Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
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이 작품은 엘리슨 의료 재단 보조금 AG-NS-0843-11, 그리고 NCI 암 센터 지원 교부금 P30CA030199 A.S. 내에서 NIH 파일럿 교부금에 의해 지원되었다.

마우스의 주택, 처리 및 희생은 샌포드 번햄 프리디스 의학 발견 연구소의 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 시약 준비
<ol><li>세포 절연 배지 100 mL준비: F10 배지에 10% 말 세럼(HS)을 보충하였다.</li>
	<li>콜라게나아제 타입 II 용액 50 mL 준비: 콜라게나아제 타입 II 파우더 1 g을 세포 분리 매체 50 mL에 용해시십시오(로트에 따라 단위 수가 변하기 때문에 1 mL당 효소 ?...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. 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M., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+stem+cells+and+low-intensity+laser+irradiation:+a+potential+future+therapy.">Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (5), 129 (2013).</li><li>Tomao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+molecular+profiles+of+ovarian+cancer:+an+update+on+cancer+stem+cells.">Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells.</a> Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).</li><li>Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorsphere+as+an+effective+in+vitro+platform+for+screening+anti-+cancer+stem+cell+drugs.">Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs.</a> Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).</li><li>Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+adult+and+pediatric+rhabdomyosarcoma+in+the+surveillance,+epidemiology+and+end+results+program.">Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).</li><li>Blum, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+transducer+YAP1+transforms+activated+satellite+cells+and+is+a+potent+effector+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+formation.">The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation.</a> Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).</li><li>Hatley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+rhabdomyosarcoma+originating+from+the+adipocyte+lineage.">A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage.</a> Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).</li><li>Drummond, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

종양 이질성 세포 집단으로부터의 TPC의 격리 및 특성화: 종양 투종 분석법, FACS 격리 및 종양구 형성 분석법에서 여러 가지 방법이 채택되었다. 종양 투동성 분석은 1971년에 처음 기술되었으며, 줄기 세포 연구에 사용되었으며, 이후 암 생물학29,30에만적용되었다. 이 방법은 연겔배양물(31)에서제약 없이 확장되는 암 줄기세포 본질적 성...

암은 이질적인 질병입니다. 게다가, 종양의 동일 모형은 다른 환자에 있는 다른 유전 돌연변이를 제출할 수 있고, 환자 내의 종양은 세포의 다중 인구에 의해 구성됩니다1. 이질성은 암을 시작하고 전파하는 세포의 식별에 도전을 제시합니다, 그러나 그들의 특성은 능률적인 처리의 발달을 위해 필수적입니다. 종양 발달에 기여하는 세포의 희소한 인구인 종양 전파 세포 (TPC)의 개념은 이전에 광범위하게 검토되었습니다2. TPC가 여러 유형의 암을 특징으로한다는 사실에도 불구하고, 신뢰할 수있는 격리를위한 마커의 식별은 여러 종양 유형3,4,5및6에 대한 도전으로 남아 있습니다. , 7명 , 8개 , 따라서,분자 마커에 의존하지 않고 오히려 TPC 기능적 특성 (높은 자기 재생 및 낮은 부착 조건에서 성장하는 능력)에 의존하지 않는 방법, 종양 권 형성 분석법으로 알려진, 널리 적용 될 수있다 대부분의 종양에서 TPC의 식별. 중요한 것은, 이러한 분석또한 TPC의 확장을 위해 사용될 수 있으며, 따라서 암 내성1,10에대한 암 약물 스크리닝 및 연구에 직접 적용될 수 있다.
Rhabdomyo육종 (RMS)은 어린 아이들(11)에서가장 흔한 연조직 육종의 드문 형태입니다. Althoug RMS는 근생 마커의 발현의 평가를 통해 조직학적으로 확인될 수 있으며, 기원의 RMS 세포는 종양 발달 자극의 다중 종양 아류형 및 높은 이질성으로 인해 단명하게 특징지어지지 않았다. 실제로, 최근 연구는 RMS가 근생 또는 비 myogenic 기원인지에 대한 중요한 과학적 토론을 생성했다, RMS는 컨텍스트에 따라 다른 세포 유형에서 파생 될 수 있음을 시사12,13, 14세 , 15세 , 16세 , 17. RMS 세포주에 대한 수많은 연구는 종양 발달에 관여하는 경로의 식별과 높은 자기 갱신 인구와 관련된 마커의 특성화에 대한 종양 권 형성 분석을 사용하여 수행되었습니다. 18세 , 19세 , 20개 , 21.
그러나, 기원의 RMS 세포를 확인하기 위한 종양구 형성 분석법의 잠재력에도 불구하고, 1차 RMS 세포에 사용될 수 있는 신뢰할 수 있는 방법은 아직 기술되지 않았다. 이러한 맥락에서, 우리 그룹으로부터의 최근 연구는 듀첸 근이영양증(DMD) 마우스모델(22)에서기원의 RMS 세포의 식별을 위한 최적화된 종양권 형성 분석기를 채택하였다. 근육 조직에서 분리된 여러 개의 종양 전 세포 유형은 부착이 낮은 조건에서 성장하는 능력에 대해 테스트되어 영양 실맥에서 RMS의 기원 세포로 근육 줄기 세포를 식별할 수 있습니다. 여기서 설명된 것은 마우스 RMS 발달을 담당하는 극히 드문 세포 집단의 식별을 위해 성공적으로 채택된 종양구 형성분석(그림 1)에대한 재현가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

