Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Ellison Medical Foundation AG-NS-0843-11, e dal NIH Pilot Grant all'interno del NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199 ad A.S.

L'alloggio, il trattamento e il sacrificio dei topi sono stati eseguiti in seguito al protocollo Approvato IACUC del Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. Preparazione del reagente
<ol><li>Preparare 100 mL di supporti di isolamento cellulare: F10 medio integrato con 10% siero di cavallo (HS).</li>
	<li>Preparare 50 mL di soluzione di collagenasi di tipo II: sciogliere 1 g di polvere di collagenae di tipo II in 50 mL di supporto di isolamento cellulare (notare le unità dell'...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+liver+cancer+stem+cells.">Molecular biology of liver cancer stem cells.</a> Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).</li><li>Crous, A. M., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+stem+cells+and+low-intensity+laser+irradiation:+a+potential+future+therapy.">Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (5), 129 (2013).</li><li>Tomao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+molecular+profiles+of+ovarian+cancer:+an+update+on+cancer+stem+cells.">Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells.</a> Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).</li><li>Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+stem+cells:+new+insight+into+a+stubborn+disease.">Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease.</a> Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).</li><li>Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+prostate+cancer+stem+cells:+markers+and+methods.">Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorsphere+as+an+effective+in+vitro+platform+for+screening+anti-+cancer+stem+cell+drugs.">Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs.</a> Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).</li><li>Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+adult+and+pediatric+rhabdomyosarcoma+in+the+surveillance,+epidemiology+and+end+results+program.">Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).</li><li>Blum, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+transducer+YAP1+transforms+activated+satellite+cells+and+is+a+potent+effector+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+formation.">The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation.</a> Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).</li><li>Hatley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+rhabdomyosarcoma+originating+from+the+adipocyte+lineage.">A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage.</a> Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).</li><li>Drummond, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

Sono stati impiegati diversi metodi per l'isolamento e la caratterizzazione dei TPC dalle popolazioni cellulari eterogenee tumorali: saggi clonogenici tumorali, isolamento FACS e saggio di formazione della tumorsferae. L'asino clonogenico del tumore è stato descritto per la prima volta nel 1971, utilizzato per studi sulle cellule staminali, e solo successivamente applicato alla biologia del cancro29,30. Questo metodo si basa sulla proprietà intrinseca delle cel...

Il cancro è una malattia eterogenea; inoltre, lo stesso tipo di tumore può presentare diverse mutazioni genetiche in pazienti diversi, e all'interno di un paziente un tumore è composto da più popolazioni di cellule1. L'eterogeneità rappresenta una sfida nell'identificazione delle cellule responsabili dell'avvio e della propagazione del cancro, ma la loro caratterizzazione è essenziale per lo sviluppo di trattamenti efficienti. La nozione di cellule che propagano il tumore (TPC), una rara popolazione di cellule che contribuiscono allo sviluppo del tumore, è stata precedentemente ampiamente rivista2. Nonostante il fatto che i TPC siano stati caratterizzati in più tipi di cancro, l'identificazione dei marcatori per il loro isolamento affidabile rimane una sfida per diversi tipi di tumore3,4,5,6 , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9.Così, un metodo che non si basa su marcatori molecolari, ma piuttosto sulle proprietà funzionali del TPC (alto auto-rinnovamento e la capacità di crescere in condizioni di basso attaccamento), noto come analisi di formazione della tumorsfera, può essere ampiamente applicato per la l'identificazione dei TPC dalla maggior parte dei tumori. È importante sottolineare che questo saggio può anche essere impiegato per l'espansione dei TPC e quindi applicato direttamente allo screening farmacologico del cancro e agli studi sulla resistenza al cancro1,10.
Il rhabdomyosarcoma (RMS) è una rara forma di sarcoma dei tessuti molli più comune nei bambinipiccoli 11. Althoug RMS può essere identificata istologicamente attraverso la valutazione dell'espressione dei marcatori miogenici, la cellula RMS di origine non è stata caratterizzata in modo univoco a causa dei sottotipi tumorali multipli e dell'alta eterogeneità degli stimoli dello sviluppo tumorale. Ineffetti, studi recenti hanno generato una significativa discussione scientifica sul fatto che RMS sia di origine miogenica o non miogenica, suggerendo che RMS possa derivare da diversi tipi di cellule a seconda del contesto12,13, 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17. Sono stati effettuati numerosi studi sulle linee cellulari RMS utilizzando il saggio di formazione della tumoresfera per l'identificazione delle vie coinvolte nello sviluppo tumorale e nella caratterizzazione dei marcatori associati a popolazioni altamente auto-rinnovate 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21.
Tuttavia, nonostante il potenziale del saggio di formazione della tumorsfera per identificare le cellule RMS di origine, non è ancora stato descritto un metodo affidabile che può essere impiegato nelle cellule RMS primarie. In questo contesto, un recente studio del nostro gruppo ha impiegato un analisi ottimizzata della formazione della tumorsfera per l'identificazione delle cellule RMS di origine in un modello murino Duchenne muscular dystrophy (DMD)22. Più tipi di cellule pre-tumorigene, isolate dai tessuti muscolari, sono testate per la loro capacità di crescere in condizioni di basso attaccamento, consentendo l'identificazione delle cellule staminali muscolari come cellule di origine per RMS in contesti distrofici. Descritto qui è un protocollo riproducibile e affidabile per il saggio di formazione della forma della tumorsferae (Figura 1), che è stato impiegato con successo per l'identificazione di popolazioni cellulari estremamente rare che sono responsabili dello sviluppo del mouse RMS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

