Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch das Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11 und den NIH Pilot Grant im Rahmen des NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199 an A.S. unterstützt.

Das Gehäuse, die Behandlung und das Opfer von Mäusen wurden nach dem genehmigten IACUC-Protokoll des Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute durchgeführt.
1. Reagenzzubereitung
<ol><li>Bereiten Sie 100 ml Zellisolationsmedien vor: F10 Medium ergänzt mit 10% Pferdeserum (HS).</li>
	<li>50 ml Kollagenase Typ II Lösung vorbereiten: 1 g Kollagenase Typ II Pulver in 50 ml Zellisolationsmedien auflösen (beachten Sie die Einheiten des Enzyms pro 1 ml Medium, da sich die Anzahl der ...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

Mehrere Methoden wurden für die Isolierung und Charakterisierung von TPCs aus Tumor heterogenen Zellpopulationen eingesetzt: Tumor-Clonogene-Assays, FACS-Isolation und Tumorsphärenbildung. Der Tumor-Clonogen-Assay wurde erstmals 1971 beschrieben, für Stammzellstudien verwendet und erst später auf die Krebsbiologieangewendet 29,30. Diese Methode basiert auf der intrinsischen Eigenschaft der Krebsstammzellen, um sich ohne Einschränkungen in weichen Gelkulturen...

Krebs ist eine heterogene Krankheit; darüber hinaus kann die gleiche Art von Tumor verschiedene genetische Mutationen bei verschiedenen Patienten darstellen, und innerhalb eines Patienten wird ein Tumor aus mehreren Populationen von Zellen1zusammengesetzt. Heterogenität stellt eine Herausforderung bei der Identifizierung von Zellen dar, die für die Initiierung und Verbreitung von Krebs verantwortlich sind, aber ihre Charakterisierung ist für die Entwicklung effizienter Behandlungen von entscheidender Bedeutung. Der Begriff der Tumor-Vermehrungszellen (TPC), eine seltene Population von Zellen, die zur Tumorentwicklung beitragen, wurde zuvor ausführlich überprüft2. Trotz der Tatsache, dass TPCs bei mehreren Krebsarten charakterisiert wurden, bleibt die Identifizierung von Markern für ihre zuverlässige Isolierung eine Herausforderung für mehrere Tumortypen3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. So kann ein Verfahren, das sich nicht auf molekulare Marker stützt, sondern auf TPC-Funktionseigenschaften (hohe Selbsterneuerung und die Fähigkeit, unter Niedriganhaftungsbedingungen zu wachsen), bekannt als Tumorsphärenbildungstest, weit verbreitet für die Identifizierung von TPCs aus den meisten Tumoren. Wichtig ist, dass dieser Assay auch für die Erweiterung von TPCs eingesetzt werden kann und somit direkt auf Krebsmedikamenten-Screening und Studien zur Krebsresistenz1,10angewendet wird.