횡문근육종 (RMS)은 어린이에게 가장 흔한 연조직 육종입니다. 상당한 노력이 RMS와 관련되었던 일반적인 돌연변이의 확인을 가능하게 하고 다른 RMS 특수형의 차별을 허용했더라도, 중요한 도전은 예후를 더 향상시키기 위하여 새로운 처리의 발달을 위해 아직도 존재합니다. myogenic 마커의 발현에 의해 확인되더라도, 기원의 세포가 아직도 제대로 이해되지 않는 때문에 RMS가 myogenic 또는 비 myogenic 기원이 있는지 여부에 대한 중요한 논쟁이 아직도 있습니다. 본 연구에서는, 마우스 RMS에 대한 종양구법 분석법에 대해 신뢰할 수 있는 방법이 제공된다. 분석법은 종양 세포의 기능적 특성에 기초하고 종양 성 기능을 가진 종양에 있는 희소한 인구의 확인을 허용합니다. 또한 재조합 단백질을 테스트하고, 형질전환 프로토콜을 종양 권 분석실험과 통합하고, 종양 발달 및 성장에 관여하는 후보 유전자를 평가하기 위한 절차도 기술되어 있다. 추가로 기재된 종양이식이식은 생체내에서종양발생 기능을 검증하기 위해 수용자 마우스로 이식하는 절차이다. 전반적으로, 기술된 방법은 다른 문맥에서 발생하는 RMS에 적용될 수 있는 희소한 RMS 종양성 집단의 신뢰할 수 있는 식별 및 시험을 허용한다. 마지막으로, 프로토콜은 약물 스크리닝 및 치료제의 향후 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.

종양구 검출 세포 격리는 종양 조직에 존재하는 세포 집단의 최대 이질성을 얻기 위해 최적화되었다. 첫째, 단리조직이 형태학적으로 이질적인 영역을 제시한 이후, 균일한 희귀 세포 집단을 분리할 가능성을 높이기 위해, 샘플링은 종양의 여러 부위로부터 수행되었다(도1A,왼쪽의 첫 번째 패널). 둘째, 수확된 시료의 기계적 해리는 다...

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Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

이 프로토콜은 마우스 횡문근 육종 1차 세포의 분리, 종양구 형성 및 치료, 및 종양구배양으로부터 시작되는 동종 이식이식에 대한 재현가능한 방법을 설명한다.

