Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Эта работа была поддержана Эллисон Медицинский фонд грант AG-NS-0843-11, и NIH Пилот грант в рамках NCI онкологический центр Поддержка Грант P30CA030199 в А.С.

Корпус, лечение и жертвоприношение мышей были выполнены в соответствии с утвержденным протоколом IACUC Института медицинского открытия Сэнфорда Бёрнхема.
1. Подготовка реагента
<ol><li>Подготовка 100 мл клеточной изоляции средств: F10 среды дополнены 10% лошади сыворотки (HS).</li>
	...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+liver+cancer+stem+cells.">Molecular biology of liver cancer stem cells.</a> Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).</li><li>Crous, A. M., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+stem+cells+and+low-intensity+laser+irradiation:+a+potential+future+therapy.">Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (5), 129 (2013).</li><li>Tomao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+molecular+profiles+of+ovarian+cancer:+an+update+on+cancer+stem+cells.">Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells.</a> Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).</li><li>Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+stem+cells:+new+insight+into+a+stubborn+disease.">Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease.</a> Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).</li><li>Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+prostate+cancer+stem+cells:+markers+and+methods.">Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorsphere+as+an+effective+in+vitro+platform+for+screening+anti-+cancer+stem+cell+drugs.">Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs.</a> Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).</li><li>Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+adult+and+pediatric+rhabdomyosarcoma+in+the+surveillance,+epidemiology+and+end+results+program.">Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).</li><li>Blum, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+transducer+YAP1+transforms+activated+satellite+cells+and+is+a+potent+effector+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+formation.">The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation.</a> Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).</li><li>Hatley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+rhabdomyosarcoma+originating+from+the+adipocyte+lineage.">A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage.</a> Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).</li><li>Drummond, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

Для изоляции и характеристики ТЦ из опухолевых неоднородных клеточных популяций применялись многочисленные методы: клоногенные анализы опухолей, изоляция FACS и анализ формирования опухолевой сферы. Клоногенный ассеия опухоли была впервые описана в 1971 году, используется для исследова...

Рак является неоднородным заболеванием; кроме того, один и тот же тип опухоли может представлять различные генетические мутации у разных пациентов, и в пределах пациента опухоль состоит из нескольких популяций клеток1. Гетерогения представляет собой проблему в выявлении клеток, ответственных за инициацию и распространение рака, но их характеристика имеет важное значение для развития эффективных методов лечения. Понятие опухолевых клеток( размножающихся (TPC), редкая популяция клеток, которые способствуют развитию опухоли, ранее широко рассмотрены2. Несмотря на то, что ТЦ характеризовались несколькими видами рака, выявление маркеров для их надежной изоляции остается проблемой для нескольких типов опухолей3,4,5,6 , 7 (г. , 8 , 9. Таким образом, метод, который не опирается на молекулярные маркеры, а скорее на функциональные свойства TPC (высокое самообновление и способность расти в условиях низкой привязанности), известный как анализ формирования опухолевой сферы, может быть широко применен для идентификация ТЦ от большинства опухолей. Важно отметить, что этот анализ также может быть использован для расширения ТЦ и, таким образом, непосредственно применяется к скринингу рака наркотиков и исследований по устойчивости к раку1,10.
Рабдомиосаркома (RMS) является редкой формой саркомы мягких тканей, наиболее распространенной у маленьких детей11. Althoug RMS может быть гистологически определены путем оценки экспрессии миогенных маркеров, RMS ячейки происхождения не была однозначно характеризуется из-за нескольких подтипов опухоли и высокой неоднородности стимулов развития опухоли. Действительно, недавние исследования вызвали значительную научную дискуссию о том, RMS имеет миогенное или немиогенное происхождение, предполагая, что RMS может вытекать из различных типов клеток в зависимости от контекста12,13, 14 Год , 15 лет , 16 Год , 17. Многочисленные исследования на линиях клетки RMS были выполнены используя ассецию образования tumorsphere для идентификации путей, участвующих в развитии опухоли и характеристики маркеров, связанных с высоко самообновляющимися популяциями 18 лет , 19 лет , 20 , 21.
Однако, несмотря на потенциал формирования опухолевой сферы для выявления RMS-клеток происхождения, надежный метод, который может быть использован на первичных клетках RMS еще не описан. В этом контексте, недавнее исследование от нашей группы использовали оптимизированные опухолевые формирования исследования для идентификации RMS клеток происхождения в мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) мыши модели22. Несколько типов предопухолевых клеток, изолированных от мышечных тканей, проверяются на их способность расти в условиях низкой привязанности, что позволяет идентифицировать мышечные стволовые клетки как клетки происхождения для RMS в дистрофических контекстах. Описанный здесь воспроизводимый и надежный протокол для оценки формирования опухоли(рисунок 1),который был успешно использован для идентификации крайне редких популяций клеток, которые отвечают за развитие мыши RMS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

