Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة إليسون الطبية منحAG-NS-0843-11، والمنحة التجريبية للمعهد الوطني للصحة ضمن منحة دعم مركز السرطان NCI P30CA030199 إلى A.S.

تم تنفيذ السكن والعلاج والتضحية من الفئران بعد بروتوكول IACUC المعتمدة من معهد سانفورد برنهام Prebys الطبية ديسكفري.
1. إعداد الكاشف
<ol><li>إعداد 100 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية: F10 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل الحصان (HS).</li>
	<li>إعداد 50 مل من حل الكولاجين النوع الثاني: حل 1 غرام من مسحوق ...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+liver+cancer+stem+cells.">Molecular biology of liver cancer stem cells.</a> Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).</li><li>Crous, A. M., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+stem+cells+and+low-intensity+laser+irradiation:+a+potential+future+therapy.">Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (5), 129 (2013).</li><li>Tomao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+molecular+profiles+of+ovarian+cancer:+an+update+on+cancer+stem+cells.">Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells.</a> Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).</li><li>Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+stem+cells:+new+insight+into+a+stubborn+disease.">Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease.</a> Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).</li><li>Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+prostate+cancer+stem+cells:+markers+and+methods.">Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorsphere+as+an+effective+in+vitro+platform+for+screening+anti-+cancer+stem+cell+drugs.">Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs.</a> Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).</li><li>Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+adult+and+pediatric+rhabdomyosarcoma+in+the+surveillance,+epidemiology+and+end+results+program.">Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).</li><li>Blum, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+transducer+YAP1+transforms+activated+satellite+cells+and+is+a+potent+effector+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+formation.">The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation.</a> Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).</li><li>Hatley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+rhabdomyosarcoma+originating+from+the+adipocyte+lineage.">A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage.</a> Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).</li><li>Drummond, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

وقد استخدمت أساليب متعددة لعزل وتوصيف TPCs من مجموعات الخلايا غير المتجانسة الورم: اختبار الورم clonogenic، عزل FACS، ودراسة تشكيل الورم. تم وصف فحص الورم الكلوجيني لأول مرة في عام 1971، ويستخدم لدراسات الخلايا الجذعية، ويطبق فقط في وقت لاحق على بيولوجيا السرطان29،30. ?...

السرطان هو مرض غير متجانس. وعلاوة على ذلك، فإن نفس النوع من الورم يمكن أن يقدم طفرات جينية مختلفة في مختلف المرضى، وداخل المريض يتكون الورم من مجموعات متعددة من الخلايا1. ويشكل عدم التجانس تحديا في تحديد الخلايا المسؤولة عن بدء انتشار السرطان، ولكن توصيفها ضروري لتطوير علاجات فعالة. فكرة نشر الخلايا الورم (TPC)، وهي مجموعة نادرة من الخلايا التي تسهم في تطوير الورم، وقد تم استعراضها سابقا على نطاق واسع2. على الرغم من حقيقة أن TPCs قد تميزت في أنواع متعددة من السرطان، وتحديد علامات لعزلتها موثوق بها لا يزال تحديا لعدة أنواع الورم3،4،5،6 , 7 , 8 , 9. وهكذا، يمكن تطبيق طريقة لا تعتمد على العلامات الجزيئية ولكن بدلا من ذلك على خصائص وظيفية TPC (التجديد الذاتي عالية والقدرة على النمو في ظروف منخفضة المرفق)، والمعروفة باسم اختبار تشكيل الورم، على نطاق واسع ل تحديد TPCs من معظم الأورام. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا الفحص لتوسيع TPCs وبالتالي تطبق مباشرة على فحص المخدرات السرطان والدراسات على مقاومة السرطان1،10.
الساركوما الروماتيزمية (RMS) هو شكل نادر من ساركوما الأنسجة الرخوة الأكثر شيوعا في الأطفال الصغار11. Althoug RMS يمكن تحديدها من الناحية النسيجية من خلال تقييم التعبير عن علامات myogenic، لم يتم وصف خلية أصل RMS بشكل أحادي الصوت بسبب الأنواع الفرعية الورم متعددة وعدم تجانس عالية من المحفزات التنموية الورم. في الواقع، وقد ولدت الدراسات الحديثة مناقشة علمية هامة حول ما إذا كان RMS هو من أصول myogenic أو غير myogenic، مما يشير إلى أن RMS قد تستمد من أنواع الخلايا المختلفة اعتمادا على السياق12،13، 14 سنة , 15 , 16 سنة , 17. وقد أجريت دراسات عديدة على خطوط الخلايا RMS باستخدام اختبار تشكيل الورم لتحديد المسارات المشاركة في تطوير الورم وتوصيف علامات المرتبطة السكان التجديد الذاتي للغاية 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21.
ومع ذلك، على الرغم من إمكانية اختبار تشكيل محيط الورم لتحديد خلايا RMS المنشأ، لم يتم بعد وصف طريقة موثوق بها التي يمكن استخدامها على خلايا RMS الأولية. في هذا السياق، استخدمت دراسة حديثة من مجموعتنا فحص تشكيل الورم الأمثل لتحديد خلايا RMS المنشأ في ضمور العضلات دوشين (DMD) نموذج الماوس22. يتم اختبار أنواع متعددة من الخلايا قبل الورم، معزولة عن أنسجة العضلات، لقدرتها على النمو في ظروف منخفضة التعلق، مما يسمح بتحديد الخلايا الجذعية العضلية كخلايا المنشأ لRMS في سياقات عسر التغذية. يوصف هنا هو بروتوكول قابل للاستنساخ وموثوق بها لتصور تشكيل الورم (الشكل 1)، والتي تم استخدامها بنجاح لتحديد مجموعات الخلايا النادرة للغاية التي هي المسؤولة عن تطوير RMS الماوس.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

