Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק אליסון הקרן רפואי המענק AG-NS-0843-11, ואת מענק הפיילוט NIH בתוך מרכז הסרטן NCI תמיכה גרנט P30CA030199. ס. י.

הדיור, הטיפול והקרבת העכברים בוצעו בעקבות פרוטוקול IACUC מאושר של מכון הגילוי הרפואי סנפורד ברנהם.
1. הכנה מגיב
<ol><li>להכין 100 mL של בידוד התא מדיה: מדיום F10 בתוספת עם 10% סרום סוסים (HS).</li>
	<li>הכינו 50 mL של הפתרון השני של הקולגן מסוג II: לפזר 1 גרם של אבקת קולגן סוג II ב 50 mL של מדיה בידוד הת?...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+liver+cancer+stem+cells.">Molecular biology of liver cancer stem cells.</a> Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).</li><li>Crous, A. M., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+stem+cells+and+low-intensity+laser+irradiation:+a+potential+future+therapy.">Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (5), 129 (2013).</li><li>Tomao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+molecular+profiles+of+ovarian+cancer:+an+update+on+cancer+stem+cells.">Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells.</a> Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).</li><li>Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+stem+cells:+new+insight+into+a+stubborn+disease.">Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease.</a> Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).</li><li>Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+prostate+cancer+stem+cells:+markers+and+methods.">Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorsphere+as+an+effective+in+vitro+platform+for+screening+anti-+cancer+stem+cell+drugs.">Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs.</a> Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).</li><li>Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+adult+and+pediatric+rhabdomyosarcoma+in+the+surveillance,+epidemiology+and+end+results+program.">Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).</li><li>Blum, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+transducer+YAP1+transforms+activated+satellite+cells+and+is+a+potent+effector+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+formation.">The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation.</a> Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).</li><li>Hatley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+rhabdomyosarcoma+originating+from+the+adipocyte+lineage.">A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage.</a> Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).</li><li>Drummond, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

שיטות מרובות מועסקים לבידוד ואפיון של TPCs מן הגידול אוכלוסיות תאים הטרוגנית: הגידול clonogenic assays, בידוד FACS, ו-tumorsphere שיטת היווצרות. שיטת הגידול clonogenic תוארה לראשונה ב 1971, משמש ללימודי תאי גזע, ורק לאחר מכן להחיל על הביולוגיה סרטן29,30. שיטה זו מבוססת על תאי גזע סרטן ה...

סרטן היא מחלה הטרוגנית; יתר על כן, אותו סוג של גידול יכול להציג מוטציות גנטיות שונות בחולים שונים, ובתוך החולה גידול מורכב על ידי אוכלוסיות מרובות של תאים1. טרוגניות מציג אתגר בזיהוי של תאים האחראים על ייזום והפצת סרטן, אבל האפיון שלהם חיוני לפיתוח של טיפולים יעילים. הרעיון של הגידול תאים הפצת (TPC), אוכלוסייה נדירה של תאים שתורמים להתפתחות הגידול, כבר נבדקו בעבר בהרחבה2. למרות העובדה tpcs התאפיין בסוגים מרובים של סרטן, זיהוי של סמנים עבור בידוד אמין שלהם נשאר אתגר עבור מספר סוגי גידולים3,4,5,6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9. Thus, שיטה שאינה נשענת על סמנים מולקולריים אלא על תכונות פונקציונליות tpc (התחדשות עצמית גבוהה ויכולת לצמוח בתנאים בעלי קבצים מצורפים נמוכים), המכונה שיטת היווצרות tumorsphere, ניתן להחיל נרחב על ה זיהוי של TPCs מרוב הגידולים. חשוב מכך, שיטת הפעולה יכולה גם להיות מועסק להרחבת tpcs ובכך להחיל ישירות על הקרנת תרופות לסרטן ומחקרים על התנגדות לסרטן1,10.
הרדויוסרקומה (RMS) היא צורה נדירה של סרקומה של רקמה רכה הנפוצה ביותר בילדים צעירים11. לאחר ההערכה ניתן לזהות היסטולוגית באמצעות הערכת הביטוי של סמנים מיוגניים, תא RMS של המקור לא כבר univocally מאופיין בשל תת הסרטניים מרובים טרוגניות גבוהה של גירויים התפתחותיים הגידול. ואכן, מחקרים שנעשו לאחרונה יצרו דיון מדעי משמעותי על האם rms הוא של מקורות מיוגניים או לא מיוגניים, הרומז כי rms עשוי לנבוע מסוגי תאים שונים בהתאם להקשר12,13, מיכל בן 14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , 17. מחקרים רבים על קווי התאים של RMS בוצעו באמצעות שיטת היווצרות tumorsphere לזיהוי של מסלולים מעורבים בפיתוח הגידול ואפיון של סמנים הקשורים לאוכלוסיות התחדשות עצמית מאוד מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , . עשריםואחד
עם זאת, למרות היכולת של היווצרות הצורה tumorsphere לזיהוי תאי RMS של המקור, שיטה אמינה שניתן ליישם בתאי RMS ראשוניים עדיין לא תוארה. בהקשר זה, מחקר שנערך לאחרונה מהקבוצה שלנו מועסקים שיטת היווצרות ממוטבת tumorsphere לזיהוי של תאי RMS המקור ב ניוון שרירים Duchenne (DMD) העכבר מודל22. סוגים מרובים של תא מראש, מבודדים מרקמות שרירים, נבדקים על יכולתם לצמוח בתנאים מצורפים נמוכה, המאפשר זיהוי של תאי גזע שריר כמו תאים של מוצא RMS בהקשרים הדיסטרומכולה. מתואר כאן הוא פרוטוקול מהימן ואמין עבור שיטת היווצרות tumorsphere (איור 1), אשר הועסק בהצלחה לזיהוי של אוכלוסיות תאים נדירים ביותר האחראים לפיתוח העכבר RMS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