Il rhabdomyosarcoma (RMS) è il sarcoma dei tessuti molli più comune nei bambini. Sebbene sforzi significativi abbiano permesso l'identificazione di mutazioni comuni associate al RMS e consentito la discriminazione di diversi sottotipi RMS, esistono ancora grandi sfide per lo sviluppo di nuovi trattamenti per migliorare ulteriormente la prognosi. Anche se identificato dall'espressione di marcatori miogenici, c'è ancora una controversia significativa sul fatto che RMS abbia origini miogeniche o non miogene, poiché la cellula di origine è ancora poco compresa. Nel presente studio, viene fornito un metodo affidabile per il saggio di biosfera per rms del topo. Il test si basa sulle proprietà funzionali delle cellule tumorali e consente l'identificazione di popolazioni rare nel tumore con funzioni tumorogene. Sono inoltre descritte le procedure per testare le proteine ricombinanti, integrare i protocolli di trasfezione con il test della biosfera e valutare i geni candidati coinvolti nello sviluppo e nella crescita del tumore. Descritto ulteriormente è una procedura per il trapianto di allotrapianto di sfere tumorali in topi riceventi per convalidare la funzione tumorale in vivo. Nel complesso, il metodo descritto consente l'identificazione e il test affidabili di popolazioni tumorigene RMS rare che possono essere applicate al RMS derivante in contesti diversi. Infine, il protocollo può essere utilizzato come piattaforma per lo screening farmacologico e lo sviluppo futuro delle terapie.

Rilevamento delle sfere tumorali L'isolamento cellulare è stato ottimizzato per ottenere la massima eterogeneità delle popolazioni cellulari presenti nel tessuto tumorale. In primo luogo, poiché i tessuti isolati presentavano aree morfologicamente dissimili, per aumentare le possibilità di isolare le popolazioni di cellule rare uniformi, il campionamento è stato eseguito da più aree del tumore(Figura 1A, primo pannello a sinistra). I...

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Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l'isolamento delle cellule primarie del thabdomyosarcoma del topo, la formazione e il trattamento della tumorsfera e il trapianto di allotrapianto a partire dalle colture di cellule di tumori.