마우스 횡문근에서 분리 된 원발성 종양 세포에서 종양 구체 유도 및 치료

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Rhabdomyosarcoma는 조직 형태와 근생 마커의 발현에 의해 조직학적으로 특징짓는 연조직 육종의 드문 형태이다. 그러나, 이러한 종양의 다른 특수형의 존재와 그것의 형성에 기여하는 자극의 이질성을 감안할 때, 기원의 세포의 식별은 매우 도전적이었습니다. 여기서 우리는 생쥐로부터 새로 수확한 종양 조직에서 시작하여 rhabdomyosarcomas의 기원세포의 식별을 위한 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명하고 이 분석법은 종양권 형성 분석이다.종양권 형성 분석의 주요 장점은 종양 유래 세포에 존재하는 것으로 알려진 세포 특성에 의존하며 특정 세포 집단의 팽창 및 농축에도 사용될 수 있다는 것입니다. 더욱이, 그것의 스페로이드 구조는 종양 환경을 모방, 따라서 그(것)들은 약 검열 연구 결과로 이용될 수 있습니다. 이 방법은 분자 마커의 사전 지식이 필요하지 않기 때문에 종양의 다른 유형에 적용 될 수있는 잠재력을 가지고 있지만 문화 조건의 최적화를 필요로 할 수 있습니다.종양권은 특히 종양 내의 희귀 세포 집단을 식별하려고 시도하는 경우 형성하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 따라서 실험 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 매일 하위 문화 판을 보는 것이 좋습니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터의 격리 미디어가 있는 10센티미터 플레이트를 데우기 시작합니다.종양 조직의 500 ~ 1, 000 밀리그램의 무게를 측정하고 접시에 놓습니다. 종양 조직으로 접시를 멸균 배양 후드에 가져와 면도날로 다진다. 최적의 소화를 위해 다진 조각의 크기가 균일한지 확인하십시오.다진 조직 및 세포 격리 매체를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 또 다른 4 밀리리터의 미디어로 접시를 씻고 튜브에 추가합니다. 콜라게나제 용액 의 밀리리터 당 700 단위를 튜브에 추가하고 1 1/2 시간 동안 섭씨 37도에서 흔들리는 수조에 배양하십시오.인큐베이션 후 실온에서 5분 동안 300배 g로 조직을 회전시합니다. 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 흡인한 다음, 펠릿을 10밀리리터의 두 번째 소화 용액으로 재복제하고 흔들리는 수조에서 30분 동안 배양합니다. 두 번째 소화 후, 파이펫 은 위아래로 셀 서스펜션을 하고 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 70 마이크로 미터 나일론 필터를 통과합니다.그런 다음 10 밀리리터의 세포 격리 매체로 필터를 세척하고 5 분 동안 300 배 g에서 조직을 회전시하십시오. 상류체를 흡인하고 종양 세포 매체의 20 밀리리터에서 펠릿을 재중단한다. 서스펜션을 15센티미터 배양판으로 옮기고 세포를 섭씨 37도인배양식에 하룻밤 사이에 놓습니다.다음 날, 세포 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 파편과 죽은 세포를 제거하기 위하여 매체를 변경합니다. 이 시점에서, 세포 소모성을 평가하고 세포가 매일 세포를 90%에 도달할 때까지 인큐베이터에서 성장하는 것을 허용하고 2일마다 미디어를 변경합니다. 종양경부 파생의 경우, 통로 P1 또는 P2에서 세포를 사용하여 여러 구절을 통해 세포 선택을 피하십시오.셀 접시를 PBS로 씻은 다음 분리 용액으로 덮습니다. 인큐베이터에 5-10분 간 배치한 다음 밝은 필드 현미경 으로 플레이트를 보고 분리를 확인합니다. 일단 세포가 분리되면, 종양 세포 매체를 플레이트에 추가하고 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮는다.세포를 300배 g에서 5분간 스핀하고, 상체를 제거하고, 종양권 미디어에서 세포를 다시 분리한다. 세포를 다시 일시 중단 한 후 Trypan 파란색을 사용하여 셀 농도를 계산합니다. 