הרדויוסרקומה (RMS) הוא סרקומה רקמת רך השכיח ביותר אצל ילדים. למרות מאמצים משמעותיים אפשרו זיהוי של מוטציות נפוצות הקשורות RMS ומותר אפליה של תתי סוגים שונים, האתגרים העיקריים עדיין קיימים לפיתוח של טיפולים חדשניים כדי לשפר עוד יותר פרוגנוזה. למרות שהוא מזוהה על ידי הביטוי של סמנים מיוגניים, יש עדיין מחלוקת משמעותית על האם RMS יש מקורות או לא מזוגניים, כמו תא המוצא עדיין מובן בצורה גרועה. במהלך המחקר הנוכחי, שיטה אמינה מסופקת עבור הספק הטמורספירה עבור העכבר RMS. המנה מבוססת על תכונות פונקציונליות של תאים סרטניים ומאפשרת זיהוי של אוכלוסיות נדירות בגידול עם פונקציות tuמוריגניים. מתוארים גם הליכים עבור בדיקות רקומביננטי חלבונים, שילוב פרוטוקולי החצייה עם שיטת tumorsphere, והערכת גנים המועמדים המעורבים בפיתוח וצמיחה הגידול. תיאר עוד הוא הליך השתלת השתלת של tumorspheres לתוך עכברי הנמען כדי לאמת את הפונקציהtumorspheres ב vivo. באופן כללי, השיטה המתוארת מאפשרת זיהוי ובדיקה אמינים של אוכלוסיות מתוגני מחלות מחלות שניתן להחילם על RMS העולות בהקשרים שונים. לבסוף, הפרוטוקול יכול להיות מנוצל כפלטפורמה עבור הקרנת סמים ופיתוח עתידי של therapeutics.

כדורי טומורזה בידוד התא היה אופטימיזציה כדי לקבל את הטרוגניות המרבי של אוכלוסיות תאים נוכח רקמת הגידול. ראשית, מאז רקמות מבודדות הציגו אזורים שונים מורפולוגית, כדי לשפר את הסיכויים לבודד אוכלוסיות תאים נדירים, הדגימה בוצעה מאזורים מרובים של הגידול (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

פרוטוקול זה מתאר שיטה המיומנת לבידוד של תאים ראשוניים של העכבר השרירים, היווצרות tumorsphere וטיפול, השתלת השתלת החל בתרבויות tumorsphere.