Rhabdomyosarkom (RMS) ist eine seltene Form von Weichteilsarkom am häufigsten bei kleinen Kindern11. Althoug RMS kann durch die Beurteilung der Expression myogener Marker histologisch identifiziert werden, die RMS-Ursprungszelle wurde aufgrund der multiplen Tumorsubtypen und der hohen Heterogenität der Tumorentwicklungsreize nicht eindeutig charakterisiert. Tatsächlich haben neuere Studien eine signifikante wissenschaftliche Diskussion darüber ausgelöst, ob RMS myogene oder nicht myogene Ursprünge hat, was darauf hindeutet, dass RMS je nach Kontext12,13 von verschiedenen Zelltypen stammen kann. 14 , 15 , 16 , 17. Zahlreiche Studien an RMS-Zelllinien wurden mit dem Tumorsphärenbildungstest zur Identifizierung von Pfaden durchgeführt, die an der Tumorentwicklung und der Charakterisierung von Markern beteiligt sind, die mit stark selbsterneuernden Populationen assoziiert sind. 18 , 19 , 20 , 21.
Trotz des Potenzials des Tumorsphärenbildungs-Assays zur Identifizierung von RMS-Ursprungszellen wurde jedoch noch keine zuverlässige Methode beschrieben, die auf primären RMS-Zellen angewendet werden kann. In diesem Zusammenhang verwendete eine aktuelle Studie unserer Gruppe einen optimierten Tumorsphärenbildungstest zur Identifizierung der RMS-Ursprungszellen in einem Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) Mausmodell22. Mehrere prätumorogene Zelltypen, die aus Muskelgeweben isoliert sind, werden auf ihre Fähigkeit getestet, unter bedingungen mit geringer Anhaftung zu wachsen, was die Identifizierung von Muskelstammzellen als Ursprungszellen für RMS in dystrophischen Kontexten ermöglicht. Beschrieben wird hier ein reproduzierbares und zuverlässiges Protokoll für den Tumorsphärenbildungstest (Abbildung 1), das erfolgreich zur Identifizierung extrem seltener Zellpopulationen eingesetzt wurde, die für die Entwicklung von Maus-RMS verantwortlich sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarkom (RMS) ist das häufigste Weichteilsarkom bei Kindern. Obwohl erhebliche Anstrengungen die Identifizierung gemeinsamer Mutationen im Zusammenhang mit RMS ermöglicht haben und die Diskriminierung verschiedener RMS-Subtypen ermöglicht haben, bestehen nach wie vor große Herausforderungen für die Entwicklung neuartiger Behandlungen, um die Prognose weiter zu verbessern. Obwohl durch die Expression myogener Marker identifiziert, gibt es immer noch erhebliche Kontroversen darüber, ob RMS myogene oder nicht-myogene Ursprünge hat, da die Ursprungszelle immer noch schlecht verstanden wird. In der vorliegenden Studie wird eine zuverlässige Methode für den Tumorsphären-Assay für Maus-RMS bereitgestellt. Der Assay basiert auf funktionellen Eigenschaften von Tumorzellen und ermöglicht die Identifizierung seltener Populationen im Tumor mit tumorgenen Funktionen. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren zum Testen rekombinanter Proteine, zur Integration von Transfektionsprotokollen mit dem Tumorsphärentest und zur Bewertung von Kandidatengenen, die an der Tumorentwicklung und -wachstum beteiligt sind. Weiter beschrieben ist ein Verfahren zur Allograft-Transplantation von Tumorsphären in Empfängermäuse, um die tumorgene Funktion in vivozu validieren. Insgesamt ermöglicht die beschriebene Methode eine zuverlässige Identifizierung und Prüfung seltener RMS-Tumorenpopulationen, die auf RMS angewendet werden können, die in verschiedenen Kontexten auftreten. Schließlich kann das Protokoll als Plattform für das Screening von Arzneimitteln und die zukünftige Entwicklung von Therapeutika genutzt werden.

