used for Pre-Seq QClibrary quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Workstation Model 600</td>
			<td>Air Clean Systems</td>
			<td>BZ10119636</td>
			<td>Wet-bench assay steps performed in this &#39;dead air box&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1019499</td>
			<td>Used in TNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>LSA28139</td>
			<td>qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Use for determing RNA concentration in TNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-402-178</td>
			<td>Used for general RNase decontamination of work areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>0710-0129</td>
			<td>Used as the assay positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Used in clean-up steps and for sequencing setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td>Component of PreSeq QC Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure PCR 8-tube Strips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>Used for reagent and sample mixing etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template RT PCR film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-7800</td>
			<td>Used for covering 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom 96-well Microplate</td>
			<td>LSP</td>
			<td>MP8117-R</td>
			<td>Used during bead purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oncogenic gene fusion detection using anchored multiplex polymerase chain reaction followed by next generation sequencing

Gen Fusions sıklıkla kanser birçok farklı türde Onkojenik fenotipi katkıda bulunur. Ayrıca, kanser hastalarından numunelerde belirli Fusions varlığı genellikle doğrudan tanı etkiler, prognoz, ve/veya tedavi seçimi. Sonuç olarak, gen Fusions doğru tespiti birçok hastalık türleri için klinik yönetim kritik bir bileşeni haline gelmiştir. Yakın zamana kadar, klinik gen füzyon algılama ağırlıklı olarak tek gen assays kullanımı ile gerçekleştiriliyordu. Ancak, klinik öneme sahip gen Fusions sürekli büyüyen listesi aynı anda birden fazla genlerin füzyon durumunu değerlendirmek için bir ihtiyaç yarattı. Yeni nesil sıralama (NGS) tabanlı testler, kitlesel paralel moda nüklik asit sırası yeteneği ile bu talebi karşılamıştır. Gen hedef zenginleştirme için farklı stratejiler kullanan birden fazla NGS tabanlı yaklaşımlar artık her biri kendi güçlü ve zayıf yönlerini içeren klinik moleküler diagnostikte kullanılabilir. Bu makalede, bağlantılı Multiplex PCR (AMP) tabanlı hedef zenginleştirme ve kütüphanenin hazırlanması, klinik katı tümör örneklerinde gen Fusions değerlendirmek için NGS tarafından izlenen kullanılır. AMP, Fusion ortağının kimliğine bakılmaksızın gen Fusions 'i tanımladığı için Amplicon tabanlı zenginleştirme yaklaşımlarının arasında benzersizdir. Burada ayrıntılı olarak klinik örneklerden doğru gen füzyon tespiti sağlayan ıslak tezgah ve veri analizi adımları bulunmaktadır.

Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5 ' te gösterilen bir akciğer adenokarsinoma örneğinden sonuçları gösteren analiz kullanıcı arayüzünden ekran görüntüleri vardır. Şekil 3' te, adlandırılan güçlü kanıt Fusions yanı sıra QC durumu (kırmızı daire) listeler örnek Özet (üst) gösterilir. ADCK4-numbl Fusion (hangi 3 izoformlarının listelenir) hemen göz ardı edilir, çün...

Watch this Scientific Journal Video about Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing at JoVE.com

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Bu makalede, klinik katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions değerlendirmek için yeni nesil sıralamanın ardından bir bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyon tabanlı kitaplık hazırlama kiti kullanımını ayrıntılarıyla. Hem ıslak tezgah hem de veri analizi adımları açıklanmıştır.

Yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak Onkojenik gen füzyon tespiti