Derivazione della sfera di tumore e trattamento da cellule tumorali primarie isolate da Rhabdomyosarcomas del topo

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Il rabdomiosarcoma è una rara forma di sarcomi dei tessuti molli caratterizzati istologicamente dalla morfologia dei tessuti e dall'espressione di marcatori miogenici. Tuttavia, data l'esistenza di diversi sottotipi di questi tumori e l'eterogeneità degli stimoli che contribuisce alla sua formazione, l'identificazione della cellula di origine è stata molto impegnativa. Qui descriviamo metodi riproducibili e affidabili per l'identificazione della cellula di origine dei rabdomiosarcomi a partire dai tessuti tumorali appena raccolti dai topi e questo test è il saggio di formazione della tumorsfera.I principali vantaggi del test di formazione della tumorsfera è che si basa su proprietà cellulari che sono note per essere presenti nelle cellule che originano il tumore e può anche essere utilizzato per l'espansione e l'arricchimento della specifica popolazione cellulare. Inoltre, la sua struttura sferoide imita l'ambiente tumorale, quindi possono essere utilizzati come studi di screening farmacologico. Questo metodo ha il potenziale per essere applicato ad altri tipi di tumori perché non richiede una conoscenza preliminare dei marcatori molecolari, ma può richiedere l'ottimizzazione delle condizioni di coltura.La tumorsfera può richiedere del tempo per formarsi, specialmente se si cerca di identificare una rara popolazione cellulare all'interno del tumore. Pertanto, non è suggerito di guardare la piastra di sottocultura ogni giorno, poiché potrebbe influire negativamente sui risultati dei tuoi esperimenti. Inizia riscaldando una piastra di 10 centimetri con cinque millilitri di mezzi di isolamento in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.Pesare da 500 a 1.000 milligrammi del tessuto tumorale e posizionare nel piatto. Portare il piatto con il tessuto tumorale in un cappuccio di coltura sterile e tritarlo con una lama di rasoio. Per una digestione ottimale, assicurarsi che le dimensioni dei pezzi tritati siano uniformi.Trasferire il tessuto tritato e il supporto di isolamento cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Lavare la piastra con altri quattro millilitri di supporto e aggiungerlo al tubo. Aggiungere 700 unità per millilitro di soluzione di collagenasi al tubo e incubarlo in un bagno d'acqua tremante a 37 gradi Celsius per 1 ora e mezza.Dopo l'incubazione, far girare il tessuto a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante senza interrompere il pellet, quindi rimescolare il pellet in 10 millilitri di seconda soluzione di digestione e incubare nel bagno d'acqua tremante per altri 30 minuti. Dopo la seconda digestione, pipettare la sospensione cellulare su e giù e passarla attraverso un filtro in nylon da 70 micrometri su un tubo di centrifuga da 50 millilitri.Quindi lavare il filtro con 10 millilitri di mezzi di isolamento cellulare e far girare il tessuto a 300 volte g per cinque minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 20 millilitri di mezzi cellulari tumorali. Trasferire la sospensione su una piastra di coltura di 15 centimetri e posizionare le cellule in un incubatore di 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno dopo, cambia il supporto per rimuovere detriti e cellule morte che potrebbero influenzare negativamente la sopravvivenza delle cellule. A questo punto, valutare la confluenza cellulare e consentire alle cellule di crescere nell'incubatore fino a raggiungere il 90%Monitorare le cellule ogni giorno e cambiare il supporto ogni due giorni. Per la derivazione della tumorsfera, utilizzare le cellule al passaggio P1 o P2 per evitare la selezione cellulare attraverso più passaggi.Lavare la piastra cellulare con PBS e quindi coprirli con soluzione di distacco. Posizionarli nell'incubatrice per cinque o 10 minuti e quindi confermare il distacco guardando la piastra sotto un microscopio a campo luminoso. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere il supporto cellulare tumorale alla piastra e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga.Far girare le cellule a 300 volte g per cinque minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule nei mezzi della tumorsfera. Dopo aver riaspenso le celle, contarle usando Trypan blue e calcolare la concentrazione cellulare. Placcare il numero corretto di cellule in una piastra a basso attacco da 96 po 'e posizionare le cellule nell'incubatrice fino alla fine dell'esperimento, facendo attenzione a non disturbare la piastra a meno che non reintegri il supporto.Dopo aver completato l'esperimento, identificare manualmente le tumori al microscopio a campo luminoso o utilizzando il software Celigo. Il numero e le dimensioni delle tumorisfere possono essere valutati come risultato di questo saggio. Per preparare le tumorisfere per il trapianto di allografto, riunire