Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Ellison Medical Foundation stipend AG-NS-0843-11, og NIH pilot Grant innenfor NCI Cancer Center support Grant P30CA030199 til A.S.

Bolig, behandling, og offer av mus ble utført etter godkjent IACUC protokollen av Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. forberedelse av reagens
<ol><li>Forbered 100 mL celle isolasjons medier: F10 medium supplert med 10% heste serum (HS).</li>
	<li>Forbered 50 mL kollagenase type II løsning: oppløse 1 g av kollagenase type II pulver i 50 mL av celle isolasjons medier (Legg merke til enhetene av enzymet per 1 mL av Media, siden antall enheter endres avhengig av mye). Alikv...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+liver+cancer+stem+cells.">Molecular biology of liver cancer stem cells.</a> Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).</li><li>Crous, A. M., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+stem+cells+and+low-intensity+laser+irradiation:+a+potential+future+therapy.">Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (5), 129 (2013).</li><li>Tomao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+molecular+profiles+of+ovarian+cancer:+an+update+on+cancer+stem+cells.">Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells.</a> Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).</li><li>Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+stem+cells:+new+insight+into+a+stubborn+disease.">Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease.</a> Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).</li><li>Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+prostate+cancer+stem+cells:+markers+and+methods.">Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorsphere+as+an+effective+in+vitro+platform+for+screening+anti-+cancer+stem+cell+drugs.">Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs.</a> Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).</li><li>Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+adult+and+pediatric+rhabdomyosarcoma+in+the+surveillance,+epidemiology+and+end+results+program.">Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).</li><li>Blum, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+transducer+YAP1+transforms+activated+satellite+cells+and+is+a+potent+effector+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+formation.">The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation.</a> Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).</li><li>Hatley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+rhabdomyosarcoma+originating+from+the+adipocyte+lineage.">A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage.</a> Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).</li><li>Drummond, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

Flere metoder har vært ansatt for isolasjon og karakterisering av TPCs fra tumor heterogene celle populasjoner: tumor clonogenic analyser, FACS isolasjon, og tumorsphere dannelse analysen. Svulsten clonogenic analysen ble først beskrevet i 1971, brukes for stilk cellen studier, og bare senere brukes til kreft biologi29,30. Denne metoden er basert på kreft stamceller iboende eiendom for å utvide uten begrensninger i myke gels kulturer31...