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Bu protokol hasta tümör örnekleri için kritik bilgilendirici gen füzyonlarının saptanmasında kullanılır. Düzinelerce genin füzyon durumu tek bir tözde eş zamanlı olarak değerlendirilir. Bu tekniğin avantajı, formülatif fiksasyon ile işlenen tümör örneklerinden füzyon partnerinin kimliğine bakılmaksızın gen füzyonlarını tanımlayabildiğimdir.Klinik tümör örneğinde bazı gen füzyonunun saptanması birçok kanser türünde tanı, prognoz ve tedavi seçimini doğrudan bildirir. Analiz algoritması tarafından çağrılan birçok füzyonun yapıt olduğunu anlamak önemlidir. Verileri çözümlerken en zor görev yapı ve gerçek füzyon çağrıları arasında ayrım.RNA istenilen konsantrasyonu elde etmek için toplam nükleik asit seyrelterek başlayın. Her numune için, seyreltmenin 20 mikrolitresini önceden soğutulmuş alüminyum bloktaki rastgele astar reaktif şerit tüplere aktarın ve altı ila sekiz kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Kısaca örnekleri aşağı spin, 96-iyi PCR plaka için tüm hacmi aktarın ve plaka mühür film ile mühür.Plakayı bir termocycler'a takın, sıkıştırma pedi ile kaplayın ve kapağı kapatın. 65 santigrat derecede 5 dakika kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, ilk iplikreaktif şerit tüplerde rastgele astar lama ürününün tüm hacmini aktarın.Yukarı ve aşağı boru ile karıştırın ve kısa bir süre aşağı spin. Tüm hacmi 96 kuyulu bir PCR plakaya aktarın ve RT filmile mühürleyin. Plakayı termocycler'a takın ve müsvedde lerin talimatlarına göre reaksiyonuyguluyor.İkinci iplikçik cDNA sentezini gerçekleştirin ve onarım ve el yazması yönlere göre ligasyon adım bir ve ikinci ligasyon adım devam edin. Moleküler barkod veya MBC adaptörü şerit tüplerini numaralandırmak için tüpleri arkaya menteşelerle yatay olarak yerleştirin ve kalıcı bir belirteç kullanın. İlk ligasyon adımından boncuk arınma plakasını alın ve her numunenin 40 mikrolitresini MBC adaptör şerit tüplerine aktarın, boncuk peletini rahatsız etmemeye özen tinler.Pipetleme ile reaktifleri karıştırın, tüpleraşağı spin, ve ligasyon adım iki reaktif şerit tüpler için tüm hacmi aktarın. Örnekleri karıştırın, aşağı döndürün ve bir termocycler bloğuna yerleştirin. Isıtılan kapağı kapalı bırakın ve termocycler'ı 22 derecede beş dakika çalıştırın, ardından 4 santigrat derece tutun.Daha sonra, onları girdap ve PCR şerit tüpler yeni bir dizi 50 mikrolitre ekleyerek ligasyon temizleme boncuk hazırlamak. Bir dakika için mıknatıs inkübate ve supernatant atın. Mıknatıstan şerit tüpleri çıkarın ve yukarı ve aşağı borulama tarafından ligasyon temizleme tampon 50 mikrolitre boncuk lar yeniden askıya alın.İkinci ligasyon adımından tüm numune hacmini ligasyon temizleme boncuk şeridine aktarın. Girdap örnekleri karıştırmak ve 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Girdap örnek bir kez kuluçka yarısında.Daha sonra, örnekleri girdap, onları aşağı spin ve bir dakika için mıknatıs üzerinde kuluçka. Supernatant atın ve taze ligasyon temizleme tampon 200 mikrolitre ekleyin. Girdap yeniden askıya almak için, aşağı spin, ve bir dakika için mıknatıs üzerine yerleştirin.İki yıkamadan sonra tampon yerine ultra saf su kullanarak üçüncü bir yıkama gerçekleştirin. 5 milimetre sodyum hidroksit 20 mikrolitre boncuk resuspend ve 96-iyi PCR plaka örnekleri aktarın. Plakayı bir sıkıştırma yastığı olan bir termocycler'a yerleştirin ve 75 derecede 10 dakika çalıştırın ve ardından 4 derece santigrat tutun.Numuneler 4 dereceye kadar soğuduktan sonra plakayı en az üç dakika mıknatısın üzerine yerleştirin ve ilk PCR ile devam edin. İlk PCR reaktif şeridinin her kuyusuna iki mikrolitre GSP1 astar ı ekleyerek PCR reaksiyonlarını hazırlayın. İkinci ligasyon temizleme ürününün 18 mikrolitresini ilk PCR reaktif şerit borularına aktarın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.