Рабдомиосаркома (RMS) является наиболее распространенной саркомой мягких тканей у детей. Хотя значительные усилия позволили выявить общие мутации, связанные с RMS и позволили дискриминации различных подтипов RMS, основные проблемы по-прежнему существуют для разработки новых методов лечения для дальнейшего улучшения прогноза. Хотя определены выражения миогенных маркеров, по-прежнему значительные споры по поводу того, RMS имеет миогенное или немиогенное происхождение, как клетка происхождения по-прежнему плохо понимается. В настоящем исследовании, надежный метод предусмотрен для опухолевого исследования для мыши RMS. Ассеи основан на функциональных свойствах опухолевых клеток и позволяет выявлять редкие популяции в опухоли с опухолевыми функциями. Также описаны процедуры тестирования рекомбинантных белков, интеграция протоколов трансфекции с анализом опухолевой сферы и оценка генов-кандидатов, участвующих в развитии и росте опухоли. Описано далее процедура для аллотрансплантата трансплантации опухолевых сфер в реципиентных мышей для проверки опухолевой функции in vivo. В целом, описанный метод позволяет надежно идентифицировать и тестировать редкие опухолевые популяции RMS, которые могут быть применены к RMS, возникающим в различных контекстах. Наконец, протокол может быть использован в качестве платформы для скрининга лекарственных средств и дальнейшего развития терапии.

Обнаружение опухолевых сфер Клеточная изоляция была оптимизирована для получения максимальной неоднородности клеточных популяций, присутствующих в опухолевой ткани. Во-первых, так как изолированные ткани представлены морфологически непохожих областей, ...

Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Этот протокол описывает воспроизводимый метод для изоляции мышей рабдомиосаркомы первичных клеток, формирования опухолевой сферы и лечения, и аллотрансплантата трансплантации, начиная с опухолевых культур.