الساركوما الروماتيزمية (RMS) هي ساركوما الأنسجة الرخوة الأكثر شيوعًا لدى الأطفال. وعلى الرغم من أن الجهود الكبيرة قد مكنت من تحديد الطفرات الشائعة المرتبطة بـ RMS وسمحت بالتمييز بين مختلف الأنواع الفرعية لـ RMS، لا تزال هناك تحديات كبيرة أمام تطوير علاجات جديدة لزيادة تحسين التكهن. على الرغم من أن تحديدها من خلال التعبير عن علامات myogenic، لا يزال هناك جدل كبير حول ما إذا كان RMS لديه أصول myogenic أو غير myogenic، كما خلية المنشأ لا يزال غير مفهومة بشكل جيد. في هذه الدراسة، يتم توفير طريقة موثوق بها للبفحص الورم للماوس RMS. ويستند هذا القول على الخصائص الوظيفية للخلايا السرطانية ويسمح بتحديد السكان النادرين في الورم مع وظائف الورم. كما تم وصف إجراءات اختبار البروتينات المؤتلفة، ودمج بروتوكولات التغوط مع فحص محيط الأورام، وتقييم الجينات المرشحة المشاركة في تطوير الورم والنمو. كما هو موضح هو إجراء لزرع الطعوم من الأورام في الفئران المتلقية للتحقق من وظيفة الورم في الجسم الحي. بشكل عام، تسمح الطريقة الموصوفة بتحديد واختبار السكان النادرين في RMS التي يمكن تطبيقها على RMS الناشئة في سياقات مختلفة. وأخيرا، يمكن استخدام البروتوكول كمنبر لفحص المخدرات والتطوير المستقبلي للعلاجات.

الكشف عن الأورام تم تحسين عزل الخلايا للحصول على أقصى قدر من التباين من مجموعات الخلايا الموجودة في أنسجة الورم. أولا، منذ الأنسجة المعزولة قدمت مناطق مختلفة من الناحية الشكلية، لتعزيز فرص عزل مجموعات الخلايا النادرة موحدة، تم إجراء أخذ العينات من مناطق متعد?...

Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للاستنساخ لعزل الخلايا الأولية لالروماتيزم الفأر، وتشكيل الأورام وعلاجها، وزرع الطعوم بدءاً من ثقافات الأورام.

اشتقاق الأورام والعلاج من الخلايا السرطانية الأولية المعزولة من الساركوما الروماتيزمية الماوس