Örnekleri aşağı çevirin ve 96 kuyulu bir PCR plakasına aktarın. Onları termocycler'a yerleştirin ve el yazması talimatlara göre PCR çalıştırın. Her kuyuda 24 mikrolitre arınma boncukları ile dolu bir U-alt plakapcr ürün 20 mikrolitre ekleyerek boncuk arıtma ile devam edin.Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak ve beş dakika oda sıcaklığında plaka bırakın, sonra iki dakika boyunca mıknatıs üzerinde plaka kuluçka. Boncuklardan supernantant atın ve% 70 etanol 200 mikrolitre ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tüm etanol çıkarın ve iki dakika boyunca örnek hava kuru izin.Plakayı mıknatıstan çıkarın ve 10 milimetretri-HCl ve pH 8.0'ın 24 mikrolitresinde boncukları yeniden askıya alın. Mıknatısı üç dakika kuluçkaya yatırın ve tabağı iki dakika lığına mıknatısın üzerine yerleştirin. 10 milimetre tris-HCl ikinci PCR ürün bir ila beş seyreltme ler hazırlayarak kütüphane nicelik başlar.Bunu 1:199, 1:199 ve 20:80'lik 10 milimetretri-HCl'de %05 polisorbatile seri seyreltme ile takip edin. Optik 96 kuyulu plakanın her kuyuya altı mikrolitre ana karışım ekleyerek anahtar PCR'yi kurun ve ardından uygun seyreltme veya standartdört mikrolitre. Plakayı aşağı çevirin ve qPCR aletine yükleyin.El yazması talimatlara göre qPCR gerçekleştirin. Kütüphane niceliği tamamlandıktan sonra, tüm kütüphaneleri 10 milimetre Tris-HCl ile iki nanomolara seyreltin. Normalleştirilmiş her kütüphanenin 10 mikrolitresini 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne birleştirerek bir kütüphane havuzu yapın.Daha sonra, 0,2 normal sodyum hidroksit 10 mikrolitre ile kütüphane havuzu10 mikrolitre birleştirerek ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca karışımı kuluçkaya yatırarak, denatüre amplicon kütüphane veya DAL havuzu hazırlayın. Kuluçkadan sonra, pH 7.0'da 200 milimetre tris-hcl 10 mikrolitre ekleyin, ardından 970 mikrolitre HT1 Hibridizasyon Tamponu. 300 mikrolitre HT1, 25 mikrolitre 20 picomolar PhiX ve DAL havuzunun 675 mikrolitresini birleştirerek son yük tüpünü yapın.Yük tüpünün tüm hacmini sıralayıcı reaktif kartuşunun numune kuyusuna ekleyin ve kartuşun uyanıcıya yükleyin. Pozitif kontrol örneğini seçerek başlayın ve beklenen tüm füzyonların ve onkojenik izoformların tespit edildiğinden ve güçlü kanıt sekmesinde listelendiklerinden emin olun. Her örnek için, GSP2 kontrol değeri başına ortalama benzersiz başlangıç sitelerini inceleyin, ardından kullanıcıyı bireysel füzyon destekleyen okuma yığınlarının web tabanlı JBrowse görünümüne götüren Visualize bağlantısını tıklatarak her olası birleştirme için destekleyici okumaları görselleştirin.Okumaların çoğunlukla uyumsuzlu olduğunu, ancak okumaların 30'dan fazla tabanının füzyon ortağıyla uyumlu olduğunu ve genler ve astar bağlama siteleri arasındaki kırılma noktasına bitişik dizilerin ekleme veya silme içermez olduğunu doğrulayın. Her çağrı füzyonunun genellikle uyumsuzlukiçermeyen olmasını ve okumaların önemli bir bölümünün füzyon ortağıyla uyumlu olmasını sağlamak çok önemlidir. Bu protokol akciğer adenokarsinom örneğinde gen füzyonu durumunu araştırmak için kullanılmıştır.Özet güçlü kanıt füzyonları gösterir ve Okuma İstatistikleri sayfası örnek ölçümleri gösterir. Bu örnek iyi RNA kalitesi sergiler, bu nedenle füzyon bulunmazsa negatif sonuçlar rapor edilecektir. Meşru bir füzyon çağrısı, yüksek sayıda destekleyici okuma sayısına, füzyonu destekleyen astardan okumaların yüksek bir yüzdeye ve yüksek sayıda başlangıç sitesi vardır.Okumaların görselleştirilmesi, füzyon ortağının büyük bölgelerine iyi bir uyum gösterir. Tersine, yapay bir kaynaştırma çağrısı, ortakla eşleme yaparken daha düşük destekleyici ölçümlere ve yüksek hata oranına sahiptir. Analiz algoritması tarafından yapılan yapay füzyon çağrıları yaygındır.Hasta örneğinde gerçek bir gen füzyonu temsil ettiğinden emin olmak için her çağrıyı elle incelemek çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Damlacık dijital tuzak (ddTRAP): telomere tekrar amplifikasyon protokolünün droplet dijital polimeraz zincir reaksiyonuna adaptasyon

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...