Tumorsphären-Erkennung Die Zellisolation wurde optimiert, um die maximale Heterogenität der im Tumorgewebe vorhandenen Zellpopulationen zu erhalten. Erstens, da isolierte Gewebe morphologisch unterschiedliche Bereiche präsentierten, um die Chancen der Isolierung einheitlicher seltener Zellpopulationen zu erhöhen, wurde eine Probenahme aus mehreren Bereichen des Tumors durchgeführt(Abbildung 1A, erstes Panel auf der linken Seite). Zwei...

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Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Mausrhabdomyosarkom Primärzellen, Tumorsphärenbildung und -behandlung und Allograft-Transplantation ausgehend von Tumorsphärenkulturen.

Tumorsphäre Ableitung und Behandlung von primären Tumorzellen isoliert von Maus Rhabdomyosarkomen

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Rhabdomyosarkom ist eine seltene Form von Weichteilsarkomen, die histologisch durch Gewebemorphologie und die Expression myogener Marker gekennzeichnet sind. Angesichts der Existenz verschiedener Subtypen dieser Tumoren und der Heterogenität der Reize, die zu ihrer Entstehung beitragen, war die Identifizierung der Ursprungszelle jedoch eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir reproduzierbare und zuverlässige Methoden zur Identifizierung der Ursprungszelle von Rhabdomyosarkomen ausgehend von frisch geernteten Tumorgeweben von Mäusen und dieser Test ist der Tumorsphärenbildungstest.Die Hauptvorteile des Tumorsphärenbildungs-Assays ist, dass er auf zellulären Eigenschaften beruht, von denen bekannt ist, dass sie in Tumorursprungszellen vorhanden sind, und es kann auch für die Expansion und Anreicherung der spezifischen Zellpopulation verwendet werden. Darüber hinaus imitiert seine Sphäroidstruktur die Tumorumgebung, so dass sie als Arzneimittel-Screening-Studien verwendet werden können. Diese Methode hat das Potenzial, auf andere Arten von Tumoren angewendet werden, weil es keine Vorkenntnisse der molekularen Marker erfordert, aber es kann eine Optimierung der Kulturbedingungen erfordern.Tumorsphäre kann einige Zeit dauern, um sich zu bilden, vor allem, wenn sie versuchen, eine seltene Zellpopulation in Ihrem Tumor zu identifizieren. Daher wird nicht vorgeschlagen, Ihre Subkulturplatte jeden Tag zu betrachten, da sie sich negativ auf die Ergebnisse Ihrer Experimente auswirken könnte. Beginnen Sie mit dem Aufwärmen einer 10-Zentimeter-Platte mit fünf Milliliter Isolationsmedien in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.Wiegen Sie 500 bis 1.000 Milligramm des Tumorgewebes und legen Sie es in die Platte. Bringen Sie die Platte mit dem Tumorgewebe zu einer sterilen Kulturhaube und zerkleinern Sie sie mit einer Rasierklinge. Für eine optimale Verdauung stellen Sie sicher, dass die Größen der Hackstücke einheitlich sind.Übertragen Sie das Hackfleisch- und Zellisolationsmedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr. Waschen Sie die Platte mit weiteren vier Milliliter Medien und fügen Sie diese in die Röhre. Fügen Sie 700 Einheiten pro Milliliter Kollagenase-Lösung in das Rohr und inkubieren Sie es in einem schüttelnden Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 1 1/2 Stunden.Nach der Inkubation das Gewebe bei 300 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur abdrehen. Den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören, dann das Pellet in 10 Millilitern zweiter Verdauungslösung wieder aufhängen und im schütteren den Wasserbad noch 30 Minuten brüten lassen. Nach der zweiten Verdauung die Zellsuspension nach oben und unten pipetteundieren und durch einen 70-Mikrometer-Nylonfilter auf einem 50-Milliliter-Zentrifugenrohr passieren.Dann waschen Sie den Filter mit 10 Milliliterzellisolationsmedien und drehen Sie das Gewebe bei 300 mal g für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 20 Milliliter Tumorzellmedien wieder auf. Übertragen Sie die Suspension auf eine 15-Zentimeter-Kulturplatte und legen Sie die Zellen über Nacht in einen 37 Grad Celsius Inkubator.Ändern Sie am nächsten Tag die Medien, um Trümmer und abgestorbene Zellen zu entfernen, die das Zellüberleben negativ beeinflussen können. Bewerten Sie an dieser Stelle die Zellkonfluenz und lassen Sie die Zellen im Inkubator wachsen, bis sie 90 % erreichen, um die Zellen jeden Tag zu überwachen und die Medien alle zwei Tage zu wechseln. Verwenden Sie für die Tumorsphärenableitung Zellen an Passage P1 oder P2, um die Zellauswahl durch mehrere Passagen zu vermeiden.Waschen Sie die Zellschale mit PBS und bedecken Sie sie dann mit Ablösungslösung. Legen Sie sie fünf bis zehn Minuten in den Inkubator und bestätigen Sie dann die Ablösung, indem Sie die Platte unter einem Hellfeldmikroskop betrachten. Sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie der Platte Tumorzellmedien hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenrohr.Drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 300 mal g nach unten, entfernen Sie Überstand und suspendieren Sie die Zellen in Tumorsphärenmedien. Nach dem Erneuten Aussetzen der Zellen, zählen Sie sie mit Trypan blau und berechnen Sie die