Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela concessão AG-NS-0843-11 da Fundação médica de Ellison, e pelo Grant piloto de NIH dentro da concessão do apoio do centro do cancer de NCI P30CA030199 a A.S.

A habitação, o tratamento e o sacrifício de camundongos foram realizados seguindo o protocolo IACUC aprovado do Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. preparação do reagente
<ol><li>Prepare 100 mL de meio de isolamento celular: F10 médio suplementado com 10% de soro de cavalo (HS).</li>
	<li>Preparar 50 ml de solução de colagenase tipo II: dissolver 1 g de pó de colagenase tipo II em 50 ml de meios de isolamento celular (Observe as unidades da enzima por 1 ml de míd...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+liver+cancer+stem+cells.">Molecular biology of liver cancer stem cells.</a> Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).</li><li>Crous, A. M., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+stem+cells+and+low-intensity+laser+irradiation:+a+potential+future+therapy.">Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (5), 129 (2013).</li><li>Tomao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+molecular+profiles+of+ovarian+cancer:+an+update+on+cancer+stem+cells.">Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells.</a> Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).</li><li>Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+stem+cells:+new+insight+into+a+stubborn+disease.">Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease.</a> Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).</li><li>Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+prostate+cancer+stem+cells:+markers+and+methods.">Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorsphere+as+an+effective+in+vitro+platform+for+screening+anti-+cancer+stem+cell+drugs.">Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs.</a> Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).</li><li>Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+adult+and+pediatric+rhabdomyosarcoma+in+the+surveillance,+epidemiology+and+end+results+program.">Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).</li><li>Blum, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+transducer+YAP1+transforms+activated+satellite+cells+and+is+a+potent+effector+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+formation.">The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation.</a> Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).</li><li>Hatley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+rhabdomyosarcoma+originating+from+the+adipocyte+lineage.">A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage.</a> Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).</li><li>Drummond, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

Os métodos múltiplos foram empregados para a isolação e a caracterização dos TPCs das populações heterogêneas da pilha do tumor: ensaios ensaios do tumor, isolação de FACS, e ensaio da formação do tumorsphere. O ensaio clonogénico do tumor foi descrito primeiramente em 1971, usado para estudos da pilha de haste, e aplicado somente subseqüentemente à biologia do cancer29,30. Este método é baseado na propriedade intrínseca das pilhas de haste do ...

O câncer é uma doença heterogênea; Além disso, o mesmo tipo de tumor pode apresentar mutações genéticas diferentes em pacientes diferentes, e dentro de um paciente um tumor é compor por populações múltiplas das pilhas1. A heterogeneidade apresenta um desafio na identificação de células responsáveis pelo início e propagação do câncer, mas sua caracterização é essencial para o desenvolvimento de tratamentos eficientes. A noção de pilhas de propagação do tumor (TPC), uma população rara das pilhas que contribuem ao desenvolvimento do tumor, foi revista previamente extensivamente2. Apesar do fato de que os TPCs têm sido caracterizados em múltiplos tipos de câncer, a identificação de marcadores para seu isolamento confiável continua sendo um desafio para vários tipos de tumores3,4,5,6 , 7 anos de , 8 . º , 9. assim, um método que não dependa de marcadores moleculares, mas em propriedades funcionais de TPC (alta autorenovação e a capacidade de crescer em condições de baixa fixação), conhecido como o ensaio de formação de tumorfera, pode ser amplamente aplicado para o identificação de TPCs da maioria dos tumores. Importante, este ensaio também pode ser empregado para a expansão de TPCs e, portanto, aplicado diretamente à triagem de drogas de câncer e estudos sobre a resistência ao câncer1,10.
O rabdomiossarcoma (RMS) é uma forma rara de sarcoma de tecido mole mais comum em crianças jovens11. Althoug RMS pode ser identificado histologicamente através da avaliação da expressão de marcadores miogênicos, a célula RMS de origem não foi caracterizada univocalmente devido aos subtipos de tumores múltiplos e alta heterogeneidade dos estímulos de desenvolvimento tumoral. De fato, estudos recentes têm gerado uma discussão científica significativa sobre se o RMS é de origem miogênica ou não-miogênica, sugerindo que o RMS pode derivar de diferentestipos decélulas, dependendodo contexto12,13, 14 anos de , 15 anos de , 16 anos de , 17. numerosos estudos sobre as linhagens de células RMS foram realizados empregando o ensaio de formação de tumorfera para a identificação de vias envolvidas no desenvolvimento tumoral e caracterização de marcadores associados a populações de alta autorenovação 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , a 21.
Entretanto, apesar do potencial do ensaio de formação da tumorfera para identificar as células de origem do RMS, um método confiável que pode ser empregado em células RMS primárias ainda não foi descrito. Neste contexto, um estudo recente de nosso grupo empregou um ensaio otimizado de formação de tumorfera para a identificação das células de origem do RMS em um modelo de rato de distrofia muscular de Duchenne (DMD)22. Vários tipos de células pré-tumorigênicas, isolados de tecidos musculares, são testados por sua capacidade de crescer em condições de baixo apego, permitindo a identificação de células-tronco musculares como células de origem para RMS em contextos distróficos. Descrito aqui é um protocolo reprodutível e confiável para o ensaio de formação de tumorfera (Figura 1), que tem sido empregado com sucesso para a identificação de populações de células extremamente raras que são responsáveis pelo desenvolvimento do mouse RMS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