Kreft er en heterogen sykdom; Videre kan samme type svulst presentere ulike genetiske mutasjoner i ulike pasienter, og innenfor en pasient en svulst er sammensatt av flere populasjoner av celler1. Heterogenitet presenterer en utfordring i identifisering av celler ansvarlig for initiering og spre kreft, men deres karakterisering er avgjørende for utviklingen av effektive behandlinger. Oppfatningen av tumor spre celler (TPC), en sjelden befolkning av celler som bidrar til tumor utvikling, har vært tidligere grundig gjennomgått2. Til tross for det faktum at TPCs har vært preget i flere typer kreft, er identifisering av markører for deres pålitelig isolasjon en utfordring for flere tumor typer3,4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9. således, en metode som ikke er avhengig av molekylære markører, men heller på TPC funksjonelle egenskaper (høy selv-fornyelse og evnen til å vokse i lav-vedlegg forhold), kjent som tumorsphere formasjon analysen, kan bli mye brukt for identifisering av TPCs fra de fleste svulster. Viktigere, kan denne analysen også være ansatt for utvidelse av TPCs og dermed direkte brukt til kreft narkotika screening og studier på kreft resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) er en sjelden form for bløtvev sarkom mest vanlig i små barn11. Promodell RMS kan histologisk identifisert gjennom vurdering av uttrykk for myogenic markører, RMS-cellen av opprinnelse har ikke blitt univocally preget på grunn av flere tumor undergrupper og høy heterogenitet av tumor utviklingsmessige stimuli. Faktisk har nyere studier generert betydelige vitenskapelige diskusjonen om RMS er av myogenic eller ikke-myogenic opprinnelse, noe som tyder på at RMS kan utledes fra ulike celler typer avhengig av sammenhengen12,13, 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17. Tallrike studier på RMS cellelinjer har blitt utført ansette tumorsphere formasjon analysen for identifisering av trasé involvert i tumor utvikling og karakterisering av markører forbundet med svært selv-fornyelse populasjoner 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21i denne.
Men til tross for tumorsphere dannelse analysen potensial for å identifisere RMS celler opprinnelse, en pålitelig metode som kan brukes på primære RMS celler har ennå ikke blitt beskrevet. I denne sammenheng, en fersk studie fra vår gruppe ansatt en optimalisert tumorsphere formasjon analysen for identifisering av RMS-cellene opprinnelse i en Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) mus modell22. Flere pre-tumorigene celletyper, isolert fra muskel vev, er testet for deres evne til å vokse i lav-vedlegg forhold, slik at identifisering av muskel stamceller som Opprinnelses celler for RMS i dystrophic sammenhenger. Beskrevet her er en reproduserbar og pålitelig protokoll for tumorsphere formasjon analysen (figur 1), som har blitt ansatt for identifisering av ekstremt sjeldne celle populasjoner som er ansvarlig for musen RMS utvikling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) er den vanligste bløtvevet sarkom hos barn. Selv om betydelig innsats har aktivert identifisering av vanlige mutasjoner knyttet til RMS og tillot diskriminering av ulike RMS undergrupper, store utfordringer fortsatt eksisterer for utvikling av romanen behandlinger for å ytterligere forbedre prognosen. Selv identifisert av uttrykk for myogenic markører, er det fortsatt betydelig uenighet om RMS har myogenic eller ikke-myogenic opprinnelse, som cellen av opprinnelse er fortsatt dårlig forstått. I denne studien, en pålitelig metode er gitt for tumorsphere analysen for mus RMS. Analysen er basert på funksjonelle egenskaper av tumorceller og tillater identifisering av sjeldne populasjoner i tumor med tumorigene funksjoner. Også beskrevet er prosedyrer for å teste rekombinant proteiner, integrere transfeksjoner protokoller med tumorsphere analysen, og evaluere kandidat gener involvert i tumor utvikling og vekst. Beskrevet videre er en prosedyre for allograft transplantasjon av tumorspheres i mottaker mus for å validere tumorigene funksjon in vivo. Samlet, den beskrevne metoden gir pålitelig identifisering og testing av sjeldne RMS tumorigene populasjoner som kan brukes til RMS som oppstår i ulike sammenhenger. Endelig kan protokollen benyttes som en plattform for narkotika screening og fremtidig utvikling av legemiddel.

Tumorspheres deteksjon Celle isolasjon var optimalisert for å oppnå maksimal heterogenitet av celle populasjoner til stede i tumorvevet. Først, siden isolert vev presentert morfologisk ulike områder, for å øke sjansene for å isolere uniform sjeldne celle populasjoner, ble prøvetaking utført fra flere områder av svulsten (figur 1a, første panel til venstre). For det andre, mekanisk dissosiasjon av høstes prøvene ble utført sam...

Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Denne protokollen beskriver en reproduserbar metode for isolering av mus rhabdomyosarcoma primære celler, tumorsphere dannelse og behandling, og allograft transplantasjon fra tumorspheres kulturer.