והטיפול מתאי הגידול הראשוניים מבודדים מעכבר תמס שריר

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Rhabdomyosarcoma היא צורה נדירה של סרקומס רקמות רכות המאופיינת בהיסטולוגיה על ידי מורפולוגיה של רקמות והביטוי של סמנים מיוגניים. עם זאת, בהתחשב בקיומם של תת-סוגים שונים של גידולים אלה ואת ההטרוגניות של הגירויים התורמים להיווצרותו, זיהוי תא המקור היה מאתגר מאוד. כאן אנו מתארים שיטות לשחזור ואמין לזיהוי התא של מקור rhabdomyosarcomas החל רקמות גידול קציר טרי מעכברים וראיה זו היא בדיקה היווצרות הגידול.היתרונות העיקריים של היווצרות tumorsphere assay היא כי היא מסתמכת על תכונות הסלולר כי ידועים להיות נוכח בתאים שמקורם בגידול וזה יכול לשמש גם עבור התרחבות והעשרה של אוכלוסיית התא הספציפי. יתר על כן, המבנה הכדורידי שלה לחקות את סביבת הגידול, ולכן הם יכולים לשמש מחקרים הקרנת סמים. שיטה זו יש פוטנציאל להיות מיושם על סוג אחר של גידולים כי זה לא דורש ידע מוקדם של סמנים מולקולריים אבל זה עשוי לדרוש אופטימיזציה של תנאי התרבות.Tumorsphere עשוי לקחת קצת זמן כדי ליצור, במיוחד אם מנסה לזהות אוכלוסיית תאים נדירים בתוך הגידול שלך. לכן, זה לא הציע להסתכל על צלחת תת-תרבות שלך כל יום, שכן זה עלול להשפיע לרעה על תוצאות הניסויים שלך. התחל על ידי חימום צלחת 10 ס"מ עם חמישה מיליליטר של תקשורת בידוד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.לשקול 500 עד 1,000 מיליגרם של רקמת הגידול ולמקום אותו בצלחת. הביאו את הצלחת עם רקמת הגידול למכסה המנוע של התרבות הסטרילית וטחון אותה עם סכין גילוח. לעיכול אופטימלי, יש לוודא כי הגדלים של חתיכות טחון הם אחידים.מעבירים את הרקמה הטחון ומדיית בידוד התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לשטוף את הצלחת עם עוד ארבעה מיליליטר של מדיה ולהוסיף את זה לצינור. מוסיפים 700 יחידות למיליליטר של תוסף קולגן לצינור ומדרגים אותו באמבט מים רועד ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.לאחר הדגירה, לסובב את הרקמה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי מבלי לשבש את גלולת הכדור, ולאחר מכן תוכלו להשתמש שוב את גלולה ב 10 מיליליטר של פתרון עיכול השני דגירה באמבט מים רועדים במשך 30 דקות נוספות. לאחר העיכול השני, פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה ולהעביר אותו דרך מסנן ניילון 70 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.ואז לשטוף את המסנן עם 10 מיליליטר של מדיה בידוד התא ולסובב את הרקמה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולה ב 20 מיליליטר של מדיה תאים סרטניים. מעבירים את ההשעיה לצלחת תרבות של 15 ס"מ וממקמים את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס בן לילה.למחרת, לשנות את התקשורת כדי להסיר פסולת ותאים מתים שעלולים להשפיע לרעה על הישרדות התא. בשלב זה, להעריך את confluency התא ולאפשר לתאים לגדול באינקובטור עד שהוא מגיע 90% לפקח על התאים כל יום ולשנות את המדיה כל יומיים. עבור נגזרת tumorsphere, להשתמש בתאים במעבר P1 או P2 כדי למנוע בחירת תאים דרך מעברים מרובים.לשטוף את צלחת התא עם PBS ולאחר מכן לכסות אותם עם פתרון ניתוק. מניחים אותם באינקובטור במשך חמש עד 10 דקות ולאחר מכן לאשר ניתוק על ידי התבוננות בצלחת תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר התאים התנתקו, להוסיף מדיה תא הגידול לצלחת ולהעביר את ההשעיה התא צינור צנטריפוגה.לסובב את התאים למטה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות, להסיר על טבעי, ו resuspend התאים במדיה tumorsphere. לאחר שימוש חוזר בתאים, לספור אותם באמצעות כחול Trypan ולחשב את ריכוז התא. צלחת המספר הנכון של תאים בצלחת 96-גם קובץ מצורף נמוך למקם את התאים באינקובטור עד סוף הניסוי, דואג לא להפריע את הצלחת אלא אם כן חידוש התקשורת.