96-잘 낮은 부착 플레이트에 있는 세포의 적당한 수를 접시및 실험의 끝까지 인큐베이터에 세포를 배치하고, 미디어를 보충하지 않는 한 판을 방해하지 않도록 주의하십시오.실험이 완료된 후, 밝은 필드 현미경또는 Celigo 소프트웨어를 사용하여 수동으로 종양스피어를 식별합니다. 종양스피어의 수와 크기는 이 분석의 결과로 평가될 수 있다. 동종 이식 이식을 위한 종양스피어를 준비하려면 특정 세포 유형 또는 치료에서 얻은 모든 종양 스피어를 함께 당깁니다.종양구를 원심 분리하고 1밀리미터 파이펫으로 상체를 조심스럽게 제거하고 200 마이크로리터 파이펫을 한 다음 멸균 PBS 10 밀리리터로 세척합니다. 종양구를 다시 회전시키고 PBS를 흡인시합니다. 500 마이크로리터를 종양권 펠릿 위에 세포 분리 용액 1밀리리터에 넣고 섭씨 37도에서 흔들리는 수조에서 세포를 배양합니다.10분마다 소화진행을 확인합니다. 전체 프로세스는 최대 30분이 소요됩니다. 흔들리는 수조에서 종양권의 소화가 단일 세포 용액을 얻기에 충분하지 않은 경우, 위아래로 파이프를 통해 기계적 중단이 제안된다.종양구를 회전한 후에는 안정된 펠릿을 형성하지 않으므로, 체퍼를 심는 것은 1밀리리터 파이펫과 200 마이크로리터 파이펫으로 신중하게 수행해야 합니다. 단일 세포 용액이 얻어지면 종양 세포 매체의 부피를 추가하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 300 배 g로 회전하십시오. 이 원심 분리 후, 모든 후속 단계는 얼음에서 수행해야합니다.차가운 종양 세포 매체에 있는 세포를 다시 중단하고 Trypan 청색 제외를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다. 동종 이식에 대한 적절한 수의 세포를 결정하고 감기 종양 세포 미디어의 50 마이크로 리터에서 희석하십시오. 차가운 종양 세포 매체에 파이펫 팁을 놓고 냉각한 다음 차가운 ECM 용액 50 마이크로리터를 사용하여 이 과정에서 얼음에서 ECM 튜브를 제거하지 않도록 세포가 있는 튜브에 추가합니다.이식될 때까지 얼음 위에 세포를 유지하고 얼음 위에 29게이지 바늘로 덮인 0.5 밀리리터 인슐린 주사기를 놓습니다. 마우스가 제대로 마취되었음을 확인한 후 동물의 오른쪽을 면도하고, 세포 용액을 냉각 된 주사기로 흡수하고, 면도 부위에 피하 된 세포를 주입한다. 주사가 올바르게 수행되면 피부 아래에 눈에 보이는 범프가 형성됩니다.이 프로토콜은 연조직 육종 발달을 담당하는 희귀 세포 집단의 식별을 위해 종양구체를 안정적으로 형성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석의 근본적인 부분은 명확한 형태학적 차이를 나타내는 종양권과 세포 클러스터 사이의 차별입니다. 관심 있는 단백질이 종양 세포에 영향을 미치는 최적의 농도를 결정하기 위해 단백질의 다운스트림 표적의 발현 수준을 평가할 필요가 있다.시험된 유전자의 3개는 재조합 단백질 처리에 복용량 의존반응을 보였고 1개는 하지 않았다. 효율적인 프로토콜을 확립하기 위해 내재된 종양 세포에 대한 경질의 효과를 분석하였다.두 가지 상이한 양의 시약을 테스트하고 GFP-리포터 플라스미드로 효율성을 평가하였다. 시약의 양이 적어 질수록 배분 효율이 높아졌습니다.현탁액의 세포에 대한 형질 검사를 수행하기 위해 2단계 프로토콜을 구현해야 했습니다. 경직세포에서 경전을 수행하였고 24시간 후에 분리되어 현탁액으로 도금되었습니다.7일 후, 통제된 종양스피어는 GFP를 발현하고 있었다. 종양스피어가 얻어지고, 치료되고, 이식된 후에생체내에서 종양 성장에서 이러한 상이한 치료의 효과를 비교할 수 있다.이 방법은 과학자가 약물 검열을 위한 기초를 설정하는 동시에 rhabdomyosarcomas의 기원의 세포의 정지서 질문에 대답할 수 있게 합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

에서 Polyketomycin를 사용하여 데모 : 그 생합성 유전자 클러스터에 천연 제품에서<em&gt; 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

연구

유전학

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 RNA를 분리하는 FACS 기반 프로토콜

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...