O rhabdomyosarcoma (RMS) é o sarcoma macio o mais comum do tecido nas crianças. Embora esforços significativos permitiram a identificação de mutações comuns associadas ao RMS e permitiram a discriminação de diferentes subtipos de RMS, ainda existem grandes desafios para o desenvolvimento de novos tratamentos para melhorar ainda mais o prognóstico. Embora identificada pela expressão de marcadores miogênicos, ainda há controvérsia significativa sobre se o RMS tem origens miogênicas ou não miogênicas, já que a célula de origem ainda é pouco compreendida. No presente estudo, um método confiável é fornecido para o ensaio de tumorfera para o mouse RMS. O ensaio é baseado em propriedades funcionais de pilhas do tumor e permite a identificação de populações raras no tumor com funções tumorigênico. Também são descritos procedimentos para testar proteínas recombinantes, integrando protocolos de transfecção com o ensaio de tumorfera e avaliando genes candidatos envolvidos no desenvolvimento e crescimento tumoral. Descrito mais é um procedimento para a transplantação do aloenxerto de tumorspheres em ratos destinatários para validar a função tumorigênico in vivo. Globalmente, o método descrito permite a identificação e o teste confiáveis de populações tumorigênicas de RMS raras que podem ser aplicadas a RMS que surgem em diferentes contextos. Finalmente, o protocolo pode ser utilizado como plataforma para triagem de fármacos e desenvolvimento futuro da terapêutica.

Detecção de tumorspheres O isolamento celular foi otimizado para obter a máxima heterogeneidade das populações celulares presentes no tecido tumoral. Em primeiro lugar, uma vez que os tecidos isolados apresentavam áreas morfologicamente dissimilares, para aumentar as chances de isolar populações de células raras uniformes, a amostragem foi realizada a partir de múltiplas áreas do tumor (Figura 1a, primeiro painel à esquerda). S...

Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Este protocolo descreve um método reprodutível para a isolação de pilhas preliminares do rabdomiossarcoma do rato, da formação e do tratamento do tumorsphere, e da transplantação do aloenxerto que partem das culturas dos tumorspheres.

Derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Rabdomiossarcoma é uma forma rara de sarcomas de tecido mole caracterizada histologicamente pela morfologia tecidual e pela expressão de marcadores miogênicos. No entanto, dada a existência de diferentes subtipos desses tumores e a heterogeneidade dos estímulos que contribuem para sua formação, a identificação da célula de origem tem sido muito desafiadora. Aqui descrevemos métodos reprodutíveis e confiáveis para a identificação da célula de origem dos rabdomiossarcomas a partir da colheita recente de tecidos tumorais de camundongos e este ensaio é o ensaio de formação tumorais.As principais vantagens do ensaio de formação tumorais é que ele se baseia em propriedades celulares que são conhecidas por estarem presentes em células originárias de tumores e também pode ser usada para expansão e enriquecimento da população celular específica. Além disso, sua estrutura esferoide imita o ambiente tumoral, podendo ser usados como estudos de rastreamento de drogas. Este método tem o potencial de ser aplicado a outros tipos de tumores porque não requer conhecimento prévio de marcadores moleculares, mas pode exigir otimização das condições culturais.Tumores podem levar algum tempo para se formar, especialmente se tentar identificar uma população de células raras dentro do seu tumor. Assim, não é sugerido olhar para a sua placa de subcultura todos os dias, uma vez que pode afetar negativamente os resultados de seus experimentos. Comece aquecendo uma placa de 10 centímetros com cinco mililitros de mídia de isolamento em uma incubadora a 37 graus Celsius.Pesar de 500 a 1.000 miligramas do tecido tumoral e colocá-lo na placa. Leve a placa com o tecido tumoral para uma capa de cultura estéril e pique-a com uma lâmina de barbear. Para uma digestão ideal, certifique-se de que os tamanhos das peças picadas são uniformes.Transfira o tecido picado e a mídia de isolamento celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave a placa com mais quatro mililitros de mídia e adicione isso ao tubo. Adicione 700 unidades por mililitro de solução de colagenase ao tubo e incuba-o em um banho de água tremendo a 37 graus Celsius por 1 1/2 horas.Após a incubação, gire o tecido a 300 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Aspire o supernasce sem interromper a pelota, depois resuspenda a pelota em 10 mililitros de segunda solução de digestão e incubar no banho de água agitada por mais 30 minutos. Após a segunda digestão, pipete a suspensão celular para cima e para baixo e passe-a através de um filtro de nylon de 70 micrômetros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.Em seguida, lave o filtro com 10 mililitros de mídia de isolamento celular e gire o tecido a 300 vezes g por cinco minutos. Aspire o supernasal e resuspenda a pelota em 20 mililitros de mídia celular tumoral. Transfira a suspensão para uma placa de cultura de 15 centímetros e coloque as células em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, mude a mídia para remover detritos e células mortas que possam influenciar negativamente a sobrevivência celular. Neste ponto, avalie a confluência celular e permita que as células cresçam na incubadora até atingir 90% Monitorar as células todos os dias e mudar a mídia a cada dois dias. Para derivação tumorsphere, use células na Passagem P1 ou P2 para evitar a seleção celular através de múltiplas passagens.Lave o prato da célula com PBS e cubra-os com solução de desprendimento. Coloque-os na incubadora por cinco a 10 minutos e, em seguida, confirme o desprendimento olhando para a placa sob um microscópio de campo brilhante. Uma vez que as células se despeçam, adicione a mídia celular tumoral à placa e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga.Gire as células a 300 vezes g por cinco minutos, remova o supernaspe e resuspense as células na mídia tumorosa. Depois de reutilizar as células, conte-as usando azul Trypan e calcule a concentração celular. Emplaque o número adequado de células em uma placa de 96 poços de baixa fixação e coloque as células na incubadora até o final do experimento, tomando cuidado para não perturbar a placa a menos que reponha a mídia.Após a conclusão do experimento, identifique tumores manualmente sob um microscópio de campo brilhante ou usando o software Celigo. O número e o tamanho das tumores podem ser avaliados como resultado deste ensaio. Para preparar tumores para transplante de aoenxerto, recomponha todas as tumores obtidas a partir de um tipo ou tratamento celular específico.Centrifugar os tumores e remover cuidadosamente o supernascer com uma pipeta de um milímetro seguido de uma pipeta de 200 microliteres, em seguida, lavá-los com 10 mililitros de PBS estéril. Gire os tumores novamente e aspire o PBS. Adicione 500 microliters a um mililitro de solução de descolamento celular em cima da pelota tumorsphere e incuba as células em um banho de água tremendo a 37 graus Celsius.Verifique a progressão da digestão a cada 10 minutos. Todo o processo leva até 30 minutos. Se a digestão da tumorfera no banho de água agitada não for suficiente para obter uma solução unicelular, sugere-se uma interrupção mecânica através da tubulação para cima e para baixo.Note que depois de girar as tumorferas não formam uma pelota estável, por isso aspirar o supernante deve ser feito cuidadosamente com uma pipeta de um mililitro e pipetas de 200 microliteres. Uma vez que uma solução unicelular é obtida, adicione um volume de mídia celular tumoral e gire-a a 300 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Após essa centrifugação, todas as etapas subsequentes devem ser realizadas no gelo.Resuspend as células em mídia de células tumorais frias e conte células vivas usando a exclusão azul trypan. Determine o número adequado de células para o aoenerto e dilui-o em 50 microliters de mídia de células tumorais frias. Coloque uma ponta de pipeta na mídia celular tumoral fria para esfriá-la e, em seguida, use-a para pegar 50 microliters de solução ECM fria e adicioná-la ao tubo com células, certificando-se de não remover o tubo ECM do gelo durante este processo.Mantenha as células no gelo até o transplante e coloque uma seringa de insulina de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 29 no gelo. Depois de confirmar que o camundongo foi devidamente anestesiado, raspe o lado direito do animal, aspire a solução celular na seringa resfriada e injete as células subcutânea na área raspada. Se a injeção for realizada corretamente, uma colisão visível se formará sob a pele.Este protocolo pode ser usado para formar tumores de forma confiável para identificação de populações de células raras que são responsáveis pelo desenvolvimento de sarcoma de tecido mole. Uma parte fundamental deste ensaio é a discriminação entre tumores e aglomerados celulares, que apresentam diferenças morfológicas claras. Para determinar a concentração ideal na qual uma proteína de interesse desencadeia um efeito sobre as células tumorais, é necessário avaliar o nível de expressão dos alvos a jusante da proteína.Três dos genes testados mostraram uma resposta dependente de dose ao tratamento de proteína recombinante e um não. Para estabelecer um protocolo eficiente, foram analisados os efeitos da transfecção em células tumorais inerentes;duas quantidades diferentes de reagente foram testadas e a eficiência foi avaliada com um plasmídeo GFP-reporter. Quantidades menores de reagente resultaram em maior eficiência de transfecção.Um protocolo de duas etapas teve que ser implementado para realizar a transfecção em células em suspensão. A transfecção foi realizada em células aderentes e 24 horas depois foram separadas e emplacaram-se; após sete dias, tumores controlados estavam expressando GFP. Após a obtenção de tumores, tratados e transplantados é possível comparar o efeito desse tratamento diferente no crescimento do tumor in vivo.Esses métodos permitirão que os cientistas respondam às questões ainda permanentes da célula de origem dos rabdomiossarcomas e, ao mesmo tempo, estabelecem a base para a triagem de drogas.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

A partir de um produto natural para seu cluster de genes biossintéticos: Uma demonstração utilizando Polyketomycin de<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Genética

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...