לאחר השלמת הניסוי, זהה גידולים באופן ידני תחת מיקרוסקופ שדה בהיר או באמצעות תוכנת Celigo. ניתן להעריך את המספר והגודל של הגידולים כתוצאה מהערכה זו. כדי להכין גידולים להשתלת allograft, למשוך יחד את כל הגידולים המתקבלים סוג תא מסוים או טיפול.צנטריפוגה את הגידולים בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה מילימטר אחד ואחריו פיפטה 200 מיקרוליטר, ולאחר מכן לשטוף אותם עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי. לסובב את הגידולים למטה שוב ולופות PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטרים למיליליטר אחד של ניתוק תאים על גבי גלולת הגידולים ומטרים את התאים באמבט מים רועד ב-37 מעלות צלזיוס.בדוק את התקדמות העיכול כל 10 דקות. התהליך כולו לוקח עד 30 דקות. אם עיכול של tumorsphere באמבט מים רועדים אינו מספיק כדי להשיג פתרון חד-תאי, הפרעה מכנית באמצעות צינור למעלה ולמטה מוצע.שים לב כי לאחר ספינינג tumorspheres אינם יוצרים גלולה יציבה, כך שאספירה supernatant צריך להיעשות בזהירות עם פיפטה מיליליטר אחד ו 200 מיקרוליטר פיפטות. לאחר פתרון חד-תאי מתקבל, להוסיף נפח של מדיה תא הגידול ולסובב אותו למטה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה זו, כל השלבים הבאים חייבים להתבצע על קרח.השתמשו שוב בתאים במדיה של תאים סרטניים קרים וספירת תאים חיים באמצעות הדרה כחולה של טריפאן. לקבוע את המספר הנכון של תאים עבור allograft לדלל אותו 50 microliters של מדיה תאים סרטניים קרים. מניחים טיפ פיפטה במדיה תא גידול קר כדי לקרר אותו ולאחר מכן להשתמש בו כדי לקחת 50 microliters של פתרון ECM קר ולהוסיף אותו לצינור עם תאים, הקפדה לא להסיר את צינור ECM מקרח במהלך תהליך זה.לשמור על התאים על קרח עד ההשתלה ולה מניחים מכוסה, 0.5 מיליליטר מזרק אינסולין עם מחט 29 מד על קרח. לאחר אישור כי העכבר כבר הרדמה כראוי, לגלח את הצד הימני של החיה, לשאוף את פתרון התא לתוך המזרק מקורר, ולהזריק את התאים תת עורית לתוך האזור המגולח. אם ההזרקה מבוצעת כראוי, בליטה גלויה תיוופס מתחת לעור.פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ליצור באופן אמין גידולים לזיהוי אוכלוסיות תאים נדירים האחראים על פיתוח סרקומה רקמות רכות. חלק מהותי מהצגה זו הוא אפליה בין גידולים ואשכולות תאים, אשר מפגינים הבדלים מורפולוגיים ברורים. כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי שבו חלבון של עניין מפעיל השפעה על תאים סרטניים, יש צורך להעריך את רמת הביטוי של מטרות במורד הזרם של החלבון.שלושה מהגנים שנבדקו הראו תגובה תלוית מינון לטיפול בחלבון רקומביננטי ואחד לא. על מנת להקים פרוטוקול יעיל, ההשפעות של transfection על תאים סרטניים אינהרנטי נותחו;שתי כמויות שונות של רהט נבדקו ויעילות הוערכה עם פלסמיד GFP-כתב. כמויות נמוכות יותר של רגנט גרמו ליעילות גבוהה יותר של ההמרה.היה צריך ליישם פרוטוקול דו-שלם כדי לבצע חילוף על תאים בהשעיה. Transfection בוצע על תאים חסידים ו 24 שעות לאחר מכן הם היו מנותקים מצופים בהשעיה;לאחר שבעה ימים, גידולים מבוקרים היו מבטאים GFP. לאחר גידולים מתקבלים, מטופלים, מושתלים ניתן להשוות את ההשפעה של טיפול שונה זה בגידול בגידול vivo.שיטות אלה יאפשרו למדענים לענות על השאלות שעדיין עומדות של תא המוצא של rhabdomyosarcomas בעת ובעונה אחת הגדרת הבסיס להקרנת סמים.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

ממוצר טבעי כדי המצרר שלו biosynthetic ג&#39;ין: הפגנה שימוש Polyketomycin מ<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...