Tumorsphere avledning og behandling fra primære tumor celler isolert fra mus Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Rabdomyosarkom er en sjelden form for bløtvevs sarkomer preget histologisk av vevmorfologi og uttrykk for myogene markører. Men gitt eksistensen av forskjellige undertyper av disse svulstene og heterogeniteten til stimuli som bidrar til dannelsen, har identifiseringen av opprinnelsescellen vært svært utfordrende. Her beskriver vi reproduserbare og pålitelige metoder for identifisering av opprinnelsescellen til rabdomyosarkomer som starter fra nyinnhøstet tumorvev fra mus, og denne analysen er tumorsfæreformasjonsanalysen.De viktigste fordelene med tumorsfæreformasjonsanalyse er at den er avhengig av cellulære egenskaper som er kjent for å være tilstede i tumor-opprinnelsesceller, og den kan også brukes til utvidelse og berikelse av den spesifikke cellepopulasjonen. Videre etterligner spheroidstrukturen tumormiljøet, og dermed kan de brukes som legemiddelscreeningsstudier. Denne metoden har potensial til å bli brukt på andre typer svulster fordi det ikke krever forkunnskaper om molekylære markører, men det kan kreve optimalisering av kulturforhold.Tumorsfære kan ta litt tid å danne, spesielt hvis du prøver å identifisere en sjelden cellepopulasjon i svulsten din. Dermed er det ikke foreslått å se på din subkultur plate hver dag, siden det kan påvirke resultatene av eksperimentene dine negativt. Start med å varme opp en 10-centimeter plate med fem milliliter isolasjonsmedier i en inkubator ved 37 grader Celsius.Vei 500 til 1000 milligram av tumorvevet og legg det i platen. Ta platen med tumorvevet til en steril kulturhette og hakke den med et barberblad. For optimal fordøyelse, sørg for at størrelsene på de hakkete bitene er ensartede.Overfør hakket vev og celleisolasjonsmedier til et 15-milliliter sentrifugerør. Vask platen med ytterligere fire milliliter med media og legg den til røret. Tilsett 700 enheter per milliliter kollagenaseløsning til røret og inkuber den i et ristingsvannbad ved 37 grader Celsius i 1 1/2 timer.Etter inkubasjonen, spinn ned vevet på 300 ganger g i fem minutter ved romtemperatur. Aspirerer det overnaturante uten å forstyrre pelleten, og gjenoppuss deretter pelleten i 10 milliliter med andre fordøyelsesløsning og inkubere i det ristende vannbadet i 30 minutter til. Etter den andre fordøyelsen pipette cellen suspensjon opp og ned og passere den gjennom en 70-mikrometer nylon filter på en 50-milliliter sentrifuge rør.Vask deretter filteret med 10 milliliter celleisolasjonsmedier og spinn ned vevet på 300 ganger g i fem minutter. Aspirer den overnaturante og resuspend pellet i 20 milliliter av tumorcellemedier. Overfør suspensjonen til en 15-centimeter kulturplate og legg cellene i en 37 grader Celsius inkubator over natten.På neste dag, endre media for å fjerne rusk og døde celler som kan negativt påvirke celle overlevelse. På dette punktet, vurdere celle samløpet og la cellene vokse i inkubatoren til den når 90% Overvåke cellene hver dag og endre media annenhver dag. For tumorsfære avledning, bruk celler ved Passasje P1 eller P2 for å unngå cellevalg gjennom flere passasjer.Vask cellefatet med PBS og dekk dem deretter med løsrivelsesløsning. Plasser dem i inkubatoren i fem til 10 minutter, og bekreft deretter løsrivelse ved å se på platen under et brightfield mikroskop. Når cellene har løsnet, legg til tumorcellemedier til platen og overfør cellesuspensjonen til et sentrifugerør.Spinn cellene ned på 300 ganger g i fem minutter, fjern overnaturlige, og gjenbruk cellene i tumorsfære medier. Etter resuspending cellene, telle dem ved hjelp av Trypan blå og beregne cellekonsentrasjon. Plate riktig antall celler i en 96-brønns lav-vedlegg plate og plassere cellene i inkubatoren til slutten av eksperimentet, ta vare på ikke å forstyrre platen med mindre etterfylling media.Etter ferdigstillelse av eksperimentet, identifisere tumorsfærer manuelt under et brightfield mikroskop eller ved hjelp av Celigo programvare. Antallet og størrelsen på tumorsfærene kan evalueres som følge av denne analysen. For å forberede tumorsfærer for allografttransplantasjon, trekk sammen alle tumorsfærer hentet fra en bestemt celletype eller behandling.Sentrifuger tumorsfærene og fjern forsiktig supernatanten med en en millimeter pipette etterfulgt av en 200 mikroliter pipette, og vask dem deretter med 10 milliliter steril