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Rhabdomyosarcoma هو شكل نادر من ساركوما الأنسجة الرخوة تتميز الأنسجة النسيجية من قبل مورفولوجيا الأنسجة والتعبير عن علامات ميوجيني. ومع ذلك ، بالنظر إلى وجود أنواع فرعية مختلفة من هذه الأورام وعدم تجانس المحفزات التي تساهم في تكوينها ، كان تحديد خلية المنشأ صعبًا للغاية. هنا ونحن وصف أساليب استنساخ وموثوق بها لتحديد الخلية الأصلية من rhabdomyosarcomas بدءا من أنسجة الورم الحصاد حديثا من الفئران وهذا المقايسة هو فحص تشكيل أورام.المزايا الرئيسية للأورام تشكيل مقايسة هو أنه يعتمد على الخصائص الخلوية التي من المعروف أن تكون موجودة في الخلايا التي تنشأ الورم ويمكن أيضا أن تستخدم لتوسيع وإثراء سكان الخلايا المحددة. وعلاوة على ذلك، هيكلها spheroid تقليد بيئة الورم، وبالتالي يمكن استخدامها كدراسات فحص المخدرات. هذه الطريقة لديها القدرة على تطبيقها على أنواع أخرى من الأورام لأنها لا تتطلب معرفة مسبقة من علامات الجزيئية ولكن قد تتطلب تحسين ظروف الثقافة.قد يستغرق الورم بعض الوقت لتشكيل, خاصة إذا كان يحاول تحديد عدد الخلايا النادرة داخل الورم. وبالتالي، لا يُقترح النظر إلى طبق الثقافة الفرعية كل يوم، لأنه قد يؤثر سلبًا على نتائج تجاربك. ابدأ من خلال الاحماء لوحة 10 سنتيمترا مع خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام العزل في حاضنة في 37 درجة مئوية.تزن 500 إلى 1000 ملليغرام من نسيج الورم ووضعها في لوحة. جلب لوحة مع أنسجة الورم إلى غطاء الثقافة العقيمة و mince مع شفرة الحلاقة. للحصول على الهضم الأمثل، تأكد من أن أحجام القطع المفروم موحدة.نقل الأنسجة المفرومة والخلايا وسائط العزل إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر. غسل لوحة مع أربعة ملليلتر آخر من وسائل الإعلام وإضافة ذلك إلى الأنبوب. إضافة 700 وحدة لكل ملليلتر من محلول الكولاجيناز للأنبوب واحتضانه في حمام مائي مهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 1/2 ساعة.بعد الحضانة، تدور أسفل الأنسجة في 300 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. pirate المابير دون تعطيل بيليه، ثم إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من حل الهضم الثاني واحتضان في حمام الماء يهز لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد عملية الهضم الثانية، الماصات تعليق الخلية صعودا وهبوطا وتمريرها من خلال مرشح النايلون 70 ميكرومتر على أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر.ثم غسل مرشح مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام عزل الخلية وتدور أسفل الأنسجة في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق. التعرق وssuspend بيليه في 20 ملليلتر من وسائل الإعلام خلية الورم. نقل التعليق إلى لوحة ثقافة 15 سنتيمترا ووضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، قم بتغيير الوسائط لإزالة الحطام والخلايا الميتة التي قد تؤثر سلبًا على بقاء الخلايا. عند هذه النقطة، قم بتقييم التقاء الخلايا والسماح للخلايا بالنمو في الحاضنة حتى تصل إلى 90٪ مراقبة الخلايا كل يوم وتغيير الوسائط كل يومين. لاشتقاق أورام غلاف، استخدم الخلايا في الممر P1 أو P2 لتجنب اختيار الخلايا من خلال ممرات متعددة.غسل طبق الخلية مع برنامج تلفزيوني ومن ثم تغطيتها مع حل مفرزة. وضعها في الحاضنة لمدة خمس إلى 10 دقائق ثم تأكيد الانفصال من خلال النظر في لوحة تحت مجهر brightfield. بمجرد انفصال الخلايا، أضف سائل الخلايا السرطانية إلى اللوحة ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي.تدور الخلايا في أسفل في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق، وإزالة فائقة، وإعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام أوراموسفير. بعد إعادة تعليق الخلايا، عد لهم باستخدام Trypan الأزرق وحساب تركيز الخلايا. لوحة العدد الصحيح من الخلايا في لوحة 96-جيدا منخفضة المرفق ووضع الخلايا في الحاضنة حتى نهاية التجربة، مع الحرص على عدم إزعاج لوحة ما لم تجديد وسائل الإعلام.بعد الانتهاء من التجربة، وتحديد أورام السيلفيرات يدويا تحت المجهر brightfield أو باستخدام برنامج سيليغو. يمكن تقييم عدد وحجم أورام الأص وراتين نتيجة لهذه الحسبة. لإعداد أورامفيرس لزرع allograft، وجمع جميع أورامpheres التي تم الحصول عليها من نوع خلية معينة أو العلاج.