Опухолевая сфера произвлечения и лечения из первичных опухолевых клеток, изолированных от мыши Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Рабдомиосаркома является редкой формой сарком мягких тканей, характеризующейся гистологически морфологией тканей и экспрессией миогенных маркеров. Однако, учитывая существование различных подтипов этих опухолей и неоднородность стимулов, способствующих его образованию, идентификация клетки происхождения была очень сложной задачей. Здесь мы описываем воспроизводимые и надежные методы идентификации клетки происхождения рабдомиосарком, начиная со свежеурожайных опухолевых тканей мышей, и этот анализ является анализом формирования опухолевой системы.Основными преимуществами анализа формирования опухолевой системы является то, что она опирается на клеточные свойства, которые, как известно, присутствуют в опухолевых клетках, а также может быть использована для расширения и обогащения специфической клеточной популяции. Кроме того, его сфероидная структура имитирует опухоль окружающей среды, таким образом, они могут быть использованы в качестве наркотиков скрининга исследований. Этот метод имеет потенциал для применения к другим типа опухолей, поскольку он не требует предварительного знания молекулярных маркеров, но это может потребовать оптимизации культурных условий.Tumorsphere может занять некоторое время, чтобы сформировать, особенно при попытке определить редкую популяцию клеток в вашей опухоли. Таким образом, не предлагается смотреть на вашу субкультуру пластины каждый день, так как это может негативно повлиять на результаты ваших экспериментов. Начните с разогрева 10-сантиметровой пластины с пятью миллилитров изоляционных средств массовой информации в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию.Взвесь от 500 до 1000 миллиграммов опухолевой ткани и поместите ее в тарелку. Принесите пластину с опухолевой тканью в стерильный вытяжку культуры и фарш его с лезвием бритвы. Для оптимального пищеварения убедитесь, что размеры фарша являются однородными.Перенесите рубленую ткань и средства изоляции клеток в 15-миллилитровую центрифугу. Вымойте пластину еще четыре миллилитров средств массовой информации и добавить, что в трубку. Добавьте 700 единиц на миллилитр раствора коллагеназы в трубку и инкубировать его в трясущимся водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 1 1/2 часов.После инкубации, спина вниз ткани в 300 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант, не нарушая гранулы, а затем повторно гранулы в 10 миллилитров второго раствора пищеварения и инкубировать в тряске водяной бане в течение еще 30 минут. После второго пищеварения, пипетка подвески клетки вверх и вниз и передать его через 70-микрометровый нейлоновый фильтр на 50-миллилитровой центрифуги трубки.Затем промыть фильтр с 10 миллилитров клеточной изоляции средств массовой информации и спина вниз ткани в 300 раз г в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в 20 миллилитров опухолевых клеток. Перенесите подвеску на 15-сантиметровую культурную пластину и поместите клетки в инкубатор по Цельсию на 37 градусов по Цельсию на ночь.На следующий день, изменить средства массовой информации для удаления мусора и мертвых клеток, которые могут негативно повлиять на выживание клеток. На данный момент, оценить слияние клеток и позволить клеткам расти в инкубаторе, пока он не достигнет 90%Мониторинг клеток каждый день и изменить средства массовой информации каждые два дня. Для получения опухолевых культур используйте клетки в Passage P1 или P2, чтобы избежать отбора клеток через несколько проходов.Вымойте клеточное блюдо с PBS, а затем покрыть их раствором отряда. Поместите их в инкубатор на 5-10 минут, а затем подтвердите отрешенность, глядя на пластину под ярким микроскопом. После того, как клетки отсоединились, добавить опухолевые клетки к пластине и передать клеточной подвески в центрифугу трубки.Спин клетки вниз на 300 раз г в течение пяти минут, удалить супернатант, и повторного перерасхода клеток в опухолевой сети. После повторного перерасхода клеток, подсчитайте их с помощью Trypan blue и вычислите концентрацию клеток. Плита надлежащее количество клеток в 96-ну низкой крепления пластины и поместить клетки в инкубатор до конца эксперимента, заботясь, чтобы не беспокоить пластины, если пополнение средств массовой информации.После завершения эксперимента, определить tumorspheres вручную под ярким микроскопом или с помощью программного обеспечения Celigo. Количество и размер опухолевыхсфер могут быть оценены в результате этого анализа. Для подготовки опухолевыхсфер для трансплантации алотрансплантата, объединить все опухолевыесферы, полученные из определенного типа клеток или лечения.Центрифуга опухолевыхсфер и тщательно удалить супернатант с помощью одномиллиметровой пипетки следуют 200-микролитр пипетки, а затем мыть их с 10 миллилитров стерильных PBS. Спин tumorspheres вниз снова и аспирировать PBS. Добавьте 500 микролитров в один миллилитр клеточного раствора отряда поверх гранул опухолевой сферы и инкубировать клетки в тряске водяной бани при 37 градусах по Цельсию.Проверяйте прогрессирование пищеварения каждые 10 минут. Весь процесс занимает до 30 минут. Если переваривания опухолевой сферы в трясущимся водяной бане недостаточно для получения одноклеточного раствора, то предлагается механическое нарушение через трубы вверх и вниз.Отметим, что после вращения опухолевыхсфер не образуются стабильные гранулы, поэтому аспирировать супернатант следует осторожно с помощью одноми миллилитровой пипетки и 200-микролитровых пипеток. Как только одноклеточный раствор получен, добавьте объем средств массовой информации опухолевых клеток и вращайте его вниз при 300 раз g в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. После этой центрифугации все последующие шаги должны быть выполнены на льду.Resuspend клетки в холодных средствах клетки тумора и подсчитывают живые клетки используя исключение голубого Trypan. Определите правильное количество клеток для алотрансплантата и разбавьте его в 50 микролитров холодного опухолевых клеток. Поместите наконечник пипетки в холодных опухолевых клеточных сми, чтобы охладить его, а затем использовать его, чтобы взять 50 микролитров холодного раствора ECM и добавить его в трубку с клетками, убедившись, что не удалить трубку ECM из льда во время этого процесса.Поддерживайте клетки на льду до трансплантации и поместите на лед ограниченный 0,5-миллилитровый инсулиновый шприц с 29-го калибра иглы. После подтверждения того, что мышь была надлежащим образом анестезирована, побрить правую сторону животного, аспирировать клеточный раствор в охлажденный шприц, и вводить клетки подкожно в бритой области. Если инъекция выполняется правильно, под кожей сформируются видимые шишки.Этот протокол может быть использован для надежной формы опухолевыхсфер для идентификации редких популяций клеток, которые отвечают за развитие саркомы мягких тканей. Фундаментальной частью этого анализа является дискриминация между опухолевыми и клеточными кластерами, которые демонстрируют явные морфологические различия. Чтобы определить оптимальную концентрацию, при которой белок интереса вызывает воздействие на опухолевые клетки, необходимо оценить уровень экспрессии целей белка ниже по течению.Три из проверенных генов показали дозозависимый ответ на рекомбинантное лечение белка, а один нет. Для установления эффективного протокола были проанализированы эффекты трансфекции на врожденные опухолевые клетки; было протестировано два различных количества реагента и оценена эффективность с помощью плазмиды GFP-репортера. Снижение количества реагентов привело к повышению эффективности трансфекции.Для выполнения трансфекции на ячейках подвески должен был быть внедрен двухшаговой протокол. Трансфекция была проведена на адепт-клеток и 24 часов спустя они были отделены и потрошены в подвеске; после семи дней, контролируемые опухолевыесферы выражали GFP. После получения, лечения и трансплантации опухолей можно сравнить эффект этого различного лечения при росте опухоли in vivo.Эти методы позволят ученым ответить на все еще стоящие вопросы клетки происхождения рабдомиосарком и в то же время засовытить основу для скрининга наркотиков.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

Из натурального продукта до его биосинтетического кластера генов: демонстрация Использование Polyketomycin из<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Хроматин распространение препаратов для анализа прогрессирования ооцитов мыши от профаза до метафазы II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Поколение клоны клеток рака для визуализации Telomeric повтор содержащие РНК Терра выразил от одного теломер в живых клеток

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Протокол In Vitro для оценки уровней, функций и связанных с ними целевых генов в опухолевых клетках

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Использование мыши молочных опухолевых клеток в in vitro Вторжение анализа в качестве меры онкогенной клеточной поведения

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Протокол на основе FACS для изоляции РНК из вторичных клеток Дрозофилы Мужской Аксессуар Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...