PBS. Spinn svulstene sfærer ned igjen og aspirere PBS. Tilsett 500 mikroliter til en milliliter celleavløsning på toppen av tumorsfærepellet og inkuber cellene i et ristingsvannbad ved 37 grader Celsius.Sjekk progresjon av fordøyelsen hvert 10. Hele prosessen tar opptil 30 minutter. Hvis fordøyelsen av svulster sfære i risting vannbadet er ikke nok til å få en encellede løsning, mekanisk forstyrrelse gjennom pipettering opp og ned er foreslått.Legg merke til at etter spinning danner tumorsfærene ikke en stabil pellet, så aspirering av supernatanten bør gjøres nøye med en en milliliter pipette og 200 mikroliter pipetter. Når en encellet løsning er oppnådd, legg til et volum av tumorcellemedier og spinn det ned på 300 ganger g i fem minutter ved 4 grader Celsius. Etter denne sentrifugeringen må alle påfølgende trinn utføres på is.Resuspend cellene i kaldt tumor celle media og telle levende celler ved hjelp av Trypan blå utelukkelse. Bestem riktig antall celler for allograft og fortynne det i 50 mikroliter av kalde tumorcellemedier. Plasser en pipettespiss i kaldt tumorcellemedi for å kjøle det ned, og bruk den deretter til å ta 50 mikroliter kald ECM-løsning og legg den til røret med celler, og pass på at du ikke fjerner ECM-røret fra is under denne prosessen.Hold cellene på is til transplantasjon og plasser en avkortet, 0,5-milliliter insulinsprøyte med en 29-gauge nål på is. Etter å ha bekreftet at musen har blitt riktig bedøvet, barbere høyre side av dyret, aspirere celleoppløsningen i den avkjølte sprøyten, og injiser cellene subkutant inn i det barberte området. Hvis injeksjonen utføres riktig, vil det dannes en synlig bump under huden.Denne protokollen kan brukes til pålitelig å danne tumorsfærer for identifisering av sjeldne cellepopulasjoner som er ansvarlige for bløtvevssarkomutvikling. En grunnleggende del av denne analysen er diskriminering mellom tumorsfærer og celleklynger, som viser klare morfologiske forskjeller. For å bestemme den optimale konsentrasjonen der et protein av interesse utløser en effekt på tumorceller, er det nødvendig å vurdere nivået av uttrykk for proteinets nedstrøms mål.Tre av de testede genene viste en doseavhengig respons på rekombinant proteinbehandling, og det gjorde man ikke. For å etablere en effektiv protokoll ble effekten av transinfeksjon på iboende tumorceller analysert;to forskjellige mengder reagens ble testet og effektivitet ble vurdert med en GFP-reporter plasmid. Lavere mengder reagens resulterte i høyere transfeksjonseffektivitet.En to-trinns protokoll måtte implementeres for å utføre transfection på celler i suspensjon. Transfection ble utført på tilhengerceller og 24 timer senere ble de løsrevet og belagt i suspensjon;etter syv dager uttrykte kontrollerte tumorsfærer GFP. Etter at tumorsfærer er oppnådd, behandlet og transplantert, er det mulig å sammenligne effekten av denne forskjellige behandlingen i tumorvekst in vivo.Disse metodene vil tillate forskere å svare på de stillestående spørsmålene til opprinnelsescellen til rabdomyosarkomer samtidig som de setter grunnlaget for narkotikascreening.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

Fra et naturlig produkt til sin Biosyntetiske Gene Cluster: En demonstrasjon Bruke Polyketomycin fra<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spre forberedelser for analyse av musen Oocyte progresjon fra Prophase til Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generering av kreft cellen kloner å visualisere Telomeric gjenta inneholder RNA TERRA uttrykt fra en enkelt Telomere i levende celler

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq analysen med lav Mitokondrielt DNA forurensning fra primære menneskelige CD4 + T-lymfocytter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA fra hele Blood bruke Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

En in vitro-protokoll for evaluering av MicroRNA nivåer, funksjoner og assosierte mål gener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumor Organoids fra genetisk utviklet Mouse modeller av prostatakreft

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Bruk av mus melke tumor celler i en in vitro Invasion analysen som et mål på kreftfremkallende Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

En FACS-basert protokoll for å isolere RNA fra sekundære celler av Drosophila mannlig tilbehør kjertler

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...