tutte le tumorisfere ottenute da uno specifico tipo di cellula o trattamento.Centrifugare le atmosfere tumorali e rimuovere con cura il supernatante con una pipetta di un millimetro seguita da una pipetta da 200 microlitri, quindi lavarle con 10 millilitri di PBS sterile. Spinte di nuovo giù le atmosfere tumorali e aspirate il PBS. Aggiungere 500 microlitri a un millilitro di soluzione di distacco cellulare sopra il pellet della tumorsfera e incubare le cellule in un bagno d'acqua tremante a 37 gradi Celsius.Controlla la progressione della digestione ogni 10 minuti. L'intero processo richiedere fino a 30 minuti. Se la digestione della tumorsfera nel bagno d'acqua tremante non è sufficiente per ottenere una soluzione a singola cellula, si suggerisce un'interruzione meccanica attraverso la pipettazione su e giù.Si noti che dopo aver ruotato le atmosfere tumorali non formano un pellet stabile, quindi aspirare il supernatante deve essere fatto con attenzione con una pipetta da un millilitro e pipette da 200 microlitri. Una volta ottenuta una soluzione a singola cellula, aggiungere un volume di mezzi cellulari tumorali e farlo girare verso il basso a 300 volte g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Dopo questa centrifugazione, tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti sul ghiaccio.Rimescolare le cellule nei mezzi cellulari tumorali freddi e contare le cellule vive usando l'esclusione blu di Trypan. Determinare il numero corretto di cellule per l'allografto e diluirlo in 50 microlitri di mezzi cellulari tumorali freddi. Posizionare una punta di pipetta in mezzi cellulari tumorali freddi per raffreddarla e quindi usarla per prendere 50 microlitri di soluzione ECM fredda e aggiungerla al tubo con le cellule, assicurandosi di non rimuovere il tubo ECM dal ghiaccio durante questo processo.Mantenere le cellule sul ghiaccio fino al trapianto e posizionare una siringa per insulina limitata da 0,5 millilitri con un ago calibro 29 sul ghiaccio. Dopo aver confermato che il mouse è stato correttamente anestetizzato, radere il lato destro dell'animale, aspirare la soluzione cellulare nella siringa raffreddata e iniettare le cellule per via sottocutanea nell'area rasata. Se l'iniezione viene eseguita correttamente, sotto la pelle si formerà un urto visibile.Questo protocollo può essere utilizzato per formare in modo affidabile le cancerosfere per l'identificazione di popolazioni cellulari rare responsabili dello sviluppo del sarcoma dei tessuti molli. Una parte fondamentale di questo saggio è la discriminazione tra le cancerosfere e gli ammassi cellulari, che mostrano chiare differenze morfologiche. Per determinare la concentrazione ottimale alla quale una proteina di interesse innesca un effetto sulle cellule tumorali, è necessario valutare il livello di espressione degli obiettivi a valle della proteina.Tre dei geni testati hanno mostrato una risposta dose-dipendente al trattamento proteico ricombinante e uno no. Al fine di stabilire un protocollo efficiente, sono stati analizzati gli effetti della trasfezione sulle cellule tumorali intrinseche;sono state testate due diverse quantità di reagente e l'efficienza è stata valutata con un plasmide reporter GFP. Minori quantità di reagente hanno portato a una maggiore efficienza di trasfezione.È stato necessario attuare un protocollo in due fase per eseguire la trasfezione sulle celle in sospensione. La trasfezione è stata eseguita su cellule aderenti e 24 ore dopo sono state staccate e placcate in sospensione;dopo sette giorni, le tumorisfere controllate esprimevano GFP. Dopo che le tumorisfere sono state ottenute, trattate e trapiantate è possibile confrontare l'effetto di questo diverso trattamento nella crescita tumorale in vivo.Questi metodi consentiranno agli scienziati di rispondere alle domande ancora in piedi sulla cellula di origine dei rabdomiosarcomi, stabilendo allo stesso tempo le basi per lo screening farmacologico.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

Da un prodotto naturale al suo grappolo Biosynthetic Gene: Una dimostrazione che utilizzino Polyketomycin da<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Ricerca

Genetica

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolare, sequenziamento e analisi dei microRNA extracellulari dalle cellule staminali mesenchimali umane

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

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ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

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Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

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Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

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Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

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The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...