الطرد المركزي في أورامpheres وإزالة بعناية فائقة مع ماصة ملليمتر واحد تليها ماصة 200 ميكرولتر، ثم غسلها مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقمة. تدور في أوراموسفيرس أسفل مرة أخرى ويكبر برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميكرولتر إلى ملليلتر واحد من حل مفرزة الخلايا على رأس بيليه أوراموسفير وتحتضن الخلايا في حمام مائي يهز في 37 درجة مئوية.تحقق من تطور عملية الهضم كل 10 دقائق. تستغرق العملية بأكملها ما يصل إلى 30 دقيقة. إذا كان هضم أوراموسفير في حمام الماء المهتز لا يكفي للحصول على حل خلية واحدة ، يقترح اضطراب ميكانيكي من خلال الأنابيب صعودا وهبوطا.لاحظ أنه بعد الغزل في أورامpheres لا تشكل بيليه مستقرة، لذلك التعرق ينبغي أن يتم بعناية مع ماصات ملليلتر واحد والماصات 200 ميكرولتر. مرة واحدة يتم الحصول على حل خلية واحدة، إضافة حجم من وسائل الإعلام خلية الورم وتدور عليه في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق في 4 درجات مئوية. بعد هذا الطرد المركزي، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة على الجليد.Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام خلية الورم البارد والخلايا الحية العد باستخدام استبعاد Trypan الأزرق. تحديد العدد الصحيح من الخلايا ل allograft وتمييع في 50 ميكرولترات من وسائل الإعلام خلية الورم البارد. ضع طرف ماصة في سائل الخلايا السرطانية الباردة لتبريده ثم استخدامه لأخذ 50 ميكرولترات من محلول ECM البارد وإضافته إلى الأنبوب مع الخلايا ، مع التأكد من عدم إزالة أنبوب ECM من الجليد أثناء هذه العملية.الحفاظ على الخلايا على الجليد حتى زرع ووضع توج، 0.5 ملليلتر حقنة الأنسولين مع إبرة 29 قياس على الجليد. بعد التأكد من أن الماوس قد تم تخديره بشكل صحيح ، حلق الجانب الأيمن من الحيوان ، pirate محلول الخلية في الحقنة المبردة ، وحقن الخلايا تحت الجلد في المنطقة الحليقة. إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح، سوف تتشكل نتوءات مرئية تحت الجلد.يمكن استخدام هذا البروتوكول لتشكيل أورام بشكل موثوق لتحديد مجموعات الخلايا النادرة المسؤولة عن تطوير ساركوما الأنسجة الرخوة. جزء أساسي من هذا الفحص هو التمييز بين الخلايا والخلايا، والتي تظهر اختلافات واضحة في التشكل. لتحديد التركيز الأمثل الذي البروتين من مصلحة يؤدي إلى تأثير على الخلايا السرطانية، فمن الضروري لتقييم مستوى التعبير عن أهداف المصب البروتين.وأظهرت ثلاثة من الجينات المختبرة استجابة تعتمد على الجرعة لعلاج البروتين المؤتلف ولم يفعل واحد. من أجل وضع بروتوكول فعال، تم تحليل آثار transfection على الخلايا السرطانية الكامنة؛ تم اختبار اثنين من كميات مختلفة من الكاشف والكفاءة تم تقييمها مع plasmid مراسل GFP. وأسفرت كميات أقل من الكاشف عن زيادة كفاءة نقل الملوثات.وكان لا بد من تنفيذ بروتوكول من خطوتين لتنفيذ transfection على الخلايا في التعليق. تم إجراء عملية نقل على الخلايا المتصّنة وبعد 24 ساعة تم فصلها ومطلوها في التعليق؛ وبعد سبعة أيام، كانت الفرائح السرطانية الخاضعة للرقابة تعبر عن GFP. بعد الحصول على أورامفيرز، وعلاجها، وزرعها فمن الممكن لمقارنة تأثير هذا العلاج المختلفة في نمو الورم في الجسم الحي.وستتيح هذه الطرق للعلماء الإجابة على الأسئلة التي لا تزال قائمة في الخلية الأصلية للrhabdomyosarcomas مع وضع الأساس لفحص المخدرات في الوقت نفسه.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

من المنتج الطبيعي إلى Its العنقودية السكروز جين: تظاهرة طريق Polyketomycin من<em&gt; السبحية diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

أتاك-seq المقايسة مع الحمض النووي منخفضة التلوث من الابتدائي البشرية CD4 + تي الخلايا اللمفية

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

بروتوكول في المختبر لتقييم مستويات MicroRNA، وظائف، والجينات المستهدفة المرتبطة بها في الخلايا السرطانية

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

جيل من الأعضاء الورم من نماذج الماوس المهندسة وراثيا من سرطان البروستاتا

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

استخدام الخلايا السرطانية الثديية الماوس في مختبر الغزو الاختباري كمقياس لسلوك الخلايا الأنكجينية

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...