Zellkonzentration. Die richtige Anzahl von Zellen in einer 96-well Low-Attachment-Platte zu verfestigen und die Zellen bis zum Ende des Experiments in den Inkubator legen, wobei darauf geachtet wird, die Platte nicht zu stören, es sei denn, die Medien werden wieder aufgefüllt.Identifizieren Sie nach Abschluss des Experiments Tumorsphären manuell unter einem Hellfeldmikroskop oder mit der Celigo-Software. Die Anzahl und Größe der Tumorsphären kann als Ergebnis dieses Assays ausgewertet werden. Um Tumorsphären für eine Allograft-Transplantation vorzubereiten, ziehen Sie alle Tumorsphären zusammen, die aus einem bestimmten Zelltyp oder einer bestimmten Behandlung gewonnen werden.Zentrifugieren Sie die Tumorsphären und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Ein-Millimeter-Pipette, gefolgt von einer 200-Mikroliter-Pipette, und waschen Sie sie dann mit 10 Millilitersterilen PBS. Drehen Sie die Tumorsphären wieder nach unten und aspirieren Sie das PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter zu einem Milliliter Zellablösung auf dem Tumorsphärenpellet hinzu und bebrüten die Zellen in einem schüttelenden Wasserbad bei 37 Grad Celsius.Überprüfen Sie den Verlauf der Verdauung alle 10 Minuten. Der gesamte Prozess vorgangsbereit und dauert bis zu 30 Minuten. Wenn die Verdauung der Tumorsphäre im schüttenden Wasserbad nicht ausreicht, um eine einzellige Lösung zu erhalten, wird eine mechanische Störung durch Pipettieren nach oben und unten vorgeschlagen.Beachten Sie, dass nach dem Spinnen die Tumorsphären kein stabiles Pellet bilden, daher sollte die Ansaugung des Überstandes sorgfältig mit einer Ein-Milliliter-Pipette und 200-Mikroliter-Pipetten erfolgen. Sobald eine einzellige Lösung erhalten ist, fügen Sie ein Volumen von Tumorzellmedien hinzu und drehen Sie es bei 300 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius nach unten. Nach dieser Zentrifugation müssen alle nachfolgenden Schritte auf Eis durchgeführt werden.Setzen Sie die Zellen in kalten Tumorzellenmedien wieder aus und zählen Sie lebende Zellen mit Trypan-Blauausschluss. Bestimmen Sie die richtige Anzahl von Zellen für das Allograft und verdünnen Sie es in 50 Mikroliter kalter Tumorzellenmedien. Legen Sie eine Pipettenspitze in kalte Tumorzellenmedien, um sie zu kühlen und verwenden Sie sie dann, um 50 Mikroliter kalte ECM-Lösung zu nehmen und fügen Sie sie mit Zellen in das Rohr, wobei Sie sicherstellen, dass das ECM-Rohr während dieses Prozesses nicht vom Eis entfernt wird.Bewahren Sie die Zellen bis zur Transplantation auf Eis und legen Sie eine gedeckelte 0,5-Milliliter-Insulinspritze mit einer 29-Spur-Nadel auf Eis. Nach der Bestätigung, dass die Maus richtig anästhesisiert wurde, rasieren Sie die rechte Seite des Tieres, aspirieren Sie die Zelllösung in die gekühlte Spritze und injizieren Sie die Zellen subkutan in den rasierten Bereich. Wenn die Injektion korrekt durchgeführt wird, bildet sich unter der Haut eine sichtbare Beule.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zuverlässig Tumorsphären zur Identifizierung seltener Zellpopulationen zu bilden, die für die Entwicklung von Weichgewebesarkomen verantwortlich sind. Ein wesentlicher Teil dieses Assays ist die Diskriminierung zwischen Tumorsphären und Zellclustern, die deutliche morphologische Unterschiede aufweisen. Um die optimale Konzentration zu bestimmen, bei der ein Protein von Interesse eine Wirkung auf Tumorzellen auslöst, ist es notwendig, den Grad der Expression der nachgelagerten Ziele des Proteins zu bewerten.Drei der getesteten Gene zeigten eine dosisabhängige Reaktion auf die rekombinante Proteinbehandlung, und eines nicht. Um ein effizientes Protokoll zu etablieren, wurden die Auswirkungen der Transfektion auf inhärente Tumorzellen analysiert;zwei verschiedene Mengen an Reagenz wurden getestet und die Effizienz mit einem GFP-Reporter-Plasmid bewertet. Geringere Reagenzmengen führten zu einer höheren Transfektionseffizienz.Ein zweistufiges Protokoll musste implementiert werden, um die Transfektion von Zellen in Suspension durchzuführen. Transfektion wurde an an haftenden Zellen durchgeführt und 24 Stunden später wurden sie abgelöst und in Suspension plattiert; nach sieben Tagen drückten kontrollierte Tumorsphären GFP aus. Nach der Erzielung, Behandlung und Transplantation von Tumorsphären ist es möglich, die Wirkung dieser unterschiedlichen Behandlung beim Tumorwachstum in vivo zu vergleichen.Diese Methoden werden es den Wissenschaftlern ermöglichen, die noch immer stehenden Fragen der Herkunftszelle von Rhabdomyosarkomen zu beantworten und gleichzeitig die Grundlage für das Drogenscreening zu legen.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Forschung

Genetik

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generation von Krebs Zellklonen Telomeric Repeat-haltigen RNA TERRA von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt zu visualisieren

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-Seq-Assay mit niedrigen mitochondriale DNA Kontamination von primären menschlichen CD4 + T-Lymphozyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...